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INTRODUZIONE DEL MONITORAGGIO IMMUNOLOGICO
CMV-SPECIFICO NEI PAZIENTI TRAPIANTATI
Studente:
Dott.ssa Daniela Nozzi
Relatore: Prof. Fausto Baldanti
Correlatore: Dott.ssa Irene Cassaniti
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PAVIA
Dipartimento di Scienze Clinico Chirurgiche, Diagnostiche e Pediatriche
Master di II livello
in Diagnostica Microbiologica Avanzata
TRAPIANTO
• Infezioni veicolate durante l’allotrapianto
• Infezioni polmonari • Infezioni in tessuti
devitalizzati, o da raccolte di liquidi non drenati
• Infezioni da patogeni nosocomiali
• Infezioni veicolate durante l’allotrapianto
• Infezioni polmonari • Infezioni in tessuti
devitalizzati, o da raccolte di liquidi non drenati
• Infezioni da patogeni nosocomiali
PERIODO DI MAGGIORE IMMUNOSOPPRESSIONE
TIMELINE DELLE INFEZIONI POST-TRAPIANTO DI ORGANO SOLIDO
• Infezioni residue del primo mese• Infezioni da virus immunomodulanti • Infezioni opportunistiche
• Infezioni residue del primo mese• Infezioni da virus immunomodulanti • Infezioni opportunistiche
Infezioni comuni o rare: • acquisite in comunità• opportunistiche • virali croniche
Infezioni comuni o rare: • acquisite in comunità• opportunistiche • virali croniche
<4 SETTIMANE 1-6 MESI DA 6 MESI a 1 ANNO
IMMUNOSOPPRESSIONE COMPLESSIVA VARIABILE
INTRODUZIONE
INFEZIONE DA CITOMEGALOVIRUS NEI TRAPIANTATI DI ORGANO SOLIDO (OS)
• Principale e grave complicazione nei trapiantati di OS
• Elevato rischio di compromissione d’organo
• Episodi di rigetto e fallimento del trapianto
• Elevata morbidità e mortalità
Risposta Immunitaria:
• Attivazione RI innata e adattativa
• Ruolo centrale dell’immunità
adattativa cellulo-mediata CMV-
specifica (linfociti T CD4+ e
linfociti T CD8+) nel controllo
della replicazione virale-CMV
Fattori di rischio:
• Tipo di organo solido trapiantato
• Sierostato-CMV D/R
• D+/R- maggiore rischio
• Alto grado mismatch HLA D/R
• Regime di immunosoppressione
• Co-infezione con HHV6 o HHV7
PROFILASSI UNIVERSALE
STRATEGIA PREEMPTIVE
MANAGEMENT
Antivirale subito dopo il trapianto (per 3-6 mesi) in tutti i pazienti o in un gruppo di pazienti considerati a rischio
Antivirale subito dopo il trapianto (per 3-6 mesi) in tutti i pazienti o in un gruppo di pazienti considerati a rischio
Terapia antivirale solo in pazienti in cui la CMV DNAemia supera un certo valore di cut-off
Terapia antivirale solo in pazienti in cui la CMV DNAemia supera un certo valore di cut-off
CLINICO DI LABORATORIO
SIEROLOGIA: stratificazione del rischio
D-R- D-R+ D+R+ D+R-
Rischio minore Rischio maggiore
QNAT(Quantitative Nucleic Acid Amplification Testing)
MONITORAGGIO IMMUNOLOGICO della risposta cellulo-mediata CMV-specifica
PRE-TRAPIANTO
POST-TRAPIANTO
SCOPO
PROPORRE UNA METODOLOGIA PER
IL MONITORAGGIO IMMUNOLOGICO CMV-SPECIFICO
NEL PAZIENTE TRAPIANTATO DI ORGANO SOLIDO
SCHEMA OPERATIVO
VALUTAZIONE METODICHE: ricerca bibliografica
1. Principio del saggio2. Prestazioni: sensibilità, specificità,
riproducibilità, risposta funzionale e/o fenotipica, restrizione HLA
3. Procedimento operativo: fattibilità, tempi, materiale
4. Vantaggi5. Svantaggi
1. Principio del saggio2. Prestazioni: sensibilità, specificità,
riproducibilità, risposta funzionale e/o fenotipica, restrizione HLA
3. Procedimento operativo: fattibilità, tempi, materiale
4. Vantaggi5. Svantaggi
METODO IDEALE
1. Riflette la situazione di rischio o malattia da CMV
2. Informazione utile per la scelta clinica e facile da interpretare
3. Informazioni qualitative e funzionali delle cellule T CD4+ e TCD8+ CMV-specifiche
4. Affidabile, sensibile, specifico5. Altamente riproducibile6. Risultati in breve tempo7. Poco costoso8. Adatto a strumentazioni disponibili9. Campioni facilmente reperibili e
trasportabili
1. Riflette la situazione di rischio o malattia da CMV
2. Informazione utile per la scelta clinica e facile da interpretare
3. Informazioni qualitative e funzionali delle cellule T CD4+ e TCD8+ CMV-specifiche
4. Affidabile, sensibile, specifico5. Altamente riproducibile6. Risultati in breve tempo7. Poco costoso8. Adatto a strumentazioni disponibili9. Campioni facilmente reperibili e
trasportabili
IMPLEMENTAZIONE NELLA PRATICA CLINICA DEI TRAPIANTATI DI OS
SCELTA DEL SAGGIO
Valutazione dell’applicabilitàValutazione dell’applicabilità
SOLUZIONI PROPOSTE
MONITORAGGIO IMMUNOLOGICO
APPROCCI NON VIRUS SPECIFICI
CONTA DEI LINFOCITI T CON
CITOMETRIA A FLUSSO STANDARD
IMMUKNOW ASSAY
APPROCCI VIRUS SPECIFICI
COLORAZIONE INTRACELLULARE DELLE
CITOCHINE
COLORAZIONE DEL TETRAMERO pMHC
QUANTIFERON-CMV
ELISPOT IFN-γ
QUANTIFERON-CMV ASSAY
COLORAZIONE INTRACELLULARE DELLE CITOCHINE COLORAZIONE DEL TETRAMERO
ELISPOT INF-γAPPROCCI
VIRUS-SPECIFICI
QUALE SCEGLIERE?
COLORAZIONEINTRACELLULARE DELLE
CITOCHINE
COLORAZIONE DEL TETRAMERO
QUANTIFERON-CMV ELISPOT IFN-γ
MATERIALE Sangue intero, PBMCs PBMCs Sangue intero PBMCs
TEMPO 8-24 h 2-3 h 24 h 48 h
ANTIGENE Peptidi, proteine, lisati Peptidi 22 peptidi CMV Peptidi, proteine, lisati
RISULTATO % cell T, cell T /µl sangue % cell T epitopo-specifiche IFN-γ IU/mlUnità formanti spot per numero
di input PBMCs
FUNZIONE CELLULARE Si No Si Si
FENOTIPO CELLULARE Si Si No No
VANTAGGI
• Parametri fenotipici e funzionali
• Analisi simultanea linfociti T CD4+ e linfociti T CD8+ specifici-CMV
• Nessuna restrizione MHC/peptide
• No stimolazione in vitro
• Elevata sensibilità• Risultati rapidi• Piccola quantità di
sangue intero
• Facile da eseguire• Saggio standardizzato• Controllo positivo• Controllo negativo• Forniti i valori di cut-off
• Funzione cell T• Semplice, elevata sensibilità• Elevata riproducibilità• Nessuna restrizione
HLA/peptide• Ridotto numero di cell iniziali
SVANTAGGI
• Laborioso• Richiede citofluorimetro e
personale specializzato• Dipendente dalla
stimolazione in vitro• Elevato segnale di
background
• Specificità ristretta al singolo epitopo
• Conoscenza HLA del pz e peptide
• Impiegato per un numero ridotto di HLA
• Nessuna informazione sulla funzione cell T
• Nessuna misurazione quantitativa cell T
• Limitato alla risposta cell T CD8+
• Limitato a individui con HLA più diffusi
• Non differenzia tra cell T CD8+ e cell T CD4+
• Analisi rivolta alla citochina selezionata (IFN-γ)
• Dipende dalla stimolazione in vitro
SiSi
PBMCs di 5 pazienti stimolati con 8 Ag-CMV (Augustine JJ, 2012)
Calarota SA,2013
SEPARAZIONE PBMCs ELISPOT IFN-γ
LETTURA E NORMALIZZAZIONE DEI RISULTATI
METODICA ELISPOT IFN-γ
ELISPOT NORMALIZZATO:
CELLULE T CD4+ IFN-γ CMV specifiche/µl
CELLULE T CD8+ IFN-γ CMV specifiche/µl
ELISPOT NORMALIZZATO:
CELLULE T CD4+ IFN-γ CMV specifiche/µl
CELLULE T CD8+ IFN-γ CMV specifiche/µl
METODICA ELISPOT IFN-γprospettive per i pazienti trapiantati di organo solido
Metodica innovativa nell’immunologia virale
Elevate potenzialità nel monitoraggio dei pazienti trapiantati
Fornisce informazioni utili per la gestione del paziente
Monitoraggio pre-trapianto: «stratificazione del rischio» nei riceventi : valutazione management clinico
Monitoraggio post-trapianto: predizione del rischio di viremia-CMV : strategia preemptive
Metodica innovativa nell’immunologia virale
Elevate potenzialità nel monitoraggio dei pazienti trapiantati
Fornisce informazioni utili per la gestione del paziente
Monitoraggio pre-trapianto: «stratificazione del rischio» nei riceventi : valutazione management clinico
Monitoraggio post-trapianto: predizione del rischio di viremia-CMV : strategia preemptive
Ringraziamenti
• Prof. Fausto Baldanti
• Dott.ssa Cassaniti Irene
• Dott.ssa Comolli Giuditta
• Dott.ssa Prestia Martina
• Adzazehoun Guy
• Garbagnoli Gabriella
• Landini Viviana
Laboratorio di Immunologia Virologica, IRCCS Policlinico San Matteo (Pavia)
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