Estudio Virológico por PCR en tiempo real Diagnóstico Molecular de Herpes virus MSc. Mónica...

Estudio Virológico por Estudio Virológico por

PCR en tiempo realPCR en tiempo real

Diagnóstico Molecular de Herpes virus

MSc. Mónica Cappetta

Lab. Biología Molecular, AEPSM

• Los métodos moleculares han potenciado la capacidad de los

laboratorios de identificar y caracterizar los agentes infecciosos en

profundidad.

• Las aplicaciones incluyen:

detección cualitativa y cuantitativa

genotipado y detección de subtipos

testeo de resistencia molecular

• Cuando se aplican estas metodologías selectivamente en un

laboratorio se potencian los diagnósticos y el manejo clínico de los

pacientes.

Biología Molecular en la Clínica

Agentes Virales

Detección viral directa por amplificación de ác. nucleicos:

- Eliminación en algunos casos de la utilización de métodos indirectos.

- Eliminación del cultivo viral altamente complejo.

- Rápido diagnóstico de infecciones virales.

- Alta sensibilidad y especificidad

Familia Herpes virus

• Principal causa de enfermedad humana viral luego de la gripe.

• Infección – latencia – reactivación

• 25 tipos 8 infectan al hombre.

• Mayoría de población humana infectada; adultos en gral. con Ac para la mayoría de los herpes virus excepto HHV-8.

• Virus envueltos de ADN doble cadena.

• Se clasifican por su localización en el estado latente.

Propiedades de los virus Herpes humanos

Tipo Nombre Sub Familia Células blanco Latencia Transmisión

1 Herpes simplex-1 (HSV-1) Alfaherpesvirinae Mucoepitelio NeuronaContacto cercanoContacto sexualMadre-bebé

2 Herpes simplex-2 (HSV-2) Alfaherpesvirinae Mucoepitelio NeuronaContacto cercano Contacto sexualMadre-bebé

3 Varicella Zoster virus (VSV) Alfaherpesvirinae Mucoepitelio Neurona Contacto

4 Epstein-Barr Virus (EBV) Gamaherpesvirinae Linfocito B, epitelio Linfocito B Saliva, ruta

respiratoria

5 Cytomegalovirus (CMV) BetaherpesvirinaeEpitelio,

monocitos, linfocitos

Monocitos, linfocitos y otros

Secreciones, transfusión sangre, transplan-te, congenita

6 Herpes lymphotropic virus Betaherpesvirinae Linfocitos T y otros

Linfocitos T y otros

Contacto, ruta respiratoria

7 Human herpes virus-7 (HHV-7) Betaherpesvirinae Linfocitos T y

otrosLinfocitos T y

otros Desconocido

8 Human herpes virus-8 (HHV-8) Gamaherpesvirinae Cél. endoteliales Desconocido Intercambio de

fluido corporales?

Manifestaciones clínicas

HSV 1 y 2: Lesiones

VZV: varicela (niños) herpes zoster (adultos/react.)

EBV: Asintomático (niños) Mononucleosis (jóvenes/adultos)

CMV: asintomático

Encefalitis (HSV, VZV)

Neumonia (VZV)

Linfomas luego de transplantes o SIDA (EBV)

Infección congénita (VZV, CMV)

Retinitis, neumonia, esofagitis, encefalitis en inmunodeprimidos (CMV)

Complicaciones

Diagnóstico Molecular de Herpes virus

Encefalitis virales : estudio de LCR

Pacientes inmunodeprimidos

Herpes virus y encefalitis

Agente causal de infecciones SNC

(10% encefalitis virales)

70% tasa mortalidad

diagnóstico precoz - terapia antiviralmorbilidad/moratlidad 20%

en Uruguay: 9% encefalitis viral por HSV

Menos agresivo: Biopsia cerebro vs Punción LCR

Ejemplo Citomegalovirus:

• Las pruebas serológicas presentan un uso limitado:

- individuos con infección latente

- anticuerpos aparecen 2 semanas después de la infección aguda

• Se produce la enfermedad al reactivarse como resultado de

Inmunodepresión: ej transplantes, SIDA, etc.

• La detección del ADN del CMV en plasma permite detectar

esta reactivación.

• Seguimiento de respuesta al tratamiento: carga viral.

Reactivación en inmunodeprimidos

ADN

PCR

2do. round1er. round

2n copiasDNA

Productonested-PCR

Electroforesisen gel

LCROrinaPlasmaBiopsia

Diagnóstico por real time-PCR

Detección rápida.

Detección cualitativa y cuantitativa.

No requiere manipulación post-PCR.

Menor probabilidad de contaminación o errores

de manipulación.

• Detección cualitativa de familia Herpes virus en LCR por PCR en tiempo real:

- Entrega de resultados en unas horas

• Cuantificación de CMV y EBV por PCR en tiempo real:

- Seguimiento de pacientes con reactivación

- Evaluación de tratamientos

Implementación en el laboratorio

Detección cualitativa de familia Herpes por Real time

3 Reacciones de amplificación:

HSV / CMV

EBV / HHV-6

VZV

6 diagnósticos en la misma corrida de amplificación.

Detección por Sybergreen Tm específica

Utilización de Uraciloglicosilasa durante la implementación en el laboratorio del protocolo.

Multiplex

• La Tm depende de la secuencia del ADN, el largo del producto y el contenido de GC.

• La Tm puede variar para:

- Prod. de igual tamaño pero distinto contenido de GC

- Prod. de igual tamaño y %GC pero con una distribución

de GC diferente

- Productos que difieran en 1 o más bases.

Identificación de productos de PCR por perfiles de Curvas de Melting

Análisis:

Se monitorea la fluorescencia de la muestra mientras la T° aumenta.

Se grafica la d/dT de la Fluorescencia en función de la Temp (°C).

Análisis de Tm de los productos amplificados

EBVVZVHHV6

Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real

PCR

24-36 hrs

2-4 cicladores

Alta manipulación

Riesgo de contaminación

Utilización de Kit comercial

Costos más elevados

Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real

PCR

24-36 hrs

2-4 cicladores

Alta manipulación

Riesgo de contaminación

Áreas pre y post-amplificación físicamente separadas

Cabina de UV

Diagnóstico de Herpes virus: PCR vs PCR en tiempo real

PCR

24-36 hrs

2-4 cicladores

Alta manipulación

Riesgo de contaminación

PCR tiempo real

2-3 hrs

LightCycler

Poca manipulación

Riesgo de contaminación

Multiplex con Sybergreen

Menor costo que Kit comercial

MUCHAS GRACIAS !!