Dzīvnieku šūnu diferenciācija

Dzīvnieku šūnu diferenciācija

“Homeobox” saturoši gēni:

Kodē transkripcijas faktorus.Proteīni satur domēnus, kas pievienojas pie DNS.Darbojas noteiktā embrija zonā, atbilstoši novietojumam hromosomā.

Augiem ir analoģiski gēni, satur MADS-box

Cilvēkam novietoti 4 hromosomās

Global Analysis of mRNA Localization Reveals a Prominent Role in Organizing Cellular Architecture and Function

Cell 134, 843–853, September 5, 2008

• Drozofilas embrionālā attīstība 4,5 stundas, stadijas 1-9.• mRNS FISH analīze, 25% Drozofilas genoma 3370 gēni

• mRNS FISH analīze, 25% Drozofilas genoma 3370 gēni

• 3214 gēni ekspresēti,

• 2198 nāk no mātšūnas,

• 504 ekspresēti zigotā,

• 388 ekspresēti zigotā un mātšūnās.

• Mātšūna dod 65% no zigotas mRNS!

71% no gēniem ir noteikta lokalizācija.

orb: posteriorā puse, 3 stadijā ap kodoliem gredzenveida novietojums.71% no gēniem ir noteikta lokalizācija.mRNS-zaļa, kodols – sarkans.

Virspuse, 3 stadija. cno novietots šūnu perifērijā, anillin novietots gredzenveidā pie kodoliem. mRNS-zaļa, kodols – sarkans.

Virspuse, 1-5 stadija. raps novietots pie centrosomām. mRNS-zaļa, kodols – sarkans.

mRNS un proteīnu kolokalizācija. Proteīni, kas nosaka šūnu dalīšanos.. mRNS-sarkana, proteīni - zaļi, kodols – zils.

Embrionālās attīstības ģenētiskā regulācija

Augļu mušiņas attīstības īpatnības

Augļu mušiņu olās gēnam bcd - “bicoid” - veidojas mRNS gradients. Ola saņem transkriptus no pavadītājšūnām. Transporta virziens un signāls RNS molekulas 3’ daļā nosaka augstu šo mRNS molekulu koncentrāciju anteriorajā daļā un zemu – pretējā pusē.

Augļu mušiņas attīstības īpatnības

Pēc apaugļošanās sākas translācija. Izveidotā olbaltumviela ir atbildīga par kāpura galvas veidošanos.

Savukārt olas pretējā pusē uzkrājas “nanos” olbaltumvielas, kuras ir atbildīgas par astes daļas veidošanos.

Augļu mušiņas attīstības īpatnības

Vairāki eksperimenti parāda šo RNS molekulu nozīmi.

No šūnas anteriorās daļas tika atdalīta citoplazma, kura saturēja daudz bcd mRNS. Tās vietā ievadīja ar “nanos” mRNS bagātu citoplazmu no citas šūnas. Rezultātā izveidojās kāpurs ar asti abos galos. Citā eksperimentā citoplazmu ar ‘nanos” mRNS aizvietoja ar “bcd” saturošu citoplazmu. Tika iegūts pretējs rezultāts – kāpurs ar galvām abos galos.

Izveidoja arī transgēnas mušas, kuru gēnam, kas kodēja “nanos”, tika pievienota 3’ galā anteriorā novietojuma signālsekvence no bcd gēna. Tas lika “nanos” mRNS molekulām novietoties pretējā – anteriorajā pusē.

Augļu mušiņas attīstības īpatnības

Normāls kāpurs.E.Teilor un R.Lehman.

Transgēns kāpurs.E.Teilor un R.Lehman.

Augļu mušiņas attīstības īpatnībasAbas olbaltumvielas darbojas kā transkripcijas faktori. Olbaltumviela “bicoid” ieslēdz gēnu “hunchback”, bet olbaltumviela “nanos” iepriekšminēto gēnu inaktivē. “Nanos” un “bicoid” darbības rezultātā izveidojas gēna “hunchback” gradients. Tas ekspresējas priekšējā daļā, bet tā ekspresija ir nomākta aizmugurē. Arī “hunchback” produkts ir transkripcijas faktors. Šo transkripcijas faktoru kombinācijas noteiktās embrija zonās regulē citu gēnu ieslēgšanos un izslēgšanos.

Augļu mušiņas attīstības īpatnībasGēns “pa pāriem trūkstošais” (“even-skipped” (eve)) tiek ekspresēts 7 no 14 augļu mušiņas segmentiem.

Eve gēna promoteram ir piesaistīšanās vietas olbaltumvielām, kuras kodē “bicoid” (bcd), “hunchback” (hb), “giant” (gt), “Krüppel” (Kr).

Gēna eve aktivācija tiek panākta ar “bicoid” un “hunchback” olbaltumvielu pievienošanu.

Gēna eve represēšana tiek panākta ar “giant” un “Krüppel” olbaltumvielu pievienošanu.

Attēls no: P.A. Lawrence and Blackwell Scientific Publications.

Proteīnu sadalījumam seko morfoloģijas maiņa. Krāsu robežas vietā veidojas rieva.http://www.princeton.edu/~wbialek/rome/lecture1.htm

Augļu mušiņas attīstības īpatnības

Vairākas vietas var kalpot gan transkripcijas faktoru, gan inhibēšanas faktoru pievienošanai. Tāpēc liela nozīme ir šo proteīnu koncentrācijām šūnā, jo tās nosaka, cik lielā mēra var ekspresēt eve gēnu.“Giant” un “Krüppel” augstā koncentrācija noved pie eve ekspresijas ierobežošanas un robežzonas izveidošanās. Trešajā joslā darbojas citi promotori, kas neļauj represēt šī gēna transkripciju. Tādējādi izveidojas regulējošu faktoru komplekss, kas rada atšķirības dažādu segmentu gēnu ekspresijā.

In vivo Imaging of oskar mRNA Transport Reveals the Mechanism of Posterior LocalizationCell 134, 843–853, September 5, 2008

Agrīnā embrionālā attīstībabicoid, oskar (osk), and gurken

•No 8-10 ovocīta atīstības stadijai osk mRNS pārvietojas no pavadītājšūnām (15 gab.) uz ovocīta posterioro daļu.

•Proteīns oskar veido granulas un nosaka vēdera dobuma un dzimumšūnu veidošanos.

•Pārvietošanos nosaka BicD, jo nodrošina saistību ar dineīnu un mikrocaurulītēm un pārvietošanos “-” gala virzienā.

9. ovocīta atīstības stadija. osk mRNS pārvietojies no pavadītājšūnām uz oocīta posterioro daļu.

9. ovocīta atīstības stadija. osk mRNS iezīmēta ar MS2-GFP. MS2-GFP satur kodola lokalizācijas signālu. Tāpēc redzams vai nu kodolos vai kolokalizēts ar osk.

Organismu diferenciācija

Šūnu diferenciācija ir apskatāma kā visa organisma ontoģenēzes daļa.

Sākotnējie impulsi nāk no gēniem, kas bija ekspresēti mātes organismā, t.i., mRNS, un olbaltumvielas, kas atradās jau neapaugļotā olšūnā.

Tālākie etapi ir atkarīgi no zigotas gēniem, bet vēlāk arī no kaimiņu šūnu mijiedarbības.

Organismu diferenciācija

Diferenciāciju var apskatīt, atbilstoši organisma un šūnu izmaiņām, embrionālās attīstības gaitā. Dzīvniekiem var izdalīt četras embrionālās attīstības stadijas:

• drostalošanās,

• formas veidošana,

• diferenciācija,

• augšana.

Drostalošanās

Zigotas mitoze un citokinēze veido daudz mazu šūnu. Katrai no tām ir genoms, kas ir identisks zigotas genomam. Drostalošanās beidzas ar blastulas (blastocistas) veidošanos. Šajā fāzē šūnas organizējas slāņos.

Formas veidošana

Formas veidošanas procesā parādās organisma priekšpuse un aizmugure (posteriorā un anteriorā puse), vēderpuse un mugurpuse (dorsālā un ventrālā puse), labā un kreisā puse.

Gastrulācijas gaitā izveidojas sekojoši cilmšūnu slāņi: ektoderma, mezoderma un endoderma. To veidošanos nosaka zigotas gēnu ekspresija.

Formas veidošanas stadijā nav redzamas morfoloģiskas atšķirības starp šūnām. Dažādām šūnu grupām atšķiras regulējošo olbaltumvielu veidi, kas noteiks tālāko šūnu attīstību.

Audu diferenciācija

Šajā etapā embrija šūnas diferencējas, t.i., veido daudzšūnu struktūras un iekššūnas struktūras, kas ir tipiskas pieaugušam organismam. Veidojas neironi, muskuļu šūnas, asins šūnas u.c. Tās apvienojas audos, audi – orgānos un orgāni – orgānu sistēmās.

Diferenciācija

Cilvēka embrionālā attīstība

Ektoderma – epidermālais epitēlijs, nervu audiEntoderma – entodermālais epitēlijsMezoderma – endotēlijs, balstaudi, saistaudi, asinis

Cilvēka embrionālā attīstība

Cilvēka embrionālā attīstība un audu veidošanās problēmas.

• Classic debates in all of developmental biology: where and when do endothelial cells (and hence blood vessels) arise in the developing embryo?

• Because blood vessels are first observed in the yolk sac in avian and mammalian embryos, it was initially assumed that all blood vessels arise from extraembryonic tissues.

• Histological analysis subsequently indicated that isolated foci of endothelial cells can also be observed in the embryo proper, which suggested that blood vessels

arise from an intraembryonic source (specifically, the mesoderm) rather than via colonization.

Ferguson, J.E. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005;25:2246-2254

Vasculogenic "hot-spots" in the mouse embryo. dpc, days post coitus; YS, yolk sac (orange); Al, allantois (purple); PPS, posterior primitive streak (green); PE, pro-epicardium (red); AGM, aorto-gonad-mesonephros region; PAS, para-aortic splanchnopleure. Ferguson, J.E. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005;25:2246-2254

Šūnu diferenciācija• Process, kurā embrionālās šūnas kļūst atšķirīgas

(atšķirīga morfoloģija un funkcijas).

• Saistīta ar dažādu šūnu tipu (audu) parādīšanos: muskuļaudi, ervaudi, taukaudi, segaudi.

• Saistīta ar noteikta nemainīga terminālā šūnu tipa izveidošanos. (morfoloģija un funkcijas nav pārejošas)Gēnu ekspresija izmainās un notieks specifisku proteīnu sintēze.

• Šūnai parādās specifisks olbaltumvielu profils. Pirmais šūnu diferenciācijas etaps ir tad, kad tiek noteikts šūnu attīstības virzienu grupa.

• Diferenciācija• Parāda in vivo raksturīgo fenotipu (šūnas morfoloģija)

• dažkārt reversabla

• pakāpeniska notikumu secība šūnu kultūrās nepieciešams inducēt.

• Adaptīva - var regulēt

• Terminālā diferenciācija - šūna pakāpeniski izmainās līdz izveidojas noteikts nemainīgs fenotips (neirons) var atrast marķierus (proteīnus), kas ir specifiski noteiktam šūnu tipam.

• Dediferenciācija• audzējot kultūrā izzūd šūnu tipam raksturīgais fenotips

Diferenciācija ir neatgriezeniska šūnu pārveidošanās no cilmšūnām par vienu noteiktu šūnu tipu.Iespējami divi gadījumi:

1. Audi, kuru šūnas bieži dalās (asinis, āda)

Totipotentas vai Pluripotentas cilmšūnas dalās (proliferācija) un sasniedz terminālas diferenciācijas gaitā noteiktu morfoloģiju ar noteiktām funkcijām un nespēj dalīties.

2. Audi, kuru šūnas selektīvi dalās (trauma)

Miera apstākļos audos nav novērojama šūnu proliferācija

Noteiktos apstākļos (ievainojuma gadījumā) šūnas zaudē specializāciju, atkārtoti ieiet dalīšanās ciklā un strauji dalās līdz sasniegts nepieciešamais šūnu skaits. Tad dalīšanās apstājas un atkal notiek diferenciācija.

Diferenciācija progresē vienā virzienā

• Ja šūna ir uzsākusi diferenciāciju vienā virzienā, tad tā nevar uzsākt diferenciāciju citā virzienā.

Leikocītu diferenciācija un eritrocītu diferenciācija

• Ja izmaiņas izdara pietiekami agrīnā etapā, tad iespējama diferenciācijas virziena maiņa.

• Izņēmums ir vēža šūnas

plaušu karcinomas šūnas izveido plakanā epitēlija karcinomas šūnas

grūti izsekot vēža šūna difernciācijas virzienam

Proliferācija un diferenciācija

• Aktīvas proliferācijas gadījumā ir neliela diferenciācija

• Neaktīvas proliferācijas gadījumā ir aktīva diferenciācija

• Vēžu šūnas ir izņēmums

Pluripontenta cilmšūna - var diferenciēties dažādos virzienos

Unipotenta cilmšūna - nodrošina viena veida šūnu līnijas pastāvēšanu

Dediferenciēta šūna - diferencēta šūna pārvēršas par nediferenciētu, atsāk proliferāciju, atsāk to pašu terminālo diferenciāciju – Jo precīzāku barotni izmanto, jo precīzāk var

kontrolēt šūnu proliferāciju un diferenciāciju

Diferenciācijas regulācija

Šķīstoši inducētāji• fizioloģiski

hormoni (hidrokortizons, glukogāns, tiroksīns)

interleikīns un interferons

Vitamīni (D)

Joni (Ca 2+)

• nefizioloģiski dimetilsulfoksīdi (DMSO)

citotoksiski savienojumi (mitomicīns C)

Šūnas-šūnas mijiedarbība homoloģiskas šūnas

• liels/mazs šūnu blīvums• spraugveida kontaktzonas un sekundārās

signālmolekulas (mesendžeri)

heteroloģiskas šūnas• starp šūnām kas radušās no viena veida

embrionālajiem audiem

Šūnas-matriksa mijiedarbība• šūnas sekretē un izveido ļoti specifisku matriksu• no matriksa veida ir atkarīga gēnu ekspresija šūnās• grūti izveidot mākslīgi tādu matriksu, kas izraisītu

vēlamās šūnu izmaiņas• ļoti liela atkarība no specifisku glikoproteīnu

struktūras

• matrikss izmaina dažādu augšanas faktoru aktivitāti

Šūnu forma un polaritāte• Šūnai nepieciešams uztvert virsmu kā bazālo vai

apikālo.• Ja kultūrā ir plakanas šūnas, tad tām jāpārvēršas

par kubiskām vai cilindriskām.• Dažiem receptoriem nepieciešams noteikts

novietojums.• Nepieciešamība pēc vielu sekrēcijas noteiktā

virzienā.

Diferenciācijas veicināšana šūnu kultūrā

• Nepieciešams pareizas izolācijas apstākļos atdalīts noteikts šūnu tips, kas atrodas atbilstošā vidē.

• Jāiegūst liels šūnu blīvums uz atbilstoša matriksa• Barotnes sastāvam jāstimulē diferenciācija vairāk

nekā proliferācija.• Atbilstoši diferenciāciju izraisoši aģenti• Jāpievieno tie šūnu tipi, kas veicina diferenciāciju.

(šūnas-šūnas mijiedarbība)• Laiks: inducētāji nepieciešami noteiktos

diferenciācijas etapos uz noteiktu laika periodu.

Šūnu diferenciācijas ģenētiskā regulācija

• Gēnu aktivitātes sistēmu diferencētā šūnā var noteikt divi faktori:

1) Ģenētiskā materiāla zudums.

2) Hromatīna modifikācijas.

3) Regulatorolbaltumvielas (transkripcijas faktori, u.c.)

Ģenētiskās regulācijas problēmas

Zigotas genoms satur visus gēnus, kas nepieciešami simtiem dažādu specializētu šūnu veidošanai, kas atradīsies dažādās organisma daļās. Visi šie gēni ietilpst divās grupās:

“housekeeping genes” – gēni, kas kodē RNS, kuru var izmantot visās šūnās, piemēram tRNS gēni, enzīmi glikolīzei, membrānu struktūrolbaltumvielas u.c.

• audu specifiski gēni – gēni, kas kodē mRNS, kuru izmanto dažos šūnu veidos, piemēram, hemoglobīna gēni, kuri ekspresējas tikai sarkano asins šūnu priekštečos u.c.

Diferencētas šūnas kodols var izraisīt olšūnas

diferenciāciju

Varžu (Xenopus) ādas šūnu, nieru šūnu, sirds šūnu, plaušu šūnu kodoli var ļaut šūnām diferencēties līdz pieaugušam organismam. Izdzīvo mazs organismu procents.

Blastulas šūnu pārstādīšanas gadījumā izdzīvo ievērojami lielāks organismu skaits un var izveidoties identisku organismu klons.

Tātad gēni attīstības laikā neizmainās.

Transplantētie gēni darbojas līdzīgi kā būtu darbojušies sākotnējie gēni.

Gēnu aktivitāti var izmainīt, ja sapludina ar citu šūnu

• Neaktīvi vistu eritrocīti (ar kodoliem) pēc sapludināšanas ar bezkodola cilvēka vēža šūnām noved pie vistu šūnu gēnu ekspresijas aktivācijas.

• Cilvēku šūnu sapludināšana ar žurku muskuļu šūnām aktivē cilvēku muskuļšunām raksturīgos gēnus.

• Tas rāda, ka citoplazmā ir ekspresiju aktivējoši faktori.

Diferenciācijas etapu var mainīt ar transdiferenciāciju

Reģenerācijas procesā radzenes šūnas var izveidoties no pigmentu saturošajām epitēlija šūnām vai dediferenciētām muskuļu šūnām.

• Gēnu ekspresija ir atkarīga no regulatorolbaltumvielām un DNS modifikācijām.

• Attīstībai svarīgu eikariotu gēni satur kompleksus kontroles reģionus. Tiem var pievienoties daudzi transkripcijas faktori. Lai gēni tiktu nepārtraukti ekspresēti, tiem visu laiku jāsatur abilstošie transkripcijas faktori.

• Mazās nekodējošās RNS (small non-coding (sncRNAs) – microRNAs (miRNAs) and rasiRNAs – mimicked by artificial siRNAs).

• Gēna produkts var pozitīvi regulēt tā ekspresiju.

• Selektorgēni saglabā aktivitāti visā attīstības laikā.

• DNS metilēšana modificē gēnu aktivitāti.

• DNS atrašanās heterohromatīna formā ilgstoši inaktivē gēnus. Piemēram, Barra ķermenītis (X hromosoma).

Ohtake, Y. et al. J Cell Sci 2006;119:3822-3832

Muskulis

Pluripotenta cilmšūna MioD grupas transkripcijas faktoriMuskuļšūnām tipiskugēnu aktivācija

Miocaurulītes

Steroīdie hormoni un augšanas faktori

Nervu caurulītes šūnas melanocīti glija skrimslis neirons virsnieru dziedzeršūnas

Epitēlijs kā diferenciācijas modelis

Šūnu diferenciācija sākas ar postmitotisku keratinocītu, bet beidzas ar nedzīvu šūnu.Diferenciācijā ir sekojoši etapi:•Aktīva keratīnu un citu struktūras proteīnu sintēze.•Goldži aparāta aktivēšanās un citu organellu zudums.•Šūnas saplacināšanās un samazināšanās.•Metabolisma specializācija.•Šūnas membrānas caurlaidības palielināšanās.•Dehidratācija.

Epitēlijs kā diferenciācijas modelis

•Bazālais slānis. Visas šūnas cilindriskas un ir piestiprinātas pie bazālās membrānas. Raksturīga aktīva mitotiskā dalīšanās.

•Dzeloņainais slānis. Sastāv no 5 - 10 šūnu slāņiem. Šūnas ir savienotas ar desmosomām un spraugveida kontaktzonām, raksturīga mitotiskā dalīšanās.

•Graudainais slānis. Sastāv no 3 - 4 plakanu šūnu slāņiem. To citoplazmā ir daudz bazofilas granulas. Dažkārt tās pārklāj kodolu.

•Spīdošais slānis. Veido dažas plakanu šūnu kārtas. Grūti izsšķirt robežas starp šūnām. Kodoli sadalījušies. Citoplazma bagāta ar keratīna priekštečiem.

•Raga slānis. Daudzas pārragotu zvīņveidu šūnu kārtas. Šūnas ir ragviela (keratīns) un gaisa pūslīši. Virsējās šūnas viegli atdalās.

ZebrafishBlastulas veidošanās procesā parādās apvalku veidojošās šūnas (EVL). Gastrulācijas laikā EVL epibolijas rezultātā pārklāj embriju. Epibolijas molekulārie regulācijas mehānismi ir neskaidri. Vēlāk EVL tiek aizvietotas ar šūnām, kas radušās no bazālajiem keratinocītiem. EpCAM darbojas kā šūnas- šūnas adhēziju nodrošinoša molekula, kooperējoties ar kadherīnu un nosaka epitēlija integritāti un regulē epitēlija morfoģenēzi. Mutantiem ir ādas veidošanās pataloģijas.

Brūnais krāsojums bazālie keratinocīti, iekrāsots p63. Sarkanā bulta – otolīts.

EVL – šūnas zaļas (GFP/citokeratīns), bazālo keratinocītu kodoli sarkani – imuno p63 krāsojums. C – EVL šūnas noapaļojušās, D,E – normāls bazālo šūnu novietojums.

EVL – šūnas zaļas (GFP/citokeratīns), bazālo keratinocītu kodoli sarkani – imuno p63 krāsojums. C – EVL šūnas noapaļojušās, D,E – normāls bazālo šūnu novietojums.Bazālo šūnu agregātu veidošanās, jo ir EpCAM mutācija EVL šūnās.

Bazālo keratinocītu kodoli sarkani – imuno p63 krāsojums. TUNEL krāsojums – zaļš. Bazālo šūnu agregātos vērojama aktīva apoptoze.

EVL šūnu bazālās daļas izaugumi un apikālās daļas kontaktzonu struktūra ir atšķirīga.

EVL šūnās ir vairāk blīvo kontaktzonu (tight junctions) veidojošo proteīnu, bet mazāk katenīna-kadherīna kompleksu veidojošās olbaltumvielas.