View
242
Download
10
Category
Preview:
Citation preview
Genetica medica
ADI-1genetica online e clinica
barbara.pasini@unito.itDip. di Genetica Biologia e Biochimica
Genetica medica oncologica
ASO S. Giovanni Battista - Torino
IRCC - Candiolo
Le malattie genetiche :
Malattie causate in modo esclusivo o
parziale da un difetto del patrimonio
ereditario:• difetto nel numero o struttura dei cromosomi
-> malattie cromosomiche
• difetto nella struttura o funzione di un gene
-> malattie geniche (monogeniche)
(mutazioni del DNA nucleare e mitocondriale)
• coinvolgimento di una serie di geni localizzati in
una stessa regione genomica (riarrangiamento)
-> malattie genomiche
Le malattie genetiche :
• effetto di modificazioni chimiche e strutturali del
DNA in grado di alterare l’espressione di un gene o
di un gruppo di geni
-> malattie epigenetiche
(difetti di imprinting)
• effetto dell’interazione tra geni e ambiente
-> malattie multifattoriali o complesse
March 20, 2005
+ 179
March 24, 2004
+ 186
March 24, 2004March 20, 2005April 19, 2006
21/03/2005
44 Feocromocitoma 43Feocromocitoma 43
14 11
31Angioma 31 1
21
65 71
81 82
2
78
22
76Sede ignota 76
80
21/03/2005
48
18Feocromocitoma 13Feocromocitoma 13
13Feocromocitoma 13
46 1 2 1
74 35
51 53
77 73
Perché occuparci di questi casi da un punto di vista genetico ?
• tumori giovanili, multipli, bilaterali fanno sospettare una predisposizione
• i soggetti già malati potrebbero sviluppare altri tumori
• altri membri della famiglia potrebbero ammalarsi
• parenti sani ma preoccupati di potersi ammalare in futuro potrebbero non avere ereditato il difetto genetico
• la “causa” genetica (biochimica) di una malattia potrà in futuro essere corretta ?!
diagnosi
correttagestione clinica
identificazionedei portatori
identificazionedei non portatori
ricerca
Ricerca basata sul “sintomo”
Feocromocitoma famigliare
Feocromocitoma + angioma midollare• National Center for Biotechnology Information
NCBI : http://www.ncbi.nlm.nih.gov– Pubmed , OMIM– > VHL, RET, SDH-B, SDH-C, SDH-D
• Gene Test http://www.geneclinics.org/
– > Gene Review
• Cancer Prone Diseaseshttp://www.infobiogen.fr/services/chromcancer/
parathyroidhyperplasia
pheochromocytoma
medullarythyroid carcinoma
neuroendocrinepancreatic tumors
MEN2
pituitary adenomaduodenal gastrinomascarcinoids exc.
MEN1
retinal angiomasCNS haemangioblastomasrenal cell carcinomas
VHL
para-ganglioma
SDH genes
Predisposizioni ereditarie allo sviluppo delfeocromocitoma
e paragangliomi extra-surrenalici
Casi di feocromocitomaisolato , non-sindromico (surrenalico , extra-surrenalico)
– 11% VHL (per lo più mutazioni missenso)– 5% RET (per lo più mutazioni esoni 11 e 13)– 4.5% SDHB– 4% SDHD
Tot 24% (70% <10 yr, 51% < 20 yr; 39% < 30 yr, 27% < 40 yr, 18% < 50 yr)
(80% se multifocale)
21/03/2005
44 Feocromocitoma 43Feocromocitoma 43
14 11
31Angioma 31 1
21
65 71
81 82
2
78
22
76Sede ignota 76
80
Paziente di anni 43.- a 42 anni: feocromocitoma bilaterale- non altre manifestazioni cliniche di VHL(fondo oculare negativo,RM encefalo e midollo negativa,TC addome negativa)Genitori deceduti:- madre a 71 anni per emorragia cerebrale- padre a 65 anni per coma diabeticoUna sorella deceduta a 31 anniper complicanze post-operatorie di interventoneuro-chirurgico per “angioma midollare”.
Impostazione del test genetico
• Ricerca di mutazioni e delezioni gene VHL• Se negativo,
– analisi RET e SDH-B, SDH-C, SDH-D
Acquisizione della sequenza genomica del gene VHL
(Entrez Gene, Ensemble: www.ensembl.org)
- ricerca di mutazioni puntiformi: PCR e sequenza- ricerca di delezioni genomiche
Denaturazione 95°C
Appaiamento inneschi
Sintesi del DNA 72 °C (Taq polimerasi)
Ciclo 1 Appaiamentoinneschi
Ciclo 2
Sintesi del DNA
PCR
N° cicli
1
3
10
15
20
25
30
N° sequenze bersaglio
0
2
256
8192
262.144
8.388.608
268.435.456
PCR : Reazione a Catena della Polimerasi
Per l’analisi di una digestione con enzimi di restrizione tale da poter essere visibile in elettroforesi occorre ~1g di DNA. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.
In 1 g di DNA genomico, una copia singola di un esone (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.
Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 g in 25 cicli e 27 g in 30 cicli.
Sequenziamento del DNA (1):strutture dei nucleotidi
Sequenziamento del DNA (2): il metodo di Sanger
Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide
* Indica il primer (lungo 15 nucleotidi)** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddNTP in ciascuna provetta
Sequenziamento del DNA (3): il metodo di Sanger
pozzetti
autoradiogramma
Si legga la sequenza man mano sintetizzata dal basso verso l’ alto. Il nucleotide G è il più vicino al primer (estremità 5’) mentre il nucleotide T è all’estremità 3’.
361G>ACaso indice: sequenza “senso” (forward)
Caso indice: sequenza “anti-senso” (reverse)
541 CACAGCTACCGAGGTCACCTTTGGCTCTTCAGAGATGCAGGGACACACGATGGGCTTCTG110 -H--S--Y--R--G--H--L--W--L--F--R--D--A--G--T--H--D--G--L--L-
codifica mutazione c.365G>A (p.D121N)
GAT>AAT: Asp121AsnAcido Aspartico -> Asparaginaaa acido aa polare
DB SNPs:Segnalato in precedenza SNPD121G senza info
DB mutazioni:The Human Gene Mutation Database : http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html-> report 1994 D121G in un paz. con feocromocitoma
COOH |
2HN -- CH |
CH2 |
COOH
COOH |
2HN -- CH |
CH2 |
CO--NH2
VHL proteinbeta-domain7 stranded sandwich:aa 63-154(HIF1 binding: aa 67-117)H4: aa 193-204
polar interfacebetween and domains
Linker: aa 154-156
alpha-domainaa 155-192H1 – H2 – H3
Linker: aa 189-194
Stebbins CE et al Science 1999
VHL – interface
Stebbins CE et al Science 1999
Polar interface between alpha and beta domainHydrogen bonds involving: amino acids: H3 Asp187, Leu188H1 Glu160, Arg161, Gln164, Arg167 amino acids:L6 Asp121, Thr124, Asp126L2 Arg82
21/03/2005
48
18Feocromocitoma 13Feocromocitoma 13
13Feocromocitoma 13
46 1 2 1
74 35
51 53
77 73
Feocromocitoma non sindromico giovanile in due fratelli
Programma:- ricerca di mutazioni RET e SDH- se negativo: analisi VHL
21/03/2005
50 Feocromocitoma 49Feocromocitoma 50Angiomi retinici 50
20 Feocromocitoma 13Feocromocitoma 13
15 Feocromocitoma 13
48 1 2 1
74 35
5355
79 73
21/03/2005
48
18Feocromocitoma 13Feocromocitoma 13
13Feocromocitoma 13
46 1 2 1
74 35
51 53
77 73
467A>CCaso indice
Madre
661 AATATCACACTGCCAGTGTATACTCTGAAAGAGCGATGCCTCCAGGTTGTCCGGAGCCTA150 -N--I--T--L--P--V--Y--T--L--K--E--R--C--L--Q--V--V--R--S--L-
DB SNPs:NON segnalati SNPs in 156
DB mutazioni:The Human Gene Mutation Database : http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html-> 3 report anche recenti di mutazioni: Y156D, Y156N, Y156C
codifica mutazione c.467A>C (p.Y156S)
TAT>TCT: Tyr156SerTirosina -> Serinaaa idrofobico aromatico aa polare “sottile”polare COOH
|
2HN -- CH |
CH2--OH
COOH |
2HN -- CH |
CH2 |
|
OH
VHL - Elongin C interface
Most relevant contact: Leu158 – Cys162 – Arg161Hydrogen bonds: Arg82 – Arg161 – Lys159
Stebbins CE et al Science 1999
Effetto delle mutazioni missenso
• cambiamento aminoacidico +- conservativo• frequenza nella popolazione generale• segregazione nell’ambito della famiglia• effetto prevedibile sulla struttura/funzione
della proteina (modeling)• conservazione nell’evoluzione• test funzionale (ev. second hit)
SIFTSorting Intollerant From Tollerant
http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html
D121N con nematodi 0.13senza nematodi 0.00
Y156S con nematodi 0.26senza nematodi 0.22
Y156D con nematodi 0.13senza nematodi 0.11
Y156N con nematodi 0.20senza nematodi 0.17
Y156C con nematodi 0.11senza nematodi 0.09
Geni RECESSIVI
entrambi gli alleli inattivati :
• delezioni o riarrangiamenti
cromosomici• mutazioni puntiformi• iper - metilazione
2 mutazioni somatiche tumore sporadico1 costituzionale + 1 somatica tumore ereditario
Inattivazione di geni onco - soppressori :perdita di funzione
Gene onco-soppressore Rb
18/04/2004
Rb
18/04/2004
Rb
Rb Rb
Rb
Alleli Rb normalimutazione somatica
mutazione somatica
Retinoblastoma unicomono-laterale
Mutazione germinale
mutazione somatica
Retinoblastomi multipli bilaterali ad insorgenza precoce
Inattivazione di geni onco - soppressoricon perdita di eterozigosità (LOH)
Prima mutazione:puntiforme
seconda mutazione:delezione
Allele
158
Allele
236
Allele
158
Allele
236
Allele
8
Allele
236
Inattivazione di geni onco - soppressoricon perdita di eterozigosità (LOH)
Allele3158
Allele3236
Allele
8
Allele3236
Loci studiati: 1 2 3 4Caso 1 ni - - +Caso 2 + - - +Caso 3 + + - ni
Allele1468
Allele3236
Allele1
8
Allele3236
Allele5346
Allele3236
Allele53
Allele3236
Sede del gene onco-soppressore
Tessutosano
Tessutotumorale
Recommended