View
2
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
KRISTINA PALIULIONYTĖ
KASOS VĖŽINIŲ LĄSTELIŲ ENERGETINĖS BŪSENOS TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė
KAUNAS, 2016
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
KASOS VĖŽINIŲ LĄSTELIŲ ENERGETINĖS BŪSENOS TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Kristina Paliulionytė
KAUNAS, 2016
3
TURINYS
SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 5
SUMMARY ............................................................................................................................................. 6
SANTRUMPOS ...................................................................................................................................... 8
1. ĮVADAS ............................................................................................................................................... 9
2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ............................................................................................ 11
3. LITERATŪROS APŽVALGA ....................................................................................................... 12
3.1. Kasos vėžys ................................................................................................................................ 12
3.2. Kasos vėžio patogenezė .............................................................................................................. 12
3.3. Kasos vėžio gydymas ................................................................................................................. 13
3.4. Gydymo metodai ........................................................................................................................ 13
3.5. Kasos vėžio atsparumas .............................................................................................................. 14
3.6. Tyrimams naudotos kasos vėžinių ląstelių linijos ...................................................................... 15
3.7. Gemzar (gemcitabinas) ............................................................................................................... 15
3.8. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis mitochondrijoms .................................................................. 17
3.9. Mitochondrijų struktūra ir funkcija ............................................................................................ 17
3.10. Mitochondrijų oksidacinis fosforilinimas ................................................................................. 19
3.11. Pažeistų mitochondrijų atsakas kasos vėžinėms ląstelėms ....................................................... 22
4. METODIKA ..................................................................................................................................... 24
4.1. Aparatūra, indai .......................................................................................................................... 24
4.2. Medžiagos ................................................................................................................................... 24
4.3. Ląstelių linijos ir auginimo sąlygos ............................................................................................ 24
4.4. Ląstelių paveikimas GEM ir IC50 matavimai ............................................................................ 25
4.5. MTT gyvybingumo testas ........................................................................................................... 25
4.6. Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio registravimas ............................................................ 26
4.7. Statistinė duomenų analizė ......................................................................................................... 27
5. REZULTATAI ................................................................................................................................. 28
4
5.1. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis kasos vėžinių ląstelių gyvybingumui ................................... 28
5.2. Skirtingų kasos vėžio ląstelių linijų mitochondrijų endogeninio kvėpavimo palyginimas ........ 29
5.3. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis kasos vėžio ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greičiui ....... 30
5.4. Gemcitabino poveikis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams kasos vėžinėse
ląstelėse .................................................................................................................................................. 37
6. REZULTATŲ APTARIMAS .......................................................................................................... 39
7. IŠVADOS .......................................................................................................................................... 41
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS............................................................................................................ 42
SANTRAUKA
Kristinos Paliulionytės magistro baigiamasis darbas „Kasos vėžinių ląstelių energetinės
būsenos tyrimas“/ mokslinė vadovė prof. dr. S. Trumbeckaitė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto,
Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Tyrimo tikslas. Ištirti kasos vėžinių ląstelių (paveiktų ir nepaveiktų chemoterapiniu vaistu –
gemcitabinu) energetinę būseną.
Uždaviniai. Ištirti ir palyginti skirtingų kasos vėžinių ląstelių linijų: Capan-1, Capan-2,
SU.86.86, MIAPaCa-2, paveiktų ir nepaveiktų gemcitabinu, endogeninio kvėpavimo greičius; Ištirti
gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms; Ištirti
gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų vidinės ir išorinės membranos
pralaidumui.
Metodai. Kasos vėžinių ląstelių linijos buvo skirstomos į kontrolines grupes ir tiriamąsias,
paveiktas gemcitabinu. Kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų kvėpavimo greitis, oksiduojant
glutamatą/malatą ir sukcinatą, registruojamas oksigrafiniu metodu, kuris atliekamas su „Oroboros
Oxygraph-2k“ aparatu. Ląstelių gyvybingumas nustatytas MTT metodu.
Rezultatai. Gemcitabinas padidino endogeninį kvėpavimo greitį MIAPaCa-2 ir SU.86.86
ląstelių linijose apie 2,4 ir 1,5 kartus, lyginant su kontrole. Gemcitabinas apie 2 kartus padidino
mitochondrijų kvėpavimo greitį oksiduojant glutamatą/malatą ir sukcinatą MIAPaCa-2, Capan-1 ir
SU.86.86 kasos vėžinėse ląstelių linijose, tačiau slopino mitochondrijų kvėpavimo kontrolės
koeficientą (13-15 %). Gemcitabinas neturėjo poveikio mitochondrijų išorinės membranos laidumui,
bet padidino MIAPaCa-2 ir Capan-1 mitochondrijų vidinės membranos laidumą.
Išvados. Endogeninio ir mitochondrijų kvėpavimo greičio pokyčiai kasos vėžinėse ląstelėse
gali būti sąlygojami gemcitabino poveikio mitochondrijų biogenezei. Atspariausia gemcitabinui buvo
Capan-2 kasos vėžio ląstelių linija.
SUMMARY
Kristina Paliulionytė Master degree thesis „Investigation of energetic state of pancreatic
cancer cells“/ study supervisor prof. dr. S. Trumbeckaitė; Lithuanian university of health sciences,
Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy, Kaunas.
The aim of the study. To investigate the energy state of the cancer cells (impacted and not
impacted by chemotherapic drug – gemcitabine) .
Tasks. To compare endogenous respiration rates of different pancreas cell lines: Capan-1,
Capan-2, SU.86.86, MIAPaCa-2, impacted and not impacted by gemcitabine, to study the impact of
gemcitabine on respiratory functions of mitochondria of pancreatic cancer cells lines; to study the
impact of gemcitabine on the permeability of inner and outer mitochondrial membrane of pancreatic
cancer cell lines.
Methods. Pancreatic cancer cell lines were divided into control and test groups, which were
impacted by gemcitabine. The respiration rate of pancreatic cancer cells with glutamate/ malate and
succinate as substrates was registered by oxygraphic method using „Oroboros Oxygraph-2k“ device.
Results. Gemcitabine increased (app. 2,4 and 1,5-folds) the endogenous respiration rate in
MIAPaCa-2 and SU.86.86 cell lines in comparison with control group. Gemcitabine increased (app. 2
– folds) the mitochondrial respiration rate in MIAPaCa-2, Capan-1 and SU.86.86 cancer cell lines,
respiring on glutamate/malate and succinate as substrates but suppressed the mitochondrial
respiratory control index by 13-15 %. Gemcitabine had no impact on the permeability of outer
mitochondric membrane, but increased the permeability of mitochondrial inner membrane in
MIAPaCa-2 ir Capan-1 cell line.
Conclusions. The revealed changes in endogenous and mitochondrial respiration rates in
pancreatic cancer cells could be due to gemcitabine impact on biogenesis of mitochondria. Capan-2
pancreatic cancer cell line was the most resistant to gemcitabine pre-treatment.
7
Padėka
Nuoširdžiai dėkoju šio darbo vadovei prof. dr. Sonatai Trumbeckaitei už labai vertingas
konsultacijas, kantrybę, visuomet suteiktą pagalbą ir paaiškinimus/patarimus rašant šį mokslinį darbą.
Taip pat dėkoju Neuromokslų Instituto Biochemijos laboratorijos, Virškinimo sistemos tyrimų
instituto Chirurginės gastroenterologijos laboratorijos darbuotojams ir ypač Aldonai Jakštaitei už
pagalbą vykdant tyrimus.
8
SANTRUMPOS
GEM – gemcitabinas
ADP – adenozino 5′ – difosfatas
ATP – adenozino 5′ – trifosfatas
FAD – flavinadenino dinukleotido oksiduota forma
FADH2 – flavino adenino dinukleotido redukuota forma
KoQ – kofermentas Q (ubichinonas)
KoQH2 – kofermento Q (ubichinono) redukuota forma
NAD – nikotinamido adenino dinukleotido oksiduota forma
NADH – nikotinamido adenino dinukleotido redukuota forma
KKK – mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas
9
1. ĮVADAS
Visame pasaulyje diagnozuojama labai daug vėžinių susirgimų. Dažniausiai pasireiškia
plaučių, gimdos, stemplės, krūties, stemplės vėžiai ir kt. Lietuva taip pat pasižymi pakankamai dideliu
vėžio sergamumu – kasmet registruojama daugiau nei 2000 vėžio atvejų. Neretai pasitaiko kasos
vėžys. Ši žmogaus vėžio forma yra labai agresyvi ir sunkiai pasiduoda chemoterapiniam ir
radioterapiniam gydymui. Kasos vėžys yra vienas iš pavojingiausių. Apie rizikos faktorių, kuris
sukelia kasos vėžį, nėra žinoma, tačiau kava, alkoholis, dietos, rūkymas yra vieni iš galimų kasos vėžio
atsiradimo rizikos faktorių. Manoma, kad epigenetiniai kasos vėžio pakitimai gali būti viena iš
priežasčių, dėl padidėjusio kasos vėžio atsparumo gydymui ir apoptozei [1, 2].
Dažniausiai chemoterapiniame kasos vėžio gydyme vartojamas gemcitabinas, kurio veikimo
mechanizmas remiasi tuo, kad slopina DNR sintezę ir vėžinių ląstelių dalijimąsi. Kai ląstelės nebegali
dalintis, jos žūsta ir tokiu būdu navikas yra slopinamas. Atlikus tris chemoterapijos kursus
gemcitabinu, 41 % pacientų po diagnozės išgyvena ilgiau negu 12 mėnesių [3].
Mitochondrijos yra ląstelės organelės, dalyvaujančios ne tik ATP sintezėje, bet ir ląstelės
žūties procesuose apaptozės ar nekrozės būdu.
Kasos vėžys patenka į penketuką mirtingiausių ligų Jungtinėse Amerikos Valstijose [2].
Mažiau nei 20 % ligonių išgyvena 2 metus po ligos diagnozavimo ir tik apie 5 % gyvena ilgiau nei 5-
erius metus. Išplitusio kasos vėžio tikimybės išgyventi mediana yra apie 6 mėnesius [2]. Norint
pagerinti gydymo rezultatus, reikia ieškoti naujų metodų, tinkamų kasos vėžio gydymui. Šia ligos
forma vis dažniau suserga jauni žmonės, o ir tikimybė išgyventi menka dėl blogo kasos vėžio atsako į
gydymą, todėl tai yra aktuali problema. Šiuo metu nėra pakankamai daug informacijos apie kasos
vėžinių ląstelių energetinę būklę bei jų atsparumo chemoterapijai mechanizmus, todėl mes ir atlikome
šį tyrimą, ištirdami kasos vėžinių ląstelių endogeninį kvėpavimą, mitochondrijų kvėpavimo greičius,
mitochondrijų vidinės ir išorinės membranos pralaidumus.
Šiame darbe išnagrinėta ir apibendrinta literatūra apie kasos vėžį, jo gydymą, kasos vėžines
ląsteles, bei įvertintas gydymui naudojamo chemoterapinio vaisto Gemzar (gemcitabino, slopinančio
DNR sintezę ir vėžinių ląstelių proliferaciją) poveikis kasos vėžinių ląstelių energetikai.
Eksperimentiniu būdu buvo ištirtos kasos vėžinių ląstelių: Capan-1 (kasos adenokarcinomos ląstelių
linija), Capan-2 (kasos adenokarcinomos ląstelių linija), SU.86.86 (kasos adenokarcinomos ląstelių
linija), MIAPaCa-2 (kasos adenokarcinomos ląstelių linija), kvėpavimo funkcijos (be vaisto ir su juo).
Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo registravimas (deguonies suvartojimo, mitochondrijų kvėpavimo
grandinės aktyvumo įvertinimas) – oksigrafinis metodas, atliekamas su „Oroboros Oxygraph-2k“
aparatu.
10
Darbe siekiama išsiaiškinti kasos vėžinių ląstelių atsparumą cheminio preparato Gemzar
poveikiui ir turimą įtaką ląstelių energetikai.
Darbo naujumas ir praktinė reikšmė
Šiuo metu nėra tyrimų apie kasos vėžinių ląstelių energetinę būklę (poveikį mitochondrijų
kvėpavimo greičiams, vidinės ir išorinės membranos pralaidumui) bei jų atsparumo chemoterapijai
mechanizmus. Šiame tyrime nustatėme, kad gemcitabino poveikyje didėja mitochondrijų kvėpavimo
greičiai okiduojant glutamatą/malatą ir sukcinatą MIAPaca-2, Capan-1 ir SU.86.86 kasos vėžinėse
ląstelių linijose, ir slopinamas mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas. Atspariausia
gemcitabino poveikiui buvo Capan-2 kasos vėžio ląstelių linija. Endogeninio ir mitochondrijų
kvėpavimo greičio pokyčiai kasos vėžinėse ląstelėse gali būti sąlygojami gemcitabino poveikio
mitochondrijų biogenezei. Šie tyrimai atskleidė naujų žinių apie gemcitabino poveikį skirtingų kasos
vėžinių ląstelių linijų mitochondrijoms ir apie galimus kasos vėžinių ląstelių atsparumo gemcitabinui
mechanizmus.
11
2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: ištirti kasos vėžinių ląstelių (paveiktų ir nepaveiktų chemoterapiniu vaistu-
gemcitabinu) energetinę būseną.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti ir palyginti gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių linijų: Capan-1, Capan-2,
SU.86.86, MIAPaCa-2, endogeninio kvėpavimo greičiams.
2. Ištirti gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių: Capan-1, Capan-2, SU.86.86,
MIAPaCa-2, mitochondrijų kvėpavimo funkcijoms.
3. Ištirti gemcitabino poveikį kasos vėžinių ląstelių linijų: Capan-1, Capan-2, SU.86.86,
MIAPaCa-2, mitochondrijų vidinės ir išorinės membranos pralaidumui.
12
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Kasos vėžys
Kasos adenokarcinoma – labai rimta, mirtina liga. Kol kas nėra veiksmingų, efektyvių
gydymo būdų arba jų yra labai mažai. Kasos vėžiu sergančių pacientų tikimybė išgyventi yra pati
prasčiausia, palyginus su kitų vėžinių formų ligomis sergančiais pacientais. Ligai progresavus, gyventi
lieka apie 6 mėnesius. Kasos vėžys yra ketvirtas pagal pacientų mirtingumą, tad yra tik 5 % tikimybė,
kad pacientas, sergantis kasos vėžiu, išgyvens 5-erius metus [2]. Nepaisant pažangios chirurgijos ir
medicinos terapijos, nuo kasos vėžio Jungtinėse Amerikos Valstijose per metus miršta 31 000 žmonių.
Situacija Lietuvoje yra tokia, jog paskutiniuosius 20 metų pacientų sergamumas kasos vėžiu auga – per
metus vyrų sergamumas padidėja 2 %, o moterų – 1,6 %. Nustatyta, kad Lietuvoje 2002–2005 m.
išgyveno 5,2 % pacientų, sergančių kasos vėžiu 5-erius metus. Vienas iš pagrindinių kasos vėžio
požymių – plati vietos naviko invazija ir ankstyva sisteminė sklaida [1, 2].
3.2. Kasos vėžio patogenezė
Pirmiausia, vardijami etiopatogenezės rizikos faktoriai, kurie gali nulemti kasos vėžio
atsiradimą ar aktyvėjimą. Tai gali būti aplinkos veiksniai, tokie kaip nesaikingas kavos bei alkoholio
vartojimas, įvairių dietų laikymasis bei diabeto požymiai [4]. Verta paminėti, kad rūkymas yra bene
vienas svarbiausių rizikos faktorių. Taip pat išskiriami ir demografiniai veiksniai, tokie kaip rasė, lytis,
amžius, gyvenamoji vietovė. Ligonių paveldimumas taip pat yra vienas iš rizikos faktorių, kuris gali
didinti tikimybę susirgti kasos vėžiu. Visi etiologiniai rizikos faktoriai gali būti skirstomi į
endogeninius ir egzogeninius [4]. Jie veikia DNR, todėl dar yra vadinami genotoksinais. Veikdami jie
sukelia tiesioginį ir netiesioginį poveikį ląstelei. Poveikio sistema prasideda tuo, jog jie pradžioje būna
prokancerogenais, vėliau virsta kancerogenais ir galiausiai jungiasi prie DNR, sudarydami toksiškus
junginius, dėl kurių atsiranda genų mutacijos [4].
Kasos vėžio onkogenezėje dalyvauja kelios genų grupės, kurios yra suskirstytos į onkogenus
bei naviką slopinančių genų grupes. Onkogenai: K-ras, c-erbB-2, c-c-eebB-3, c-myc, c-fos. Naviką
slopinantys genai: p53, p16, p15, DCC, DPC4, Rb, APC [4]. Onkogenai susidaro iš protoonkogenų,
taip sukeldami mutacijas. Ras genai: K-ras, N-ras, H-ras, yra vieni iš pagrindinių genų, kurių mutaciją
nustatant galime įtarti kasos vėžį. Konkrečiau kasos vėžio audinyje yra nustatoma K-ras geno 12
kodono mutacija. Pasitelkus PGR (polimerazės grandininės reakcijos) tyrimo metodą, nustatomos genų
mutacijos kasos vėžio audinyje, kasos sultyse, kraujo plazmoje, o šių genų koduojami pakitę baltymai
13
nustatomi imunohistochemiškai, imunologiškai bei molekulinės biologijos metodais [4]. Jeigu kartu
nustatomas ras mutavęs onkogenas su c-myc, tokiu atveju nustatoma piktybiškesnė kasos vėžio stadija.
Iš naviką slopinančių genų, svarbiausias yra p53, kuris randamas 17 chromosomos trumpajame petyje.
Šio geno koduojamas baltymas neigiamai veikia proliferaciją bei ląstelės augimą [4].
3.3. Kasos vėžio gydymas
Kasos vėžio, kaip ir daugelio kitos rūšies vėžių, gydymo efektyvumas priklauso nuo to,
kokioje stadijoje jis yra diagnozuojamas. Du trečdaliai kasos vėžio atvejų būna kasos galvoje ir vienas
trečdalis kasos kūne arba uodegoje. Didžiausią tikimybę išgyti turi tie pacientai, kurie savo sveikatą
tikrinasi dažniau ir vėžys yra diagnozuojamas ankstyvoje stadijoje [5]. Duomenys rodo, kad
dažniausiai kasos vėžys diagnozuojamas per vėlai. Tik 10-20 % pacientų turi galimybę išgyti po auglio
šalinimo operacijos. Dauguma pacientų išgirsta diagnozę, kad gyventi liko mažiau nei metai.
Mokslininkai stengiasi tobulėti šioje srityje, atlikdami įvairius bandymus ir tyrimus, kad pacientų,
sergančiu kasos vėžiu, mirtingumas būtų kuo mažesnis [6].
Kasos vėžio stadijos:
1. Ankstyvoji stadija. Netgi šioje stadijoje nustačius vėžį, prognozės nėra itin geros. Jeigu
vėžys nėra išplitęs į kitus organus ar audinius ir įmanoma atlikti operaciją, tik 7-25 % pacientų gyvens
5 metus ir ilgiau. Dažniausiai vėžio ląstelės būna jau išplitusios prieš operaciją. Ląstelės yra pernelyg
mažos, kad būtų pastebėtos tyrimų metu, tačiau palaipsniui išauga į kitos rūšies vėžius [7].
2. Pažengusi stadija – tai stadija, kai vėžys jau yra nebeoperuojamas ir tikimybės išgyventi
vidurkis siekia maždaug 6-11 mėnesių. Jeigu vėžys jau išplitęs, tikimybė išgyventi sumažėja iki 2-6
mėnesių. Tačiau tai priklauso nuo to, kiek stipriai vėžys yra išaugęs ir išplitęs [7].
3.4. Gydymo metodai
Gydymo metodas parenkamas priklausomai nuo ligos stadijos (kuo ankstyvesnė tuo geriau),
kasos vėžio tipo (cistiniai ir endokrininiai kasos vėžiai dažniau išoperuojami), nuo amžiaus ir bendros
sveikatos būklės (pacientas turi būti pakankamai lieknas, kad, prireikus, būtų galima lengviau pasiekti
auglį) [5].
1. Chirurginis (operacijos metu pašalinama visa ar dalis kasos ir šalia esantys audiniai)
metodas. Šis metodas atliekamas pacientams su 1 ir 2 stadijos kasos vėžiu. Chirurginis kasos vėžio
14
gydymas netaikomas, kai auglio neįmanoma rezekuoti arba yra metastazių, išplitusių į kitus organus ar
audinius. Dažniausiai pasirenkamos organą išsaugančios operacijos [5, 6].
2. Radioterapinis (vėžio ląstelės naikinamos lokalizuotoje vietoje) metodas. Šis gydymo
metodas neskiriamas taip dažnai, palyginus su navikų operacijomis ar chemoterapija, tačiau padeda
sumažinti ligos simptomus. Kai chirurginė operacija negalima, taikomas radioterapijos ir
chemoterapijos (kombinuotas) derinys. Radioterapijos metu naudojami stiprių bangų spinduliai, kurie
žudo vėžines ląsteles. Tačiau šis metodas nėra visiškai patikimas, todėl, kad jos metu gali žūti ir
sveikos ląstelės bei atsirasti šalutinių poveikių [5, 6].
3. Chemoterapinis (vėžio ląstelės naikinamos visame kūne) metodas. Šis metodas
paprastai skiriamas jau po chirurginės operacijos, užtikrinti, kad vėžys nepasikartos. Dažniausiai
skiriama gemcitabino arba 5-fluorouracilo chemoterapija. Jei kasos vėžys jau pažengęs, chemoterapija
padeda ne visada ir net nėra matomų akivaizdžių pagerėjimo požymių. Pažengusiam kasos vėžiui
gydyti būna paskiriama chemoterapinių vaistų kombinacija, tai sukelia daugiau šalutiniu poveikių negu
vartojant vieną vaistą, tačiau tai didina tikimybę išgyventi ilgiau [5, 6].
Kadangi kasos vėžys yra labai atsparus chemoterapiniam gydymui, yra ieškoma naujų,
efektyvių gydymo metodų ir galimybių, kurios padėtų padidinti gydymo veiksmingumą ir pagerinti
tikimybes išgyventi rezultatus.
3.5. Kasos vėžio atsparumas
Kasos vėžio sukeliami pokyčiai molekuliniame lygmenyje nėra visiškai išaiškinti ir
suprantami. Manoma, kad epigenetiniai pakitimai gali būti viena iš priežasčių, dėl padidėjusio kasos
vėžio atsparumo gydymui ir apoptozei [2]. Vienas jų – DNR metilinimas. Vėžinėse ląstelėse
aptinkamas padidintas Apaf-1 koduojančio geno metilinimo lygis. Šis genas dalyvauja apoptosomos
susidaryme, dėl to randama sumažėjusi jo raiška [8].
Ląstelių proliferacijai ir apoptozei reikalinga potranskripcinė genų reguliacija, kuri yra
siejama su kasos adenokarcinomos atsparumu chemoterapijai. „Žinoma, kad vėžinėse ląstelėse
potranskripcinė genų reguliacija keičiasi dėl RNR surišančių baltymų. HuR (ELAV1) yra RNR
surišantis baltymas, reguliuojantis daugelio molekulių ekspresiją, prisijungdamas jų iRNR ir
skatindamas baltymų sintezę nuo jų“ [9].
Kasos vėžinių ląstelių atsparumas tradiciniam gydymui, chemoterapijai priklauso nuo jų
sugebėjimo inicijuoti apoptozę. Todėl reikia suprasti kasos vėžinių ląstelių apoptozės mechanizmų
anomalijas, kad būtų sumažintas šių vėžinių ląstelių atsparumas chemoterapijai [10].
15
3.6. Tyrimams naudotos kasos vėžinių ląstelių linijos
Šiais laikais ląstelių ar audinių kultūros yra labai svarbios medicininiuose tyrimuose. Bene
kiekvieną diena ląstelių linijos naudojamos įvairiems tyrimams, pvz.: tiriant preparatų veiksmingumą,
norint persodinti gyvą audinį, esant odos nudegimams, kamieninių ląstelių naudojimas prieš
transplantaciją. Ląstelių linijos, užaugintos in vitro sąlygomis, leidžia išlaikyti joms būdingas
biologines savybes. Santykinai didelis skaičius labai gerai apibūdinamų žmogaus kasos vėžio ląstelių
linijų yra prieinamos naudoti ikiklinikiniams tyrimams [11].
Capan-1 – tai kasos adenokarcinomos ląstelių linija, išskirta iš žmogaus. Vėžio somatinių
mutacijų duomenų bazėse įrašyta, jog su šia ląstelių linija iš viso buvo atlikti 652 tyrimai ir nustatyta,
kad 380 genų turėjo mutacijas. Ši ląstelių linija tinkama transfekcijoms. Capan-1 išskiria skrandžio
tipo muciną ir išreiškia cistinės fibrozės transmembraninio laidumo reguliatorių.
SU.86.86 – kasos adenokarcinomos ląstelės išskirtos iš metastazės kepenyse. Pavienės,
adherentinės, tipas: epitelinės, dvigubėjimo trukmė – 28-48 h. Mutacijos: p53.
Capan-2 – tai žmogaus kasos adenokarcinomos ląstelių linija. Capan-2 pirma kartą buvo
išskirtos 1975m. iš pirminio naviko, kurį turėjo 56 metų kaukazietis vyras, sergantis kasos duktaline
adenokarcinoma. Šios ląstelės auga limpančių/adhezinių audinių kultūroje, kurios augdamos formuoja
vieną sluoksnį ir pasižymi epitelio sandara. Ši ląstelių linija suformuoja gerai diferencijuotus auglius,
kai šių ląstelių yra suleidžiama į imuninių pelių organizmus.
MIAPaCa-2 – kasos adenokarcinomos ląstelės išskirtos iš pirminio auglio. Pavienės,
adherentinės, tipas: epitelinės, dvigubėjimo trukmė - apie 26 h. Tai yra hypotriploidinė žmogaus
ląstelių linija. Modalinis chromosomų skaičius yra 61. Mutacijos: p53, p16, K-ras.
3.7. Gemzar (gemcitabinas)
Gemzar (gemcitabinas) yra priešvėžinis chemoterapinis vaistas. Jis skiriamas kasos vėžio,
nesmulkialąsteliniam plaučių vėžio, šlapimo pūslės vėžio, minkštųjų audinių sarkomos, kiaušidžių
vėžio gydymui ir profilaktikai. Gemcitabinas yra antimetabolitas, purino antagonistas. Jo formulė
pateikta 1 paveiksle. Jis skiriamas kaip standartas kasos vėžiui gydyti, nors jo efektyvumas nėra
didelis.
16
1 pav. Gemcitabino hidrochlorido formulė [12]
Gemtabicino veikimo mechanizmas remiasi tuo, kad jis slopina DNR sintezę ir vėžinių
ląsteliu dalijimąsi. Kai ląstelės nebegali dalintis, jos žūsta ir tokiu būdu navikas yra slopinamas.
Antimetabolitai yra panašūs į įprastas medžiagas. Kai ląstelės įtraukia šias medžiagas į vidų, į
medžiagų apykaitą, ląstelės praranda galimybę dalintis [13]. Gemzar vaistas veikia ląsteles konkrečiu
ląstelės ciklo momentu – tik tuomet, kai ląstelės dalijasi.
Su Gemzar vaistu buvo atliktas tyrimas: „Kasos adenokarcinomos ląstelių in vitro atsakas į
chemoterapinį vaistą gemcitabiną, nuslopinus HuR geno raišką“ [6]. Tyrimas buvo atliekamas su
SU.86.86 ląstelių linija bei su Capan-2 ląstelių linija, kurios bus naudojamos ir šiame tyrime. Buvo
naudojamos tokios gemcitabino koncentracijos: 0, 3, 5, 7, 10, 50, 100, 500, 1 000, 2 000, 5 000 ng/ml,
tačiau nustatyta, kad inhibuojančioji gemcitabino dozė SU.86.86 ląstelių linijai yra 25 ng/ml, o Capan-
2 ląstelių linijai – 5 µg/ml. Po poveikio gemcitabinu, ląstelių gyvybingumas siekė SU.86.86 ląstelėse –
59,80 %, o Capan-2 ląstelėse – 79,64 %. Gauti rezultatai, naudojant MTT metodą gyvybingumui
nustatyti, parodė, kad mažiausias ląstelių gyvybingumas buvo toje ląstelių grupėje, kurios buvo
paveikiamos gemcitabinu dar prieš tai jose nuslopinus HuR geno raišką: SU.86.86 ląstelių
gyvybingumas siekė 25,64 %, o Capan-2 ląstelių gyvybingumas – 72,18 %. Autoriai daro išvadą, kad
sumažėjus baltymo HuR kiekiui, kasos vėžio ląstelės yra jautresnės chemoterapiniam vaistui, ką
parodo jų gyvybingumo sumažėjimas. SU.86.86 ląstelių linija buvo žymiai jautresnė gemcitabinui,
nutildžius HuR geno raišką [9].
Kiti autoriai teigia, kad kasos vėžio gydymas vienu gemcitabinu yra žymiai mažiau
veiksmingas, negu gydant kombinacijoje su KML001(natrio meta-arsenitu). Kartu jie stipriau slopina
17
ląstelių proliferaciją, invaziją ir žymiai sumažina epidermio augimo faktoriaus receptoriaus (EGFR) ir
matricos metiloproazės-2 (MMP2) išraišką [14].
Įvairiose kasos vėžio ląstelių linijose gemcitabino sukeltą ląstelių augimo slopinimą stiprina
P276-00 (nuo ciklinų priklausomas kinazės inhibitorius). Nukleozidų analogas gemcitabinas yra
dažniausiai naudojamas kasos vėžio gydymui, tačiau jis visiškai jo neišgydo, tik prailgina žmogaus,
sergančio kasos vėžiu, gyvenimą keliais mėnesiais [15].
Kadangi gemcitabinas yra vienas iš pagrindinių vaistų kasos vėžiui gydyti, tai su šiuo vaistu
buvo atliktas tyrimas ir žiūrėta, kiek prailgėja paciento gyvenimas, atlikus chemoterapiją šiais vaistais
[9]. Buvo tiriami 49 pacientai su pažengusiu kasos vėžiu ir buvo pastebėta, kad gemcitabinas prailgina
paciento gyvenimo trukmę. 41 % pacientų išgyvena ilgiau negu 12 mėnesių po diagnozės, atlikus tris
chemoterapijos kursus gemcitabinu. Pacientams, kurių kasos vėžio navikas yra mažas, o BUN
(kreatinino ir kraujo šlapalo azoto) serumo kiekis normalus, gemcitabinas gali būti efektyvus ir
prailginti tų pacientų gyvenimą [16].
Schniewind ir kt. parodė, kad kasos vėžio jautrumas gydymui gemcitabinu siejamas su nuo
mitochondrijų priklausomos apoptozės keliu. Buvo atlikti tyrimai, kaip nuo mitchondrijų 2 signalinio
transdukcinio kelio aktyvavimo priklauso apoptozės skatinimas bei kaip chemoterapinis vaistas
gemcitabinas indukuoja apoptozę [17]. Tyrimas buvo atliekamas su kasos vėžinių ląstelių linijomis:
Colo357, PancTu1 ir Panc1, tiriant jų jautrumą gemcitabinui. Jautriausia gemcitabinui buvo Colo357,
toliau Panc1, o visiškai atspari – PancTul ląstelių linija. Norint molekuliniame lygmenyje įvertinti
gemcitabino įtaka apoptozei, buvo tiriamas ir apoptozinų baltymų aktyvavimas. Nors skirtingas
jautrumas gemcitabinui skiriasi tarp kasos vėžio ląstelių linijų, nustatyta, kad gemcitabinas skatina
ląstelių apoptozės vyksmą nuo mitochondrijų priklausomu signaliniu keliu [17].
3.8. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis mitochondrijoms
Tyrimų kaip gemcitabinas veikė kasos vėžio mitochondrijų funkcijas nėra. Todėl mūsų darbo
tikslas buvo ištirti ir aprašyti, kaip šis vaistas veikia mitochondrijų kvėpavimo greičius, ar turi poveikį
mitochondrijų oksidaciniam fosforilinimui.
3.9. Mitochondrijų struktūra ir funkcija
Mitochondrijų kiekis ląstelėse dažnai skiriasi ir priklauso nuo ląstelės tipo bei ląstelės
energijos poreikio. Aukštesniųjų augalų ląstelėse dažniausiai randama nuo 50 iki 2000 mitochondrijų.
18
Mitochondrijos – judrios, dinamiškos organelės, esančios ląstelėje, užtikrinančios ląstelės kvėpavimą,
kurio rezultatas – energija, organizmo panaudojama įvairių procesų vyksmui, atpalaiduojama arba
akumuliuojama adenozintrifosfato rūgšties (ATP) pavidale. Kitos mitochondrijų funkcijos: hemo,
lipidų, amino rūgščių ir nukleotidų sintezė, neorganinių jonų homeostazės palaikymas, ląstelės žūties
valdymas.
2 pav. Mitochondrijų struktūra [18]
Mitochondrija yra dvimembranė organelė. Tai reiškia, kad ji yra dukart apsupta membranos
sistemos, sudarytos iš vidinės ir išorinės mitochondrijų membranų, atskirtų tarpmembranine erdve.
Tarpmembraninė erdvė dažniausiai būna nuo 6 iki 8 nm storio. Mitochondrijos ilgis dažniausiai siekia
1-7 µm, o plotis 0,5-1 µm. Vidinė ir išorinė membranos skiriasi baltymų-lipidų santykiu pagal masę.
Vidinėje membranoje santykis 4:1, o išorinėje 1:1 [19]. Išorinė membrana yra pusiau pralaidi jonams ir
mažoms molekulėms. Ją sudaro 6 % visų mitochondrijos baltymų. Vidinė membrana yra nepralaidi,
todėl medžiagos patenka veikiant įvairioms specialioms pernašų sistemoms. Vidinę membraną sudaro
21 % baltymų, o tarpmembraninę erdvę 6 % visų mitochondrijos baltymų. Net iki 67 %, t.y. didžiausią
dalį, baltymų turi mitochondrijų užpildas.
19
Kiekviena iš mitochondrijos struktūros dalių atlieka skirtingas funkcijas (žr. 2 pav.). Vidinė
membrana matrikse išsidėsto sudarydama vingiuotas klostes, kurios vadinamos kristomis. Kristos
padidina vidinės membranos paviršiaus plotą, o tai leidžia aktyviau vykdyti oksidacinį fosforilinimą
[19]. Užpilde yra mitochondrijų genetinė sistema, taip pat kaip ir fermentai, atsakinga už pagrindines
oksidacinio metabolizmo reakcijas. Gliukozė ir riebalų rūgštys yra pagrindinis energijos šaltinis
ląstelėse. Piruvato ir riebalų rūgštys paverčiamos į acetil-KoA mitochondrijų užpilde.
Trikarboksirugščių ciklo metu acetil-KoA yra oksiduojamas į CO2. Acetyl-KoA pavertimas CO2 yra
siejamas su NAD+ ir FAD redukcija į NADH ir FADH2 atitinkamai, kuriuos oksiduojant
mitochondrijose oksidacinio fosforilinimo proceso metu sintetinama ATP [20].
Išorinė mitochondrijų membrana, priešingai nei vidinė, laisvai praleidžia mažas molekules.
Taip yra dėl baltymų, kurie sudaro kanalus ir leidžia medžiagoms, mažesnėms nei 600 daltonų, pro ją
praeiti. Vidinė mitochondrijų membrana palaiko protonų gradientą, kuris skatina oksidacinį
fosforilinimą [20].
Medžiagų oksidacija visuose organizmuose vyksta trijomis stadijomis [21]. Pirmoje stadijoje
išlaisvinama nedaug energijos, čia įvairūs substratai oksiduojami iki acetil-KoA. Antroje stadijoje
dviangliai fragmentai (acetil-KoA pavidale) matrikse oksiduojami Krebso cikle, tai susiję su didelių
energijos kiekių išlaisvinimu redukuotų kofermentų NADH ir FADH2 pavidale. Trečiojoje stadijoje
mitochondrijų kvėpavimo grandinėje oksiduojami redukuoti nikotinamidų ir flavino kofermentai, šiuo
metu susidaro vanduo ir išlaisvinama daugiausiai energijos, kuri panaudojama ATP sintezei [21].
3.10. Mitochondrijų oksidacinis fosforilinimas
Oksidacinis fosforilinimas – tai vidinėje mitochondrijų membranoje vykstantis procesas, kai
energija, kuri išsiskiria oksiduojantis NADH ir FADH2, yra panaudojama ATP sintezei.
Membraninio proceso metu (pernešant elektronus mitochondrijose) energija paverčiama į
elektrocheminį protonų gradientą, kuris panaudojamas ATP sintezei. Tokiu būdu elektronų pernaša
mitochondrijų kvėpavimo grandine (oksidacija) susijusi su ADP fosforilinimu, todėl tai vadinama
oksidaciniu fosforilinimu [21]. Galima išskirti keturis mitochondrijų kvėpavimo grandinės
kompleksus: I kompleksas – NADH dehidrogenazė, II kompleksas – sukcinato dehidrogenazė, III
kompleksas – citochromo bc1, IV kompleksas – citochromo c oksidazė. Mitochondrijų kvėpavimo
grandinės kompleksai pavaizduoti 3 paveiksle. Tarp šių kompleksų elektronus perneša mažesni,
judrūs elektronų nešikliai (KoQ ir citochromas c), kurie į kompleksų sudėtį neįeina (žr. 4 pav.) [21].
Kvėpavimo grandinė – tai vidinėje mitochondrijų membranoje esanti sudėtinga oksidacijos-
redukcijos sistema, kuri perneša elektronus deguoniui (susidarant vandeniui) [21]. Pagrindinė
20
kvėpavimo grandinės funkcija – laipsniškai išlaisvinti energiją iš kvėpavimo grandinės substratų
(redukuotų kofermentų (NADH ir FADH2)) [21].
3 pav. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksai [22]
Kompleksai turi vieną arba kelias prostetines grupes, kurios grįžtamai prijungia elektronus.
Labai svarbi elektronų pernašos kvėpavimo grandinėje savybė yra tai, jog ji susijusi su protonų
pernaša iš mitochondrijų užpildo į tarpmembraninę erdvę. Kvėpavimo grandinėje protonus išmeta
kompleksai I, III ir IV [47]. ADP fosforilinimas nėra savaiminis, šiam procesui būtina energija, kuri
gaunama skylant kitam makroerginiam junginiui. Todėl šis fosforilinimo būdas – substratinis
fosforilinimas. Oksidaciniu fosforilinimas – kai fosforilinimui reikalingą energiją teikia, vykstantys
oksidacijos-redukcijos procesai membranoje, veikiančioje kvėpavimo grandinėje [23].
Pirmasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas sudarytas iš 46 baltymų subvienetų,
kurių masė siekia 1000 kDa. Antrasis sudarytas iš 4 baltymų subvienetų: A, B, C, D. Pirmieji du yra
hidrofiliniai, o C ir D yra transmembraniniai. Trečiajį kvėpavimo kompleksą sudaro du dimerai, kurie
turi po 11 subvienetų. Paskutinis ketvirtasis mitochondrijų kvėpavimo kompleksas sudarytas iš 13
subvienetų.
21
4 pav. Mitochondrijų elektronų transporto grandinės kompleksų kodavimas dvejomis
genetinėmis sistemomis. Genetinės sistemos: mitochondrijų DNR (MtDNR) ir branduolio DNR
(nDNR). MtDNR koduoja 7 NADH dehidrogenazės subvienetus kompleksui I, citochromo B
kompleksui III, 3 citochromo c oksidazės (COX) subvienetus kompleksui IV ir 2 ATPazės kompleksui
V. Tik kompleksas II yra užkoduotas nDNR. Nepunktyrinės rodyklės žymi elektronų srautą kvėpavimo
grandinės kryptimi; punktyrinės rodyklės rodo genetinės informacijos iš MtDNR ar nDNR į RNR ir į
baltymą; skaičiai rodo faktinį skaičių baltymų subvienetų koduotų kiekvienos genetinės sistemos.
Specifiniai inhibitoriai RNR transkripcijos arba baltymų transliacijos nurodomi violetine spalva [24]
Pirmasis mitochondrijų kvėpavimo kompleksas, NADH dehidrogenazė, greitina elektronų
pernašą nuo NADH ant KoQ, kur vėliau KoQ tampa redukuotas – susidaro KoQH2. Ubichinonas
perneša elektronus į trečią kompleksą iš pirmojo. Pirmojo komplekso du elektronai bei protonai
pradžioje pernešami nuo NADH ant FMN, kol galiausiai pasiekia KoQ. Į tarpmembraninę erdvę
pernešami 4 protonai iš mitochondrijų užpildo [25].
Trikarboksirūgščių ciklo reakcijose, oksidacinio fosforilinimo reakcijose dalyvauja antrasis
mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas – sukcinato dehidrogenazė, kuris jungiasi su vidine
mitochondrijų membrana. Antrasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas katalizuoja
sukcinato oksidaciją ir KoQ redukciją, kurios metu susidaro produktas – fumaratas. Tokiu būdu
elektronai ir protonai patenka ant KoQ nuo sukcinato [26]. Elektronai ir protonai yra pernešami ant
FAD nuo sukcinato, galiausiai susidaro KoQH2. Šis kompleksas reguliuoja Krebso ciklo aktyvumą,
pernešdamas elektronus i kvėpavimo grandinę [26, 27].
Elektronai, nuo redukuoto KoQ (KoQH2) per trečiąjį kvėpavimo grandinės kompleksą
(citochromas bc1 kompleksą), pernešami citochromui c. Elektronų pernaša vykdoma nuo ubichinolio
22
iki citochromo b, vėliau jie pernašami Fe-S bei citochromui c1, kol galiausiai pasiekiamas citochromas
c ir jis redukuojamas. Šis kompleksas yra kaip protonų pompa, nes į citozolį per membraną iš užpildo
pernešami 4 protonai [25, 27, 28].
Paskutinis, ketvirtasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas (citochromo c
oksidazė), prisijungęs prie vidinės mitochondrijų membranos išorinės pusės, perneša elektronus nuo
citochromo c molekuliniam deguoniui. IV kompleksas turi keturis redokso centrus: CuA, CuB ir du
hemus (a ir a3). Pradinis citochromo c elektronų akceptorius – CuA. Nuo CuA ant hemo a3 elektronus
perneša hemas a, o hemas a3, kartu su CuB, prijungia deguonį ir jį redukuoja susidarant vandeniui.
Prijungus keturis elektronus ir keturis protonus, susidarius dviem vandens molekulėms yra
redukuojamas deguonis. Mitochondrijų kvėpavimo grandinės IV kompleksas, priešingai nei I ir III,
perneša du protonus iš mitochondrijų užpildo į tarpmembraninę erdvę [27, 28].
Yra išskiriamas ir penktasis kvėpavimo grandinės kompleksas, kuris katalizuoja ATP sintezę
iš ADP ir neorganinio fosfato, panaudojant elektrocheminį protonų gradientą. Jis vadinamas
mitochondrijų ATP sintaze [28].
3.11. Pažeistų mitochondrijų atsakas kasos vėžinėms ląstelėms
Vienas pirmųjų, teigusių, kad mitochondrijų defektai gali turėti poveikį vėžiui – O. Warburg.
Mitochondrijos vaidina svarbų vaidmenį ląstelių energijos apykaitos procese, laisvųjų radikalų
susidaryme ir apoptozėje [29]. Manoma, kad mitochondrijų disfunkcija prisideda prie vėžio vystymosi
ir progresavimo. Vėžinės ląstelės savo energetiniams poreikiams naudoja glikolizės metu, o ne
oksidacinio fosforilinimo metu gautą ATP, kas būdinga sveikoms ląstelėms. Mitochondrijų defektai
vėžinėse ląstelėse apima mitochondrijų kvėpavimo grandinės ir glikolizės fermentų pasikeitusią raišką
ir aktyvumą, sumažėjusią oksidaciją su NADH susijusiais substratais taip pat mitochondrijų DNR
(mtDNR) mutacijas. Vis dar nėra visiškai aišku, kas turi įtakos mitochondrijų DNR mutacijoms, kokie
mechanizmai yra atsakingi už tai, kaip tai veikia vėžio vystymąsi, vėžinių ląstelių atsparumą vaistams
ir ligos progresavimą [24].
Kai kurie mokslininkai mano, kad mitochondrijų disfunkcija yra susijusi su vėžinių ląstelių
atsparumu apoptozei. Manoma, kad stipriai sumažėjusi mitochondrijų funkcija sukelia svarbius vėžinių
ląstelių metabolinių funkcijų pakitimus [29, 30]. Deaktyvuojant mitochondrijų funkcijas, gali būti
skatinama specialiai užprogramuota vėžinių ląstelių mirtis, kad padėtų stabdyti vėžio plėtimąsi [31].
Vėžinių ląstelių proliferacija ir naviko agresyvumas koreliuoja su padidintu glikolizės naudojimu bei
sumažėjusia mitochondriju kvėpavimo grandinės veikla [32]. Atlikto tyrimo metu naudota krūties
vėžio ląstelių linija MDA-MB-231, kuri buvo užauginta ribojant gliukozės prieinamumą, bei kai
23
kuriuos inhibitorius, reikalingus normaliai mitochondrijų veiklai. Gauti rezultatai parodė, kad slopinant
gliukozės naudojimą mitochondrijų kvėpavimo grandinėje sukeliama vėžinių ląstelių mirtis. Toks pat
tyrimas buvo atliktas su kasos vėžinių ląstelių linija MIAPaCa-2. Rezultatai parodė, kad ir šiai vėžinių
ląstelių linijai sukėlus mitochondrijų funkcijos sutrikimus, padidėja ląstelių mirtis [32].
1990 metais, kuomet tapo prieinami eksperimentai su žinduolių ląstelių mtDNR, pasikeitė
supratimas apie vėžinių ląstelių ir mitochondrijų kvėpavimo funkcijų sasają. Buvo atlikti tyrimai,
kuriais buvo įrodytas ilgalaikis poveikis žmogaus ląstelėms. Nedidelėmis koncentracijomis
naudojamas etidijaus bromidas stipriai sumažina mitochondrijų DNR kiekį – taip nusilpnindamas
oksidacinio fosforilinimo veiklą [33]. Kai oksidacinio fosforilinimo veikla buvo slopinama, vėžinės
ląstelės pakeitė savo elgesį ir sutriko gebėjimas augti nepriklausomu būdu, pradėjo mažėti vėžio
piktybiškumo potencialas. Svarbu tai, kad auglio ląstelės, su pažeistu oksidaciniu fosforilinimu, tapo
itin jautrios citotoksiniams vaistams. Šie duomenys rodo, kad auglių atsiradimas dalinai priklauso nuo
pokyčių mitochondrijų kvėpavimo grandinėje [33].
Kadangi vėžio ląstelės ATP gamybai dažniausiai naudoja glikolizę, o ne oksidacinį
fosforilinimą, todėl jos yra jautresnės glikolizės slopinimui ir gliukozės netekimui [32]. Pastarųjų metų
tyrimai rodo, kad slopinant glikolizę ir naudojant mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų
inhibitorius, vėžinės ląstelės pasidaro jautresnės oksidacinio fosforilinimo inhibitoriams. Taigi,
oksidacinio fosforilinimo inhibitoriais blokuojant oksidacinį fosforilinimą vėžinėse ląstelėse,
slopinamas kasos vėžio ląstelių augimas [32].
24
4. METODIKA
4.1. Aparatūra, indai
Oroboros Oxygraph-2k; magnetinė maišyklė (VARIOMAG); pH-metras (pH-Meter 766);
Analitinės svarstyklės (KERN ABJ-220-4M); vandeninis termostatas 37 C (GRANT GD120);
Hamilton mikrošvirkštai; automatinės pipetės; antgaliai; kolbos; kiuvetės; mėgintuvėliai; cilindrai;
stiklinėlės.
4.2. Medžiagos
Glutamatas (glutamato rūgštis) (SIGMA); malatas 99 % grynumo (L–obuolių rūgšties natrio
druska) (SIGMA); digitoninas (SIGMA); ADP 98 % grynumo (SIGMA); amitalis (SIGMA);
sukcinatas 99 % grynumo (SIGMA); citochromas c 99 % grynumo (SIGMA); atraktilozidas (Na–
druska) (SIGMA); dinitrofenolis (SIGMA); EDTA (SIGMA); EGTA 99 % grynumo (ROTH);
etanolis; HEPES 99,5 % grynumo (SIGMA); KCl 99,5 % grynumo (ROTH); KH2PO4 98 % grynumo
(ROTH); K–laktobionatas (ALDRICH); MgCl2∙6H2O (ROTH); sacharozė 99,5 % grynumo (ROTH);
taurinas (SIGMA).
4.3. Ląstelių linijos ir auginimo sąlygos
Tyrimams in vitro naudojamos kasos vėžio ląstelės ir linijos yra gautos komerciniu būdu.
Analizei buvo naudojamos žmogaus kasos vėžio ląstelių linijos: Capan-1, Capan-2, MIAPaCa-2 ir
SU.86.86. Ląstelės buvo auginamos vienasluoksnėse, steriliose, 75 cm2 talpos, lėkštelėse, RPMI
terpėje (5 ml) su 10 % FBS (fetalinis jaučio serumas). Lėkštelės su ląstelėmis buvo laikomos
inkubatoriuje. Capan-1, MIAPaCa-2, SU.86.86 ląstelių linijos buvo auginamos RPMI terpėje (Gibco/
Invitrogen) su 10 % FBS (fetalinis jaučio serumas) (Gibco/ Invitrogen) ir 1 % penicilino/
streptomicino tirpalu (Gibco/ Invitrogen). Capan-2 ląstelės buvo auginamos RPMI medium terpėje su
20 % FBS (fetalinis jaučio serumas) ir 1 % penicilino/ streptomicino tirpalu. Ląstelės buvo auginamos
palaikant drėgmę: oro temperatūra siekė apie 37 ˚C, o aplinka buvo prisotinta 5 % CO2.
Ląstelės augintos ir MTT testas atliktas Virškinimo sistemos tyrimų instituto Chirurginės
gastroenterologijos laboratorijoje.
25
4.4. Ląstelių paveikimas GEM ir IC50 matavimai
Ląstelės buvo pasodintos į specialias lėkšteles su 96 šulinėliais (3*103 ląstelių/ šulinėlyje),
ląstelių kultūroms auginti. Ląstelės buvo veikiamos chemoterapiniu vaistu gemcitabinu (Eli Lilly,
Indianapolis), į kiekvieną šulinėlį naudojant skirtingas koncentracijas: 0, 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000,
2000 ir 5000 ng/ml, tam, kad apskaičiuoti ir sužinoti vidutinę gemcitabino inhibuojančią koncentraciją
(IC50). Paveiktos ląstelių linijos gemcitabinu buvo laikomos 72 valandas 37 ˚C temperatūroje, o
aplinka buvo prisotinta 5 % CO2. Po 72 valandų inkubacijos, MTT metodas buvo naudojamas norint
nustatyti ląstelių gyvybingumą.
Nustatyta gemcitabino vidutinė inhibuojanti (slopinanti) koncentracija: IC50 MIAPaCa-2
ląstelių linijai buvo 50 ng/ml, SU.86.86– 25 ng/ml, Capan-1– 5 µg/ml. Capan - 2 ląstelėms IC50
nebuvo pasiekta, naudota dozė tebuvo IC40– 5 µg/ml.
4.5. MTT gyvybingumo testas
MTT metodas priklauso ląstelės funkcijų tyrimo metodų grupei, kurių metu tiriami ląstelių
augimui reikalingi metobolitai – tai ląstelių gyvybingumo nustatymas. Metodas grindžiamas tuo, jog
redukuotų piridino dinukleotidų NAD(P)H kiekis ląstelėje parodo viduląstelinių energetinių procesų
efektyvumą, o pažeistosios ląstelės nesugebės panaudoti redukuotų NAD(P)H metaboliniams
procesams ir augimui. Tetrazolio druska MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio
bromidas) redukuojama NAD(P)H susidarant chromoforui-formazanui. Susidariusio formazano kiekis
yra tiesiog proporcingas gyvoms/gyvybingoms ląstelėms. MTT vandeninis tirpalas yra gelsvas, o jį
redukavus, susidaro violetinės spalvos formazano druskos, kurių koncentracija išmatuojama
spektrofotometru.
Ląstelių gyvybingumo testas buvo atliekamas su MTT (3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5
difeniltetrazolio bromidu) (Invitrigen). Ląstelės buvo inkubuojamos su MTT (5 mg/ml) 4 valandas prie
37 ˚C temperatūros. Po 4 valandų inkubacijos, MTT tirpalas su terpe buvo pašalinamas, tuomet
violetinės formazano druskos buvo tirpinamos įpilant į šulinėlį 200 ml dimetilsulfoksido (DMSO)
(Carl ROth GmbH) ir švelniai purtant purtyklėje plokštelę 15 minučių. Absorbcija buvo matuojama
spektrofotometru (Tecan Sunrise) prie 550 nm ir 620 nm bangos ilgio ir apskaičiuojamas optinis
tankis. Duomenys apdorojami naudojant „Microsoft Offise Excel“ programą.
26
4.6. Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio registravimas
Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio registravimas atliktas LSMU Neuromokslų Institute.
Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio matavimai atliekami naudojant poliarografinę sistemą
Oxygraph-2K (Oroboros, Austrija). Oksigrafiniu metodu galima įvertinti deguonies sunaudojimo greitį
per minutę bei kasos vėžinėse ląstelėse (kontrolinėse ir paveiktose chemoterapiniu vaistu gemcitabinu)
ištirti pokyčius patologijos metu, išanalizuoti endogeninio mitochondrijų kvėpavimo greičius.
Naudijant Oroboros oksigrafą matuojami deguonies srauto pokyčiai laike, nustatome jų kinetiką,
panaudojant atitinkamus mitochondrijų kvėpavimo grandinės substratus ir slopiklius.
Analizė buvo atliekama naudojant uždarą kiuvetę, kurios temperatūra buvo palaikoma apie 37
˚C. Joje įmontuotas Klark tipo deguonies elektrodas. Kadangi vėžinėms ląstelėms naudojant deguonį
kinta sunaudoto deguonies koncentracija terpėje, taip pat kinta ir jo redukcija ant platinos elektrodo bei
srovės stiprumas, einantis per tirpalą. Gautų poliarografinių kreivių pokyčiai, vėžinėms ląstelėms
naudojant deguonį, rodo srovės stiprumo pokytį, iš ko ir galime spręsti apie ląstelių (mitochondrijų)
sunaudoto deguonies koncentraciją laiko bėgyje. 5 paveiksle matoma originali kasos vėžinių ląstelių
kvėpavimo kreivė.
5 pav. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimo kreivė. Dig – 8 µl digitonino, Glu+Mal – 5 mM
ir 2 mM atitinkamai, ADP – 1 mM adenozino difosfato, AMI – 2 mM amitalio, Succ – 15 mM
sukcinato, Cyt C – 32 µM citochromo c, ATR – 0,12 mM atraktilozido, DNF – 0,3 mM dinitrofenolio.
MiR06 terpės sudėtis: 0,5 mM EGTA, 3 mM MgCl2∙6H2O, 60 mM K–laktobionatas (pH 7,0,
25 ˚C temperatūroje), 20 mM taurinas, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sacharozė; pH 7,1
(37 ˚C temperatūroje).
27
Kasos vėžinių ląstelių kvėpavimo greičio nustatymas pradedamas į termostuojamą kiuvetę
įpilant 2 ml terpės MiR06. Matavimai atliekami 37 °C termastatuojamoje kiuvetėje. Kiuvetė uždaroma
specialiu kamščiu ir ~40 minučių registruojamas deguonies sunaudojimo greitis. Įpylus terpę ir
neįdėjus ląstelių, deguonis nėra sunaudojamas, nes terpėje ląstelių nėra. Pridėjus ląstelių (1mln/1ml)
suspensijos, kurios yra paveiktos arba nepaveiktos chemoterapiniu vaistu gemcitabinu, stebimas
endogeninis deguonies sunaudojimo pokytis (kvėpavimo intensyvumas). Užregistravus deguonies
sunaudojimo pokytį, į terpę pridedama 5 µg/ml digitonino, 5 mM glutamato ir 5 mM malato –
matuojamas bazinis mitochondrijų kvėpavimo greitis (antroji mitochondrijų metabolinė būsena (V0)).
Kreivei nusistovėjus, pridedame 10 µl ADP. Pastebimas staigus kvėpavimo padidėjimas.
Mitochondrijos pereina į trečiąją metabolinę būseną (VADP(Glu/Mal)) ir tai reiškia, kad esant ADP ir
substratų pertekliui, mitochondrijų kvėpavimo greitis yra maksimalus. Mitochondrijų intensyvus
kvėpavimas vyksta dėl oksidacinio fosforilinimo ir ATP sintezės. Vėliau įdedama 2 mM amitalio,
užslopiname I mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksą, laukiame kol kvėpavimo greitis
nusistovės ir dedame 15 mM II mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso substrato – sukcinato.
Tuomet pridedame 32 µM citochromo c (VCyt c) ir vertiname išorinę mitochondrijų membraną –
pažeista ar ne. Jeigu pastebimas mitochondrijų kvėpavimo greičio stimuliavimas (dėl citochromo c
trūkumo), tai rodo, kad išorinė mitochondrijų membrana yra pažeista, o jeigu kvėpavimo greitis nėra
stimuliuojamas, vadinasi membrana nėra pralaidi citochromui c ir tai reiškia, kad ji nėra pažeista.
Trečioji mitochondrijų metabolinė būsena pereina į ketvirtąją (VATR), pridėjus ADP/ATP nešiklio
inhibitoriaus 0,12 mM atraktilozido. Atraktilozidas blokuoja ADP patekimą, būtent tai turi įtakos
mitochondrijų kvėpavimo greičio sumažėjimui. Pabaigoje į mitochondrijas įdedama 0,3 mM DNF,
oksidacijos ir fosforilinimo procesų aktyvumui.
Skaičiavimams naudotos formulės: Citochromo C efektas= VADP(Succ)+cytc / VADP;
KKKGlu/Mal= V3 / V0; KKKSucc= VADP(Succ)+cytc / VATR
Duomenys apdorojami naudojant „Microsoft Offise Excel" programą. Ląstelių kvėpavimo
greitis išreiškiamas pmolO/s/mln ląstelių.
4.7. Statistinė duomenų analizė
Rezultatų vidurkiai pateikiami su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis. Skirtumai tarp
vidurkių statistiškai reikšmingi, jeigu p < 0,05. Pateikti nemažiau keturių eksperimentinių tyrimų
vidurkiai su paklaidomis. Duomenų patikrinimui įvesti naudojamas „Student-t“ testas. Statistinė
analizė buvo atliekama naudojant „SigmaPlot“ 11.0 programą.
28
5. REZULTATAI
Tyrimą atlikus kruopščiai, sistemiškai ir tiksliai, gauti rezultatai, kurie parodo gemcitabino
poveikį kasos vėžinių ląstelių bei mitochondrijų kvėpavimo greičiams. Tyrimo metu įvertinome štai
tokius parametrus: kasos vėžinių ląstelių endogeninio kvėpavimo greitį, mitochondrijų kvėpavimo
greitį antroje (V0), trečioje (V3), ketvirtoje (VATR) metabolinėse būsenose. Apskaičiavome
mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientą, kuris padeda įvertinti mitochondrijų funkcinę kokybę.
Be to, nustatėme išorinės membranos pažeidimą pagal citochromo C efektą ir įvertinome vidinės
membranos pralaidumą.
5.1. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis kasos vėžinių ląstelių gyvybingumui
Lyginant kontrolines ląstelių linijų grupes be gemcitabino, mažiausias kiekis negyvų ląstelių
buvo pastebimas MIAPaCa-2 ląstelių linijoje – 3,5 % (žr. 6 pav.). Didžiausias kiekis negyvų ląstelių
nustatytas Capan-2 ląstelių linijoje (14,2 ± 5,6 %).
6 pav. Gemcitabino (Gemzaro) įtaka kontrolinių ir tiriamųjų ląstelių linijų gyvybingumui.
* - statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant su kontroline grupe, p< 0,05; ** - statistiškai
reikšmingas skirtumas, lyginant su MIAPaCa-2 kontroline grupe, p< 0,05
29
Tyrimo rezultatai parodė, kad eksperimentuose naudotų kasos vėžinių ląstelių linijų paveiktų
gemcitabinu, gyvybingumas visose grupėse sumažėjo (žr. 6 pav.). MIAPaCa-2 ląstelių linijos
tiriamojoje grupėje negyvų ląstelių kiekis sudarė 9,8 %. Capan-1 kasos vėžio ląstelių liniją paveikus
gemcitabinu, negyvų ląstelių kiekis sudarė 11,5 %. Eksperimento rezultatai parodė, kad veikiant
Capan-2 ląstelių linija gemcitabinu, negyvų ląstelių kiekis sudarė 30,5 %, tačiau statistiškai patikimo
skirtumo tarp kontrolinių ir paveiktų gemcitabinu ląstelių, nebuvo. SU.86.86 kasos vėžinių ląstelių
linijoje gemcitabinas negyvų ląstelių skaičių padidino 1,5 karto ir sudarė 14,4 %.
Tiriamosiose grupėse, paveiktose gemcitabinu, labiausiai įtakos turėta Capan-2 ląstelių linijai.
Šioje grupėje negyvų ląstelių skaičius siekė 30,5 ± 12 %. Iš gautų rezultatų matome, kad atspariausia
gemcitabinui buvo Capan-1 kasos vėžio ląstelių linija.
5.2. Skirtingų kasos vėžio ląstelių linijų mitochondrijų endogeninio kvėpavimo
palyginimas
Kasos vėžio ląstelių endogeninio kvėpavimo greitis (deguonies sunaudojimas) matuotas
poliarografiniu metodu. Kadangi tokių tyrimų su kasos vėžio ląstelėmis nėra, atliekant tyrimą
nustatinėjome skirtingų kontrolinių grupių ląstelių linijų endogeninį kvėpavimą (žr. 7 pav.).
7 pav. Kasos vėžinių ląstelių mitochondrijų endogeninis kvėpavimas. * - statistiškai reikšmingas
skirtumas, lyginant su atitinkama kontroline grupe be gemcitabino, p< 0,05, ** - statistiškai
reikšmingas skirtumas, lyginant su MIAPaCa-2 kontroline grupe
30
Iš visų tiriamųjų kontrolinių grupių, mitochondrijų endogeninio kvėpavimo greitis buvo
mažiausias MIAPaCa-2 kontrolinėje ląstelių linijoje – jis siekė 28 pmolO/s/mln ląstelių. Kitose ląstelių
linijose (Capan-1, Capan-2 ir SU.86.86) mitochondrijų endogeninio kvėpavimo greitis buvo statistiškai
reikšmingai didesnis, lyginant su MIAPaCa-2 ląstelių linija. Capan-1 ląstelių linijos endogeninis
kvėpavimo greitis buvo 60,6 pmolO/s/mln ląstelių, SU.86.86 ląstelių linijoje (49 pmolO/s/mln ląstelių)
ir Capan-2 ląstelių linijos nustatytas endogeninio kvėpavimo greitis sudarė 51,1 pmolO/s/mln ląstelių.
Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp Capan-1, Capan-2 ir SU.86.86 lyginant endogeninio kvėpavimo
greičius, nebuvo nustatyta.
Palyginus endogeninio kvėpavimo greičius, kasos vėžinėse ląstelėse, paveiktose gemcitabinu,
nustatytas statistiškai reikšmingas kvėpavimo greičio padidėjimas 2,4 karto MIAPaCa-2 ląstelių
linijoje, lyginant su kontrole. Tarp kitų ląstelių linijų (SU.86.86, Capan-1 ir Capan-2) statistiškai
reikšmingo gemcitabino poveikio endogeninio kvėpavimo greičiui nebuvo, nors SU.86.86 vėžinėse
ląstelėse buvo stebima tendencija didėti endogeniniam kvėpavimo greičiui (1,5 karto).
Taigi, rezultatai rodo, kad gemcitabinas neslopino endogeninio kvėpavimo greičio nei vienoje
kasos vėžio ląstelių linijoje, o MIAPaCa-2 ir SU.86.86 ląstelių linijose endogeninis kvėpavimo greitis
buvo netgi didesnis, lyginant su kontrolinėmis grupėmis. Tai gali būti susiję su mitochondrijų kiekio
padidėjimu kasos vėžinių ląstelių linijose, paveiktose gemcitabinu.
Tolimesniuose eksperimentuose įvertinome mitochondrijų kvėpavimo greitį kasos vėžinių
ląstelių linijose, paveiktose gemcitabinu. Dėl šios priežasties ląstelės buvo veikiamos digitoninu (1
µg/ml) 7 minutes. Tokiu būdu ląstelės membrana tampa laidi ir prieinama mitochondrijų substratams.
5.3. Gemcitabino (Gemzaro) poveikis kasos vėžio ląstelių mitochondrijų
kvėpavimo greičiui
Kasos vėžinių ląstelių, paveiktų gemcitabinu, tyrimai yra ypač svarbūs norint suprasti
procesus, vykstančius kasos vėžio ląstelėse, paveiktose gemcitabinu, ir surasti, kuo daugiau
informacijos apie kasos vėžio gydymą bei priežastis, kodėl kasos vėžinės ląstelės yra atsparios
gemcitabino poveikiui. Kadangi mitochondrijos yra svarbios ląstelės organelės, tyrėme gemcitabino
poveikį mitochondrijų kvėpavimo parametrams, joms oksiduojant I mitochondrijų kvėpavimo
grandinės komplekso substratus – glutamatą/malatą ir II mitochondrijų kvėpavimo grandinės
komplekso substratą – sukcinatą.
Pirmiausia, parinkome eksperimentines sąlygas, ištyrėme mitochondrijų kvėpavimo greitį
kontrolinėse ląstelių linijose (nepaveiktose chemoterapiniu vaistu gemcitabinu).
31
8 pav. Kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų kvėpavimo greičiai. V0 – mitochondrijų
kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM
malato. V3 – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP.
VADP(Succ)- mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir
15 mM substrato sukcinato. VADP(Succ)+cyt C – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje
būsenoje, pridėjus 32 µM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje
metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. * - statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant
su MIAPaCa-2 ląstelių linija, p<0,05.
Mitochondrijų kvėpavimo grečiai įvairiose metabolinėse būsenose (žr. 8 pav.), rodo, jog
tirtomis sąlygomis visos ląstelių linijos geba naudoti ADP ir sintetinti ATP. Pridėjus ADP pradinis
(V3) kvėpavimo greitis buvo stimuliuojamas ir vykstant oksidaciniam fosforilinimui, maksimalus
kvėpavimo greitis MIAPaCa-2 ląstelių linijoje pasiekė 44,1 ± 4,6 pmolO/s/mln ląstelių, Capan-1
ląstelių linijoje – 59,9 ± 5,9 pmolO/s/mln ląstelių. Kitose ląstelių linijose ADP taip pat stimuliavo:
Capan-2 ląstelių linijoje mitochondrijų kvėpavimo greitis nustatytas 51,2 ± 9,4 pmolO/s/mln ląstelių,
SU.86.86 ląstelių linijoje – 68,3 ± 6,0 pmolO/s/mln ląstelių. Tai rodo oksidacinio fosforilinimo
procesų apjungimą ir mitochondrijų gebėjimą sintezuoti ATP. Didžiausias sukcinato oksidacijos greitis
buvo pasiektas SU.86.86 ląstelių linijoje (96,0 ± 9,8 pmolO/s/mln ląstelių), o, lyginant su kitomis
ląstelių grupėmis, statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo, išskyrus su MIAPaCa-2 ląstelių linija:
SU.86.86 ląstelių linijoje kvėpavimo greitis, oksiduojant sukcinatą, buvo 2 kartus didesnis už
MIAPaCa-2 ląstelių linijos kvėpavimo greitį. Pridėjus citochromo c į ląstelių kvėpavimo terpę,
pagreitėjimo nebuvo. Taigi, mitochondrijų išorinės membranos buvo nepažeistos – tai parodo
kontrolinių ląstelių kokybę. Pridėjus atraktilozido, ADP/ATP inhibitoriaus, buvo slopinamas ADP
patekimas į mitochondrijas ir ATP sintezė. Taigi, buvo stebimas kvėpavimo greičio sumažėjimas.
32
Statistiškai reikšmingo skirtumo mitochondrijų kvėpavimo greičio VATR tarp kasos vėžinių ląstelių
linijų grupių nebuvo.
Kituose eksperimentuose tirtas gemcitabino poveikis kasos vėžinėms ląstelėms. Tam tikslui
ląstelės paveikiamos gemcitabinu, o vėliau matuojami mitochondrijų kvėpavimo greičiai.
1 lentelė. MIAPaCa-2 kontrolinės ląstelių linijos ir tiriamosios grupės mitochondrijų kvėpavimo
greičiai
Mitochondrijų kvėpavimo
greičio parametrai
MIAPaCa-2 MIAPaCa-2+Gem
V0 (Glu/mal) 29,2 ± 8,1 72,2 ± 12,7*
VADP(Glu/Mal) 44,1 ± 4,6 82,52 ± 10,1*
VADP (Succ) 47,9 ± 4,4 82,5 ± 15,9*
VADP (Succ)+Cyt c 47,7 ± 4,4 79,5 ± 17,8
VATR 27,1 ± 4,3 60,5 ± 8,1*
VDNF max 45,3 ± 4,3 87,7 ± 15,4*
Cyt C efektas 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,1
KKK (succ) 1,9 ±0,3 1,3 ± 0,1
* – statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant su kontroline grupe, p<0,05. Mitochondrijų
kvėpavimo greitis išreikštas pmolO/s/mln ląstelių. V0(Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje
metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM malato. VADP(Glu/Mal) –
mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP. VADP(Succ) –
mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir 15 mM
substrato sukcinato. VADP(Succ)+Cyt c – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje,
pridėjus 32 mM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje metabolinėje
būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. VDNF max – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje
metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,3 mM dinitrofenolio.
Rezultatai pateikti 1-oje lentelėje. MIAPaCa-2 ląstelių linijoje, po inkubacijos su
gemcitabinu, stebimas statistiškai reikšmingas mitochondrijų kvėpavimo greičio padidėjimas 2,5 karto
antroje metabolinėje būsenoje (V0), oksiduojant mitochondrijų I komplekso substratus
33
glutamatą/malatą, lyginant su kontroline grupe. Trečioje metabolinėje būsenoje, kuomet į inkubacijos
terpę buvo pridedama ADP, mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo taip pat statistiškai reikšmingai
(p<0,05) didesnis 1,9 karto, lyginant su kontrolinėmis mitochondrijomis. Pridėjus sukcinato,
mitochondrijų kvėpavimo greitis išliko toks pat (žr. 1 lentelė). Veikiant gemcitabinu, mitochondrijų
kvėpavimo greitis padidėjo 1,7 karto. Citochromo c pridėjimas į inkubacijos terpę nepadidino
kvėpavimo greičio trečioje metabolinėje būsenoje. Tai rodo, jog išorinė mitochondrijų membrana
išliko intaktiška. Mitochondrijų kvėpavimo greitis, pridėjus atraktilozido (VATR), kuris yra ADP/ATP
nešiklio inhibitorius, statistiškai reikšmingai padidėjo 1,3 karto (VATR=60,5 ± 8,1), lyginant su
kontroline grupe. Todėl galima manyti, jog gemcitabinas padidino mitochondrijų vidinės membranos
laidumą. Dinitrofenoliu atskirtas mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo panašaus dydžio kaip ir
VADP(succ). Taigi, gemcitabinas poveikio mitochondrijų kvėpavimo grandinei neturėjo. Mitochondrijų
kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK), rodantis mitochondrijų kokybę, nuo gemcitabino statistiškai
reikšmingai sumažėjo 35 % (Glu/Mal) ir 32 % (Succ) – tai rodo mitochondrijų funkcijos slopinimą.
Kadangi kvėpavimo greičiai, veikiant gemcitabinui, nebuvo slopinami, priešingai, jie netgi padidėję,
lyginant su kontroline grupe, todėl tai gali būti siejama su mitochondrijų biogeneze.
Mitochondrijų kvėpavimo greičių pokyčiai vėžinių ląstelių linijoje – Capan-1 ląstelėse,
oksiduojant substratą glutamatą/malatą, pateikti 2 lentelėje. Čia taip pat nustatytas mitochondrijų
kvėpavimo greičių padidėjimas skirtingose metabolinėse būsenose.
Capan-1 kasos vėžio ląstelių linijos mitochondrijų kvėpavimo greitis antroje metabolinėje
būsenoje padidėjo 38 %, t.y. nuo 49,4 iki 68 pmolO/s/mln ląstelių, lyginant su kontroline grupe (žr. 2
lentelė). Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje (VADP(Glu/mal)) padidėjo nuo
59,9 iki 93,3 pmolO/s/mln ląstelių, t.y. net 56 %, lyginant su kontroline grupe. Oksiduojant II
mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso substratą – sukcinatą, Capan-1 tiriamosiose ląstelėse
mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėjo 43 %. Citochromo c pridėjimas stimuliavo mitochondrijų
kvėpavimą nežymiai (6,4 %) ir statistiškai nereikšmingai. Tai įrodo, kad mitochondrijų išorinė
membrana nebuvo pažeista (žr. 2 lentelė). Kontrolinėje grupėje citochromo c pridėjimas taip pat
nesukėlė reikšmingų pokyčių. Atraktilozidas slopino mitochondrijų kvėpavimo greitį, tačiau grupėje,
paveiktoje gemcitabinu, buvo statistiškai reikšmingas padidėjimas (97 %), lyginant su kontroline
grupe. Tai parodo, kad gemcitabinas padidina Capan-1 ląstelių linijos mitochondrijų vidinės
membranos pralaidumą (~1,3 kartus). Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas KKK(Succ)
oksiduojant sukcinatą sumažėja 32 %, o oksiduojant glutamatą/malatą 14%.
34
2 lentelė. Capan-1 kontrolinės ląstelių linijos ir tiriamosios grupės mitochondrijų kvėpavimo
greičiai
Mitochondrijų kvėpavimo
greičio parametrai
Capan-1 Capan-1+Gem
V0 (Glu/mal) 49,4 ± 12,9 68,0 ± 32,0
VADP(Glu/mal) 59,9 ± 5,9 93,3 ± 28,2
VADP (Succ) 72,0 ± 5,9 102,7 ± 29,7
VADP (Succ)+Cyt c 73,0 ± 6,5 109,3 ± 32,0
VATR 42,7 ± 6,0 84,0 ± 22,3
VDNF max 80,3 ± 6,5 102,7 ± 29,7
Citochromo C efektas 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,1
KKK(succ) 1,9 ± 0,5 1,3 ± 0,1
Mitochondrijų kvėpavimo greitis išreikštas pmolO/s/mln ląstelių. V0 – mitochondrijų kvėpavimo
greitis antroje metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM malato.
VADP(Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP.
VADP(Succ) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir
15 mM substrato sukcinato. VADP(Succ)+Cyt c – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje
būsenoje, pridėjus 32 µM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje
metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. VDNF max – mitochondrijų kvėpavimo greitis
ketvirtoje metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,3 mM dinitrofenolio.
Capan-2 kasos vėžio ląstelių mitochondrijų kvėpavimo pokyčiai, veikiant gemcitabinui,
pavaizduoti 3 lentelėje. Skirtingose metabolinėse būsenose, mitochondrijų kvėpavimo greitis vėžinėse
ląstelių linijose, paveiktose gemcitabinu, statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo kontrolės. Priešingai,
netgi turėjo tendenciją mažėti. Oksiduojant glutamatą/malatą mitochondrijų kvėpavimo greitis,
veikiant gemcitabinui, buvo slopinamas 20 % (nuo 51,2 iki 41 pmolO/s/mln ląstelių), nors statistiškai
reikšmingo skirtumo nebuvo. Lyginant kvėpavimo greičius, oksiduojant sukcinatą, matyti, kad grupės,
paveiktos gemcitabinu, mitochondrijų kvėpavimo greitis 3 metabolinėje būsenoje buvo 23 %
mažesnis, lyginant su kontroline grupe, tačiau pokytis nebuvo statistiškai reikšmingas. Papildomas
citochromo c pridėjimas į inkubacinę terpę neturėjo poveikio mitochondrijų kvėpavimo greičiui
35
trečioje metabolinėje būsenoje. Tai įrodo, kad mitochondrijų išorinė membrana nuo gemcitabino šiose
ląstelėse buvo nepažeista. Mitochondrijų kvėpavimo greitis nei antroje metabolinėje būsenoje (V0), nei
pridėjus atraktilozido (VATR) nesikeitė (p>0,05). Tai rodo, jog šių vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų
vidinės membranos intaktiškumas nuo gemcitabino nesikeitė.
3 lentelė. Capan-2 kontrolinės ląstelių linijos ir tiriamosios grupės mitochondrijų kvėpavimo
greičiai
Mitochondrijų kvėpavimo
greičio parametrai
Capan-2 Capan-2+Gem
V0(Glu/mal) 39,2 +/-15,8 26,0 +/-6,0
VADP(Glu/mal) 51,2 +/-9,4 41,0 +/-9,0
VADP(Succ) 59,3 +/-16,5 45,0 +/-7,0
VADP(Succ)+Cyt c 59,0 +/-16,5 45,5 +/-6,5
VATR 38,3 +/-8,7 26,5 +/-7,5
VDNFmax 57,7 +/-14,2 45,0 +/-9,0
Citachromo C efektas 1,0 ± 3,3 1,0 ± 5,0
KKK(Succ) 1,5 ± 0,1 1,8 ± 0,2
Mitochondrijų kvėpavimo greitis išreikštas pmolO/s/mln ląstelių. V0 – mitochondrijų kvėpavimo
greitis antroje metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM malato.
VADP(Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP.
VADP(Succ) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir
15 mM substrato sukcinato. VADP(Succ)+Cyt c – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje
būsenoje, pridėjus 32 mM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje
metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. VDNF max – mitochondrijų kvėpavimo greitis
ketvirtoje metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,3 mM dinitrofenolio.
Palyginome gemcitabino poveikį mitochondrijų funkcinei būklei SU.86.86 kasos vėžio
ląstelių linijoje (žr. 4 lentelė).
36
4 lentelė. SU.86.86 kontrolinės ląstelių linijos ir tiriamosios grupės mitochondrijų kvėpavimo
greičiai
Mitochondrijų kvėpavimo
greičio parametrai
SU.86.86 SU.86.86+Gem
V0(Glu/mal) 52,5 ± 12,5 92,0 ± 25,0
VADP(Glu/mal) 68,3 ± 6,0 115,3 ± 29,2
VADP(Succ) 96,0 ± 9,8 170,0 ± 51,3
VADP(Succ)+Cyt c 93,1 ± 9,3 167,3 ± 50,5
VATR 48,3 ± 5,8
86,0 ± 19,6
VDNF max 112,3 ± 9,8 182,3 ± 55,5
Citochromo C efektas 1,0 ± 3,3 1,0 ± 8,8
KKK(Succ) 2,0 ± 0,2
1,9 ± 0,1
Mitochondrijų kvėpavimo greitis išreikštas pmolO/s/mln ląstelių. V0 – mitochondrijų kvėpavimo
greitis antroje metabolinėje būsenoje, pridėjus 8 µl digitonino, 5 mM glutamato ir 2 mM malato.
VADP(Glu/Mal) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 1 mM ADP.
VADP(Succ) – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje, pridėjus 2 mM amitalio ir
15 mM substrato sukcinato. VADP(Succ)+Cyt c – mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje
būsenoje, pridėjus 32 µM citochromo c. VATR – mitochondrijų kvėpavimo greitis ketvirtoje
metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,12 mM atraktilozido. VDNF max – mitochondrijų kvėpavimo greitis
ketvirtoje metabolinėje būsenoje, pridėjus 0,3 mM dinitrofenolio.
Kontrolinės grupės kvėpavimo greitis antroje metabolinėje būsenoje (V0) nustatytas 52,5
pmolO/s/mln ląstelių, o paveikus gemcitabinu, kvėpavimo greitis V0 būsenoje buvo 92 pmolO/s/mln
ląstelių, t.y. padidėjo 1,75 karto. Mitochondrijų kvėpavimo greitis trečioje metabolinėje būsenoje (t.y.
pridėjus ADP), oksiduojant glutamatą/malatą, veikiant gemcitabinui, padidėjo net 69 %, lyginant su
kontrolinėmis mitochondrijomis. Oksiduojant sukcinatą mitochondrijų kvėpavimo greitis padidėjo nuo
115,3 iki 170 pmolO/s/mln ląstelių, t.y. 47 %, lyginant su kontroline grupe. Pridėjus citochromo c
kvėpavimo greitis nesikeitė. Tai įrodo, kad mitochondrijų išorinė membrana ir šiose ląstelių linijose
išlieka nepažeista. Į terpę pridėjus atraktilozido ir užslopinus ADP patekimą į mitochondrijas,
mitochondrijos perėjo į ketvirtą metabolinę būseną (VATR). Šioje būsenoje mitochondrijų kvėpavimo
37
greitis suletėja iki 86 pmolO/s/mln ląstelių, t. y. 1,9 karto. Kontrolinėse mitochondrijose atraktilozido
pridėjimas taip pat sulėtino mitochondrijų kvėpavimo greitį 1,9 karto. Tai rodo, kad paveikus ląstelės
gemcitabinu, mitochondrijų vidinė membrana išlieka intaktiška.
5.4. Gemcitabino poveikis mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams kasos
vėžinėse ląstelėse
Kadangi trijose kasos vėžio ląstelių linijose (MIAPaCa-2, Capan-1 ir SU.86.86), veikiant
gemcitabinui, mitochondrijų kvėpavimo greitis (VADP) nustatytas padidėjęs, buvo svarbu įvertinti
mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientą (KKK), oksiduojant mitochondrijų kvėpavimo
grandinės I komplekso substratus glutamatą/malatą, kuris parodo ATP sintezės mitochondrijose
aktyvumą. Kuo šis koeficientas didesnis, tuo geresnė mitochondrijų fukcija, oksidacijos ir
fosforilinimo procesų apjungimas. KKK nustatomas pagal greičių V3 ir V0 santykį (KKK= V3/ V0).
Gauti rezultatai pateikti 5–oje lentelėje.
5 lentelė. Mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientai kasos vėžinių ląstelių linijose oksiduojant
glutamatą/malatą KKK
MIAPaCa-2 1,7 +/-0,4
MIAPaCa-2+Gem 1,1 +/-0.1*
Capan-1 1,3 +/-0,2
Capan-1+Gem 1,1 +/-0,1
Capan-2 1,2 +/-0,1
Capan-2+Gem 1,6 +/-0,1
SU.86.86 1,5 +/-0,1
SU.86.86+Gem 1,3 +/-0,1
* – statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant su kontroline grupe, p<0,05.
Kai mitochondrijos oksiduoja glutamatą/malatą, tiek MIAPaCa-2, tiek Capan-1 ir SU.86.86
kasos vėžio ląstelių linijų mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas sumažėja 35 %, 15 % ir 13
% atitinkamai. Statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0.05) nustatytas tik MIAPaCa-2 ląstelių linijoje,
38
lyginant su grupe nepaveikta gemcitabinu. Tai rodo gemcitabino sukeltą mitochondrijų oksidacinio
fosforilinimo slopinimą šiose ląstelių linijose. Capan-2 ląstelių linijos mitochondrijų kvėpavimo
kontrolės koeficientas gemcitabino poveikyje nesikeitė, priešingai, netgi padidėjo, lyginant su
kontroline grupe, nors ir statistiškai nereikšmingai. Tai rodo, kad Capan-2 ląstelių linijų
mitochondrijos yra atsparios gemcitabino poveikiui. Atsižvelgdami į šiuos rezultatus, galime spręsti
apie gemcitabino poveikį mitochondrijoms MIAPaCa-2, Capan-1 bei iš dalies SU.86.86 ląstelių
linijoms. Tai parodo, kad paveikus gemcitabinu, mitochondrijose vyksta pokyčiai, pablogėja
mitochondrijų funkcinė būklė, silpniau sintetinamas ATP, nors kvėpavimo greičiai ir nesumažėja,
priešingai, jie netgi padidėja. Tai gali būti susiję su mitochondrijų biogeneze – mitochondrijų fermentų
persitvarkymu ar jų kiekio padidėjimu. Gemcitabinu nepaveiktose mitochondrijose oksidacijos ir
fosforilinimo procesai visiškai apjungti ir ATP sintezė vyksta pilnai. Mitochondrijų pokyčiai, veikiant
gemcitabinui, gali būti dėl mitochondrijų vidinės membranos pralaidumo padidėjimo arba pokyčių
mitochondrijų kvėpavimo grandinėje. Mechanizmo išsiaiškinimui reikalingi tolimesni tyrimai.
39
6. REZULTATŲ APTARIMAS
Chemoterapinio vaisto gemcitabino įtaka kasos vėžiui yra tyrinėjama jau seniai, daugelis
mokslininkų yra nustatę jo terapinį poveikį kasos vėžiui [34], aprašę kasos vėžinių ląstelių atsparumą
gemcitabinui [35], taip pat atlikę tyrimus, kas turi įtakos kasos vėžio jautrumui gemcitabinui [36].
Tačiau dar niekas nėra nustatęs, kokį poveikį gemcitabinas turi vežinių ląstelių energetikai – kaip
gemcitabinas veikia kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų endogeninį kvėpavimą, mitochondrijų
kvėpavimo greičius skirtingose metabolinėse būsenose, ar turi poveikį mitochondrijų vidinės ir
išorinės membranos pralaidumui. Todėl šio darbo tikslas ir buvo ištirti gemcitabino poveikį kasos
vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų funkcijoms.
Nors gemcitabinu gydomas kasos vėžys, tačiau vis tiek pacientų mirtingumas, po diagnozės
nustatymo ir gydymo, išlieka didelis (dauguma neišgyvena ilgiau 1-erių metų) [37]. Mokslininkų
nustatyta, kad gemcitabino poveikis jaučiamas tik 20 % pacientų [38]. Tyrimai rodo, jog kasos vėžinės
ląstelės yra pakankamai atsparios gemcitabino poveikiui. Jautrausios buvo SU.86.86. Nustatyta IC50
šioje vėžinių ląstelių linijoje 25 µg/ml, tuo tarpu kai MIAPaCa-2 ląstelių linijoje ji buvo dvigubai
didesnė (50 µg/ml). Capan-1 ir Capan-2 buvo atspariausios gemcitabino poveikiui. Capan-1 ląstelių
linijai, kad pasiekti IC50, reikėjo panaudoti gemcitabiną mikrograminės koncentracijos, o Capan-2
ląstelių linijai IC50 pasiekti nepavyko, pasiekta tik IC40. Lyginant kontrolinių (be gemcitabino) ląstelių
gyvybingumą, mažiausiai negyvų ląstelių nustatyta MIAPaCa-2 ir SU.86.86 vėžinių ląstelių linijose.
Veikiant gemcitabinui, tirtomis sąlygomis jų gyvybingumas sumažėjo apie 2,1 – 2,8 karto, o Capan-1
ląstelių linijos gyvybingumas sumažėjo tik 1,2 karto.
Mūsų atlikto tyrimo metu, gemcitabinas neslopino endogeninio kvėpavimo greičio nei vienoje
kasos vėžio ląstelių linijoje, o MIAPaCa-2 ir SU.86.86 endogeninis kvėpavimo greitis buvo netgi
didesnis, lyginant su kontrolinėmis grupėmis. Tai gali būti susiję su mitochondrijų dydžio, tūrio ar
kiekio padidėjimu kasos vėžinių ląstelių linijose, jas paveikus gemcitabinu. Tokias pat prielaidas kelia
ir kiti mokslininkai atlikę tyrimus su kitomis vėžinėmis ląstelėmis, paveiktomis gemcitabinu [39].
Reikalingi tolimesni tyrimai, nustatyti, kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų dydžio ar kiekio
pasikeitimus, šias paveikus gemcitabinu.
Nustatėme, kad mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas (KKK), rodantis
mitochondrijų kokybę, veikiant gemcitabinui ir oksiduojant glutamatą/malatą sumažėjo visose ląstelių
linijose (13-35 %), išskyrus Capan-2, tai rodo mitochondrijų funkcijos slopinimą MIAPaCa-2, Capan-
1 ir SU.86.86 ląstelių linijose. Oksiduojant sukcinatą, buvo slopinamas mitochondrijų kvėpavimo
kontrolės koeficientas MIAPaCa-2 ir Capan-1 vėžinėse ląstelių linijose apie 32 %. Tačiau visi
kvėpavimo greičiai, veikiant gemcitabinui, nebuvo slopinami, o priešingai, jie nustatyti netgi padidėję,
lyginant su kontrolinėmis grupėmis. Tai leidžia manyti, kad tai gali būti siejama su mitochondrijų
40
biogeneze. Kitų mokslinių tyrimų autoriai nustatė, kad gemcitabinas kombinacijoje su siRNR ir TK2
smažina mitochondrijų membranos potencialą, slopina funkcijas ir aktyvumą [40].
Gemcitabino poveikio išorinei mitochondrijų membranai įtakos neturėjo. Nei vienoje ląstelių
linijoje nebuvo pastebėtas išorinės membranos pažeidimas, kadangi citochromo c pridėjimas nedidino
mitochondrijų kvėpavimo greičio. Taigi, išorinė membrana liko intaktiška. Kiti tyrėjai patvirtina mūsų
gautus rezultatus. Jie nustatė, kad citochromo c testas, naudojamas ištirti išorinės membranos
intaktiškumui leukemijos ląstelėse, parodė, kad, veikiant gemcitabinui, išorinė membrana išlieka
nepažeista [39].
Veikiant gemcitabinui, galimą vidinės mitochondrijų membranos pralaidumo padidėjimą rodo
mitochondrijų kvėpavimo greičio ketvirtoje metabolinėje būsenoje padidėjimas, užslopinus ADP
patekimą atraktilozidu, tai stebima MIAPaCa-2 ir Capan-1 ląstelių linijose (~30 % padidėjimas). Tuo
metu SU.86.86 ir Capan-2 vėžinių ląstelių linijose vidinės mitochondrijų membranos, veikiant
gemcitabinui, išlieka intaktiškos. Taigi, atlikti tyrimai rodo, jog gemcitabino poveikiui atspariausios
yra Capan-2 ir SU.86.86 ląstelės, tuo metu MIAPaCa-2 ir Capan-1 ląstelėse stebimas (iki 30 %)
mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientų slopinimas.
Nustatyta, kad veikiant gemcitabinui, mitochondrijų kvėpavimo greitis nei oksiduojant
glutamatą/malatą, nei sukcinatą, neslopinamas. Priešingai, MIAPaCa-2, Capan-1 ir SU.86.86 ląstelėse
jis yra netgi ~2 kartus didesnis nei kontrolinėje (be gemcitabino) grupėje. Mitochondrijų kvėpavimo
greičio padidėjimas gali būti siejamas su mitochondrijų kiekio vėžinėse ląstelėse padidėjimu bei
mitochondrijų biogeneze: mitochondrijų DNR koduojamų baltymų pokyčiais mitochondrijose,
replikacija, mitochondrijų kiekio, dydžio ir tūrio pasikeitimais. Tyrimai su leukeminių ląstelių
linijomis [39], taip pat rodo, kad gemcitabinas veikia mitochondrijų biogenezę (didina mitochondrijų
endogeninį kvėpavimą), dėl pokyčių ląstelių dydyje ar mitochondrijų kiekyje. Tai gali sąlygoti ląstelės
fermentų kiekio ir/ar aktyvumo pokyčius, veikiant gemcitabinui. Detalesniam mechanizmo
išsiaiškinimui reikalingi tolimesni tyrimai.
41
7. IŠVADOS
1. Tiriant kasos vėžinių ląstelių (Capan-1, Capan-2, SU.86.86, MIAPaCa-2) linijas
nustatyta, kad gemcitabinas neslopino endogeninio kvėpavimo greičio nei vienoje tirtoje kasos vėžio
ląstelių linijoje, o MIAPaCa-2 ir SU.86.86 ląstelėse endogeninis kvėpavimo greitis buvo didesnis 2,4 ir
1,5 karto, lyginant su kontrolinėmis (nepaveiktomis gemcitabinu) grupėmis.
2. Gemcitabinas apie 2 kartus padidino mitochondrijų kvėpavimo greitį MIAPaCa-2,
Capan-1 ir SU.86.86 ląstelėse oksiduojant glutamatą/malatą ir sukcinatą, galimai dėl poveikio
mitochondrijų biogenezei. Gemcitabinas turėjo slopinamąjį poveikį MIAPaCa-2, Capan-1 bei
SU.86.86 kasos vėžinių ląstelių linijų mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientams (nuo 35 % iki
14 %), oksiduojant glutamatą/malatą ir 32 % oksiduojant sukcinatą. Atspariausios gemcitabino
poveikiui buvo Capan-2 kasos vėžinės ląstelės.
3. Mitochondrijų išorinė membrana buvo intaktiška tiek kontrolinių (be gemcitabino)
vėžinių ląstelių linijose, tiek paveikus gemcitabinu. Mitochondrijų vidinės membranos pralaidumo
padidėjimas, veikiant gemcitabinui, nustatytas šiose ląstelių linijose: MIAPaCa-2, Capan-1.
Gemcitabinas nedidino mitochondrijų vidinės membranos pralaidumo SU.86.86 ir Capan-2 vėžinių
ląstelių linijose.
42
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Li C., Heidt D. G., Dalerba P., Burant C. F., Zhang L., Adsay V., Wicha M., Clarke M. F.,
Simeone D. M. Identification of Pancreatic Cancer Stem Cells. Cancer Res. 2007; 67: (3).
2. Neureiter M., Jäger D., Ocker T., Kiesslich M.T. Epigenetics and pancreatic cancer:
Pathophysiology and novel treatment aspects. World J Gastroenterol, 2014 June 28, 20(24): p. 7830 –
7848.
3. An S.G, Kim D.U, Song G.A, Jang A.L. Prognostic Factors in Patients with Advanced
Pancreatic Cancer Treated with Gemcitabine Chemotherapy: Clinical Characteristics of Long-term
Survivors. Korean J Gastroenterol. 2014 Dec 25;64(6):356 – 63.
4. Brasiūnienė B., Brasiūnas V., Barauskas G., Juozaitytė E. Molekuliniai kasos vėžio
patogenezės ir prognozės faktoriai. Medicina (2003) 39 tomas, Nr. 7. p. 631 – 636.
5. U.S. department of health and human services. National Institutes of Health. National
Cancer Institute. What You Need To Know About Cancer of the Pancreas. NIH Publication No.10 -
1560, May 2010.
6. Cascinu S., Falconi M., Valentini V., Jelic S. Pancreatic cancer: ESMO Clinical Practice
Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology 21 (Supplement 5), 2010, p. 55
– 58.
7. American cancer society. Pancreatic cancer survival rates, by stage. 2016. [žiūrėta 2015 -
10 - 15] Prieiga per internetą: http://www.cancer.org/cancer/pancreaticcancer/detailedguide/pancreatic-
cancer-survival-rates
8. Ashraf Q. M., Mishra O. P., Delivoria-Papadopoulos M. Mechanisms of Expression of
Apoptotic Protease ActivatingFactor – 1 (Apaf – 1) in Nuclear, Mitochondrial and Cytosolic Fractions
of the Cerebral Cortex of Newborn Piglets. NeurosciLett., 2007 March 30, 415(3): p. 253 – 258.
9. Gataveckaitė D., Jakštaitė A., Dambrauskas Ž. Kasos adenokarcinomos ląstelių in vitro
atsakas į chemoterapinį vaistą gemcitabiną, nuslopinus HuR geno raišką. Studentų mokslinė praktika.
Mokslininkų ir kitų tyrėjų kvalifikacijos tobulinimas, mobilumo ir studentų mokslinių darbų
skatinimas, 2014, p. 27.
10. Lopes R. B., Gangeswaran R., McNeish I. A., Yaohe Wang and Nick R. Lemoine.
Expression of the IAP protein family is dysregulated in pancreatic cancer cells and is important for
resistance to chemotherapy. Int J Cancer. 2007 Jun 1;120(11):2344 – 52.
11. McConkey D. J., Choi W., Fournier K., Marquis L., Ramachandran V., Armugam T.
Molecular Characterization of Pancreatic Cancer Cell Lines Pancreatic Cancer , 2010. p. 458 – 466.
12. European Pharmacopoeia. 7th edition. Strasbourg: EuropeanCommission; 2010, p. 2088
– 2089.
43
13. Mini E., Nobili S., Caciagli B., Landini I., Mazzei T. Cellular pharmacology of
gemcitabine. Annals of Oncology 17 (Supplement 5): 2006, p. 7 – 12.
14. Yang M. H., Lee K. T., Yang S., Lee J.K., Lee K.H., Rhee J.C. KML001 Enhances
Anticancer Activity of Gemcitabine Against Pancreatic Cancer Cells. Anticancer Res. 2015 Jan;35(1):
p. 183-9.
15. Rathos M. J., Joshi K., Khanwalkar H., Manohar S. M., Joshi K. S. Molecular evidence
for increased antitumor activity of gemcitabine in combination with a cyclin-dependent kinase
inhibitor, P276-00 in pancreatic cancers. J Transl Med. 2012 Aug 8;10:161.
16. An S. G., Kim D. U., Song G.A., Jang A. L. Prognostic Factors in Patients with
Advanced Pancreatic Cancer Treated with Gemcitabine Chemotherapy: Clinical Characteristics of
Long-term Survivors. Korean J Gastroenterol. 2014 Dec 25;64(6):356-63.
17. Schniewind B., Christgen M., Kurdow R., Haye S., Kremer B., Kalthoff H., Ungefroren
H. Resistance of pancreatic cancer to gemcitabine treatment is dependent on mitochondria-mediated
apoptosis. International Journal of Cancer , Volume 109, Issue 2, 20 March 2004, p.182 – 188.
18. Freya T. G., Mannellab C. A. The internal structure of mitochondria.Volume 25, Issue 7,
1 July 2000, p. 319 – 324.
19. Djafarzadeh R., Wainer G., Mussivand T. DEVS Modeling and Simulation of the
Cellular Metabolism by Mitochondria. Molecular Simulation. Volume 36, Issue 12, 2010.
20. Cooper G. M. Mitochondria, The Cell, 2nd edition. A Molecular Approach, 2000.
21. Prieiga per intenetą: http://gamta.vdu.lt/bakalaurai/lab_darbai/biochemija/Bioch3.pdf
22. Prieiga per internetą: http://www.namrata.co/category/biological-oxidation/
23. Naučienė Z., Žūkienė R., Mildažienė V. Mitochondrijų biochemijos laboratoriniai darbai.
Mokymo priemonė studentams Prieiga per internetą:
<http://www.bchi.lt/LBD/saitas/files/mkitoch.pdf>
24. Carew J. S., Huang P. Mitochondrial defects in cancer. Mol Cancer. 2002 Dec 9;1:9.
25. Cooper G. M., Hausman R. E. The Cell: Molecular Aprroach: Fourth Edition.
Washington: ASM Press; 2007. p. 457 – 495.
26. Sun F., Huo X., Zhai Y. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein
complex II. Cell 2005;121:1043 – 57.
27. Schultz B. E., Chan S. I. Structures and proton-pumping strategies of mitochondrial
respiratory enzymes. Annual review of biophysics and biomolecular structure 2001;30:23-65.
28. Kadziauskas J. Biochemijos pagrindai. Vilnius: Vilniaus universiteto leidiniai; 2012. p.
322-323; 417-440.
44
29. DeBerardini R. J., Lum J. J., Hatzivassiliou G., Thompson C. B.,The biology of
cancer:metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation, Cell Metabolism, vol. 7, no. 1,
2008, p. 11 – 20.
30. Chiaradonna F., Moresco R. M., Airoldi C., Gaglio D., Palorini R., Nicotra F.
Fromcancer metabolism to new biomarkers and drug targets, Biotechnology Advances, vol. 30, no.1,
2012.p. 30 – 51.
31. Bonnet S., Archer S. L., Allalunis – Turner J. A mitochondria-K+ channel axis is
suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth, Cancer
Cell, vol. 11, no. 1, 2007, p. 37–51.
32. Palorini R., Simonetto T., Cirulli C., Chiaradonna F. Mitochondrial Complex I Inhibitors
and Forced Oxidative Phosphorylation Synergize in Inducing Cancer Cell Death, International Journal
of Cell Biology. Volume 2013, Article ID 243876, p. 14. Prieiga per internetą:
http://dx.doi.org/10.1155/2013/243876
33. Viale A., Corti D., Draetta G. F. Tumors and Mitochondrial Respiration: A Neglected
Connection, Cancer Research September 3, 2015 p.1 – 5.
34. Andrew D., Jacobs M. D. Gemcitabine-based therapy in pancreas cancer, Cancer,
Volume 95, Issue Supplement 4, 15 August 2002, p. 923–927.
35. Li1 Y., Timothy G., Boom V., Kong1 D., Wang Z., Ali S., Philip P. A., Sarkar F.H. Up-
regulation of miR-200 and let-7 by Natural Agents Leads to the Reversal of Epithelial-to-
Mesenchymal Transition in Gemcitabine-Resistant Pancreatic Cancer Cells. Cancer Reasearch. August
4, 2009. P. 6704-6712.
36. Ali S., Ahmad A., Banerjee S., Padhye S., Dominiak K., Schaffert J. M., Wang Z., Philip
P. A., Fazlul H. Sarkan F. H. Gemcitabine Sensitivity Can Be Induced in Pancreatic Cancer Cells
through Modulation of miR-200 and miR-21 Expression by Curcumin or Its Analogue CDF. Cancer
Reasearch. April 13, 2010.
37. Simon S. Abraxane plus Gemzar Combination Improves Pancreatic Cancer Survival.
Pancreatic Cancer. November 4, 2013.
38. Sylvia S. W. Ng., Tsao M. S., Chow S., Hedley D. W. Inhibition of Phosphatidylinositide
3-Kinase Enhances Gemcitabine-induced Apoptosis in Human Pancreatic Cancer Cells. Cancer
reasearch. 60, 5451–5455, October 1, 2000.
39. Rennera K., Ambergera A., Konwalinkab G., Koflera R., Gnaiger E. Changes of
mitochondrial respiration, mitochondrial content and cell size after induction of apoptosis in leukemia
cells“. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. Volume 1642, Issues 1–2, 23
September 2003, p. 115 – 123.
45
40. Cresce C. D., Figueredo R., Rytelewski M., Vareki S. V., Colin Way C., Ferguson P.
J., Vincent M. D., Koropatnick J. siRNA knockdown of mitochondrial thymidine kinase 2 (TK2)
sensitizes human tumor cells to gemcitabine. Oncotarget. 2015 Sep 8; 6(26): 22397 – 22409.
Recommended