Biologia molecular

01/06/2016

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Técnicas de Biologia molecularNatalia Bernardi Videira

[email protected]

BG515 – Prof. Gonçalo

TÉCNICAS PARA ESTUDO DO DNA E RNA

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Gel de Agarose• Objetivo: visualização da presença ou ausência do DNA

• Princípio: Após aplicação de uma corrente elétrica, o DNA

(carga negativa) migra para o polo positivo.

• Através da comparação com um marcador de peso

molecular conhecido é possível comparar o tamanho do

DNA da amostra

Gel de Agarose

• Material:

– Gel de agarose (0,8 a 2%)

– Tampão TAE (tris-acetato-EDTA) ou TBE (tris-borato-EDTA)

– Intercalante de DNA para visualização (brometo de etídeo,

gel red)

– Marcador de peso molecular (DNA ladder)

– Amostra de DNA

• Aplicações:

– Visualização do tamanho do DNA

– Qualidade do DNA (x degradação)

– Permite extração do DNA após purificação do gel

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Southern Blotting

• Objetivo: detectar um

DNA específico em uma

mistura

• Princípio: uso de sondas

marcadas (de DNA ou

RNA, complementar a

sequencia de interesse)

que hibridizam com o

DNA de interesse

• Técnica desenvolvida

por Edwin Southern.

Southern Blotting

1) DNA é

fragmentado

E aplicado em gel

de eletroforese

2)DNA é

desnaturado

3,4,5,6) DNA é

transferido do

gel para

membrana

7)A membrana

Northern Blotting: Localização de RNA através de sondas

Western Blotting: Localização de proteínas através de anticorpos

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Enzimas de Restrição

Histórico:

• Werner Abner: descobriu a enzima de restrição (“tesouras

moleculares”)

Estudo com bacteriófagos → bactérias digeriam o DNA viral

• Hamilton Smith: Descreve mecanismo de ação das enzimas de

restrição

�O corte gera um par de extremidades coesivas idênticas e as

enzimas clivam as mesmas sequências em qualquer DNA

• Daniel Nathans: primeiro a mostrar

a aplicação tecnológica

Enzimas de restrição : são produzidas

naturalmente por bactérias como

mecanismo de defesa à infecção de DNA viral

Enzimas de Restrição• Objetivo: clivagem de uma região específica do DNA.

• Princípio: Reconhecem e fazem cortes bifilamentares na

ligação açúcar-fosfato das moléculas de DNA em

sequencias específicas.

• Sítio de restrição: 4 a 6pb – regiões palindrômicas

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Enzimas de Restrição

• Extremidades coesivas (Sticky-ends) ex: EcoRI, HindIII,

BamHI

• Extremidades cegas (Blunt-ends) Ex: NsbI, HaeIII, AluI.

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1982-56762009000200006

Vetores

Vetores: molécula de DNA usada como

veículo para transportar artificialmente

um material genético exógeno para

outra célula, onde ele pode ser replicado

e/ou expresso.

Um vetor contendo o inserto de DNA

exógeno é chamado DNA recombinante.

Um vetor contém:

- sítio múltiplo de Clonagem (com sítios

para várias enzimas de restrição),

- marcador de seleção- origem de replicação adequada

ao hospedeiro (célula que recebe o vetor)

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Exemplo de tipo de Vetor

Plasmídeos:

�Encontrados naturalmente em bactérias

�Pequena molécula de DNA circular dentro

da célula

�Se replica de forma independente.

�Fisicamente separada do DNA cromossomal

� Na natureza, os plasmídeos frequentemente carregam

informação adicional que pode beneficiar a sobrevivência

do organismo, por exemplo genes de resistência a

antibióticos.

Plasmídeos artificiais são usados na biologia molecular como vetores,

transportando sequências de DNA recombinante em organismos hospedeiros

Clonagem de DNA

Inserção de um fragmento de DNA em um vetor.

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Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

• Objetivo: amplificação do número de cópias do DNA em

bilhões de vezes

• Princípio: reação enzimática de polimerizaçãodo DNA in

vitro – utiliza DNA polimerase

• Material:

– Amostra de DNA

– DNA polymerase

– Primer Forward e Reverse

– Tampão da enzima

– MgCl2

– dNTP

Tempo

Temp (C)

Desnaturação

95°- 30s

Anelamento

55°- 1min

Extensão

72°- 1min

*Repete ciclo

35 vezes

Ciclo PCR


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• Aplicações:

– Diagnóstico de patógenos e doenças hereditárias

– Identificação de anormalidades cromossomais

– Identificação de mutações

– Mutagênese

– Clonagem de genes

– Sequenciamento

– Genotipagem


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• Limitações:

– Baixa sensibilidade

– Colorações não quantitativas

– Pobre discriminação entre o

tamanho dos produtos de

PCR

– Resultados não são expressos

em número


PCR Real Time

• Objetivo: método quantificativo baseado no PCR

• Princípio: análise da fase exponencial do PCR

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PCR Real Time

• Uso de sondas fluorescentes para quantificar o número de

cópias

PCR Real Time

• Aplicações

– Análise da expressão gênica

– Identificação de polimorfismos e mutações

– Quantificação da carga viral ou outras infecções

– Identificação de translocações genéticas (ex em leucemia

mielóide crônica)

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Produção de cDNAObjetivo: Como o RNA é muito instável, é

interessante produzir cDNA (DNA complementar) a

partir do mRNA

Princípio: Utiliza a enzima Transcriptase Reversa

que é capaz de realizar a síntese de DNA a partir

de um molde de RNA

Transcriptase Reversa: enzima encontrada nos vírus

de RNA (retrovírus). Quando o vírus infecta seu

hospedeiro ele utiliza a Transcriptase Reversa para

produzir cDNA a partir do seu material genético de RNA,

para depois integrar o cDNA no genoma do hospedeiro

Funciona como se fosse uma reação de PCR no

qual ocorre o anelamento do primer oligo-dT

(TTTTT) com o RNA e síntese do cDNA com a

Transcriptase Reversa, e depois a síntese da

segunda fita do DNA com a DNA polimerase

Sequenciamento de DNA

Objetivo: Obter a sequência de nucleotídeos de uma molécula de

DNA

Princípio: Síntese de cópia do DNA de interesse utilizando-se

nucleotídeos modificados

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Sequenciamento de Sanger� Desenvolvido na década de 1980

� Utiliza ddNTP (trifosfato de didesoxinucleotideo)

� Nucleotídeo modificado com capacidade de bloquear a síntese

contínua do DNA

� Não possui o grupo 3’-hidroxila, portanto a DNA polimerase não

consegue adicionar outro nucleotídeo após o ddNTP

� A reação de síntese da fita de DNA é interrompida quando a

polimerase adiciona o ddNTP

� São criadas fitas de DNA com diferentes tamanhos dependendo de

quando o ddNTP foi incorporado

� Essas fitas de DNA são aplicadas num gel de acrilamida e “correm”

de acordo com seu tamanho (da menor para a maior)

� O equipamento lê a fluorescência dos diferentes ddNTP e indica a

ordem em que eles foram incorporados

Sequenciamento de Sanger

Método inicial era manual

A reação era realizada em quatro tubos separados,

um para cada tipo de ddNTP (ddATP, ddTTP,

ddGTP, ddCTP)

O resultado era visto numa eletroforese em gel

GATC

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Sequenciamento de Sanger automatizado

Sequenciamento de nova geração

Também conhecido como: Next-generation sequencing (NGS),high-throughput sequencing.

Termo usado para descrever diferentes novas tecnologias de

sequenciamento:

� Illumina (Solexa) sequencing

� Roche 454 sequencing

� Ion torrent: Proton / PGM sequencing

� SOLiD sequencing

Essas técnicas novas permitem sequenciar DNA e RNA de

maneira muito mais rápida e barata, e revolucionaram o

estudo de genômica e biologia molecular.

� RNA – seq : sequenciamento de todo o mRNA transcrito na

célula naquele momento.

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Illumina

https://youtu.be/HMyCqWhwB8E

1) o DNA é fragmentado

2) o DNA é ligado a adaptadores

3) Através do adaptador, o DNA se liga na

placa

4) Através de um PCR de ponte, o número

de cópias do DNA de interesse é aumentado

5) Ocorre o sequenciamento do DNA de

interesse. A polimerização da fita é contínua

e o equipamento consegue ler a

fluorescência de cada base que é

adicionada

http://www.illumina.com/content/dam/illumina-

marketing/documents/products/illumina_sequencing_introduction.pdf

Exemplo

Produção de insulina humana em bactéria

Região Codante

Região não-codante

Extração RNA

Células beta

Do pâncreas

Síntese de

cDNA de

Todo mRNA

PCR do cDNA

Da insulina

Clonagem no vetor

Sequenciamento

do vetor

recombinante

Inserção do vetor

(transformação)

da bactéria

Expansão do

número de

bactérias

Produção de

insulina

Extração DNA

humanoX

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