Génterápia

GénterápiaGénterápiaA páciens sejtjeinek genetikai módosításán alapuló terápia.

- klasszikus: a célsejtekbe juttatjuk a gént és expressziót idézünk elô:

így pótoljuk a hiányzó aktivitást, <---<---

szelektíven megöljük a target sejtet,

mozgósítjuk az immun-rendszert.

- nem-klasszikus: az adott gén expressziójának gátlása,

a mutáció “kijavítása“

Csak szomatikus génterápia végezhető!

(27)(86)

Genetic diseases:

Type 1: Egy defektív lokusz (gene), mely a betegség okozója, 100% örökletes.

példa: Sickle cell anemia, HypercholesterolemiaCystic fibrosis

Type 2: Több génes, <100% örökletes, és a betegség megjelenését a környezet és az életstílus befolyásolja.

példa : Heart diseaseCancerDiabetesAlcoholismSchizophreniaCriminal behavior?etc….?

A génterápiát befolyásoló A génterápiát befolyásoló tényezőktényezők optimális optimális kedvezőtlenkedvezőtlenÖröklődés módja Öröklődés módja recesszívrecesszív

dominánsdomináns

Mutáció Mutáció funkció hiány túltermelésfunkció hiány túltermelés

Tárgysejtek Tárgysejtek könnyű rossz (agy).könnyű rossz (agy).

elérhetősége elérhetősége ex vivó in vivó ex vivó in vivó esetlegesetleg

A DNS mérete A DNS mérete kicsi óriáskicsi óriás

A génexpresszió A génexpresszió kevéssé szigorú kevéssé szigorú kontrolkontrol

szabályozása szabályozása szabályozottszabályozott

- klasszikus: a célsejtekbe juttatjuk a gént és expressziót idézünk elô:így pótoljuk a hiányzó aktivitást, <---<---szelektíven megöljük a target sejtet,mozgósítjuk az immun-rendszert.

- klasszikus: a célsejtekbe juttatjuk a gént és expressziót idézünk elô:így pótoljuk a hiányzó aktivitást, szelektíven megöljük a target sejtet,mozgósítjuk az immun-rendszert.

- nem-klasszikus: az adott gén expressziójának gátlása,a mutáció “kijavítása“

Ex vivó Ex vivó GénterápiaGénterápia

Gattinoni, et al, Nature Reviews in Immunology 6:383 (2006)

Dramatic regression of metastatic melanoma sometimes results from adoptive transfer of expanded TIL

In vivó terápiás génbevitelIn vivó terápiás génbevitel

Génterápia Génterápia tumorok kezeléséretumorok kezelésére

Vírus vektor – TNF gén sugárzás érzékeny promoter

Az ideális vektor jellemzői:

1. Csak a célsejtbe jusson be.2. Nagy inzert, egy vagy több gén beépíthető.3. Ne váltson ki immunválaszt.4. Stabil legyen, ne mutáljon el.5. Könnyű legyen nagy mennyiségben(titer)

gyártani.6. A hatáshoz elegendő mennyiségű fehérjét

termeljen.

A leggyakrabban használt vektorok

Retrovirus Adenovirus Adeno- Naked DNA/associated Liposomes

Insert size 8kb ~30kb 4kb unlimitedIntegration yes no rare rareProduction >106cfu/ml >1011 >1012 unlimitedAdministration ex vivo ex/in vivo ex/in vivo ex/in vivoExpression long transient pot. good? TransientExpress level moderate high moderate highImmune few extensive ?? NoneSafety concerns: Insertional Inflammatory Inflammatory none?

mutagenesis response response toxic

(25%) (25%) (3%) (25%)(*2006)

Génterápiában alkalmazott vektorok viselkedése

Retrovirus life cycle

From: Alberts et al. Molecular Biology of the Cell

Retrovirus genome

5’ LTR Packaging Gene X Neor 3’ LTR

Encapsidation(packaging)

Retrovirus vector construction for gene therapy

5’ LTR Packaging Gene X Neor 3’ LTR

Retrovirus vector packaging for gene therapy

Packaging cell line express viral gag and pol Produce high titer recombinant virus in 24-72 hours.

Packaging cell line

(makes virus)1. + Vector (transfection)

2. Collect virus after 24-72 hrs.3. Concentrate virus / high titer. 4. Transduce host cell.

Nem virális DNS bejuttatás:

1. Cationic liposomes: Positively charged lipids interact with negatively charged DNA. (lipid-DNA complex).

-Transverses cell membranesAdvantages:

a. Stable complexb. Can carry large sized DNA c. Can target to specific cellsd. Does not induce immunological reactions.

Disadvantages:a. Low transfection efficiencyb. Transient expressionc. Inhibited by serumd. Some cell toxicity

Génbevitel liposzóma segítségével

Nem virális DNS bejuttatás

2. Plasmid DNS injektálás

cDNAPromoter + gene of interest (P) (gene X)

P

Gene X

Megfigyelt expresszió tímusz, váz és szív izom, bőr.

Egy gén expressziójának Egy gén expressziójának csökkentésecsökkentése

- Decrease expression-Ribozyme

aaaaa--------auucg--------ccguuua--------uaagc--ggcaaau----

cDNA

ribozyme

Cleavage of the target mRNA

- Decrease expression -Antisense

aaaaa----------------caaucggccccuucguuua----gttagccggggaagcaaat

1- Small single-strand DNA oligonucleotides (15 -25 bases)

RNAse degradation of the RNA/DNA double strand molecule

ADA/génterápiaADA/génterápia

Ashanti de Silva: az elsô páciens, aki génterápiás kezelésben részesült (1990-ben).Adenosin dezamináz-hiány (ADA) a T-sejtekmûködési zavarát idézi elô -> immunhiány.Ex vivo génterápiával a T-lifocitákat ADA cDNS-t tartalmazó retrovirussal fertôzték, majd a páciensbe visszajuttatták. Párhuzamosanenzim-szubsztituciós terápiát is alkalmaztak.

A génterápia első A génterápia első áldozataáldozata

Jesse Gelsinger (18 éves)

Case study: Jesse Gelsinger

*First documented patient to die from gene therapy treatment. (may have been others).

Disease: liver enzyme deficiency (ornithine transcarbamylase, OTC) –

controls ammonia metabolism

Vector used to deliver OTC – modified adenovirus

Goal: deliver vector to liver cells and express OTC.

Problem: Very low transfer efficiency (1%), difficult to getenough functioning OTC expressed to do any good.

Solution: Infect with higher dose of viral particles. (38 trillion)

Outcome:

-Vector not only delivered gene to liver but to other tissue.-Triggered systemic inflammatory response.-Patient acquired fever, coma, death.

Why?

-Animal studies suggested dose was OK (?).-Adenoviral vectors known to induce inflammatory response.-Patient already compromised:

Patient had higher than allowed ammonia levels.

Results of follow-up investigation:

-3 month investigation by FDA concluded.- patient enrollment in study despite ineligibility.- participants misled on safety and toxicity issues.- loosening of criteria for accepting volunteers.- informed consent document did not reveal results

of animal studies.

* Other investigators may not have disclosed importantinformation on patient deaths in gene therapy trials.

•Adenovirus safety: Engineered to prevent viral replication.•Mutation from replication incompetent to competent?

•Shut down of Univ. of Penn. Institute for Human Gene Therapy•Lawsuits

Antitestek használata Antitestek használata vizsgálati és terápiás vizsgálati és terápiás célokracélokra

Source: CDC

Vaccines have dramatically reduced infectious disease incidence

Mechanism: Vaccines stimulate specific antibody production, blocking infection at an early stage

Chimeric mAbChimeric mAb

Chimeric mAbChimeric mAb

99mTc-mAb

in vitro in vivo

Tumor diagnosis

Sharkey, RM and Goldenberg, DM CA Cancer J Clin. 56::226 (2006)

Enhancing antibody cytotoxicity for cancer therapy

Scallon BJ, et al J Immunother 29:351 (2006)

Oncology Antibodies approved by the US FDA

Epitopes

Immune ResponseAntibodies

A mixture of antibodies - all bind to epitopes of the original antigen. Some bind with higher affinity than others.

Polyclonal antibodies

Protein

Immunize

B

B

B

B

Kuby Figure 4-22

Antibodies can be “humanized” to avoid host immune responses

Chimeric mAbChimeric mAb

Chimeric mAbChimeric mAb

FÁG DISPLAYFÁG DISPLAY