Molecular genetics

Molecular Genetics

Objectives

1. สรปุหลกัฐานที่แสดงใหเ้หน็วา่ DNA เปน็สารพนัธกุรรม

2. อธบิายและเขยีนแผนภาพแสดงลกัษณะทางกายภาพและ

โครงสรา้งทางเคมขีอง nucleic acid

3. อธบิายและเขยีนแผนภาพแสดงกระบวนการ DNA replication

4. เปรยีบเทยีบการจดัระเบยีบของ DNA บนโครโมโซมของ

prokaryote และ eukaryote

5. สรปุการสง่ผา่น genetic information ภายในเซลลจ์าก gene ถึง

protein

6. เปรยีบเทยีบโครงสรา้งและบทบาทภายในเซลลข์อง DNA,

mRNA, tRNA และ rRNA

7. อธบิายและเขยีนแผนภาพแสดงกระบวนการ transcription และ

translation

DNA replication

สมมตฐิานของ Watson & Crick

ก่อนที่ DNA replication พนัธะไฮโดรเจน

ที่จบัคูก่นัระหวา่ง polynucleotide 2 strands

จะถูกท าลายและคลายเกลยีว แยกออกจากกนั

แตล่ะ strand ของ polynucleotide ท าหนา้ที่

เปน็ template ส าหรบัสรา้ง strand ใหมข่ึน้มา

เรยีกสมมตฐิานนี้วา่ semiconservative type

หรือ complementary type

DNA replication

DNA replication components;

1. Helicase; ท าลาย H bound ที่เกิดจากการจบัคูก่นัของเบส A

กบั T และ C กบั G เพื่อให ้double strand เปน็ single strand

DNA

2. ssDNA binding protein; จบักบั ssDNA เพื่อปอ้งกันไมใ่หม้า

จบักนัเปน็ dsDNA

3. DNA gyrase (topoisomerase); คลายปมทีอ่ยู่เหนือจดุแรก

ของเกลยีวคู ่

4. primase; สงัเคราะห ์RNA primer

5. 5’->3’ exonuclease; ตดั nucleotide จากปลายดา้น 5’-PO4

ไปยงัดา้น 3’-OH

DNA replication

DNA replication

DNA replication components;

6. 3’->5’ exonuclease; ตดั nucleotide molecule จากปลาย

ดา้น 3’-OH ไปยงัดา้น 5’-PO4

7. Endonuclease; ท าลาย ester bound ท าให ้DNA ถกูตดั เกดิ

ปลาย 3’-OH และปลาย 5’-PO4 รอยขาด เรยีกวา่ nick

8. DNA ligase; เชื่อมต่อปลาย 3’-OH กบัปลาย 5’-PO4 ดว้ย

ester bound (close nick)

9. DNA polymerase;

DNA replication

1

2

3

Initiation point

4

5

67

DNA replication

DNA replication; 5’->3’

• Unidirectional replication: การจ าลองโมเลกลุแบบทิศทางเดยีว

• bidirectional replication: การจ าลองโมเลกุลแบบ 2 ทิศทาง พบใน

prokaryote และ eukaryote

Unidirectional replication bidirectional replication

ความสมัพนัธร์ะหว่าง DNA,

RNA และโปรตีน

โมเลกลุ หน้าทีก่ารท างาน

สมบัติทางกายภาพและเคมี

ความ

เสถยีร

โครงสรา้ง หน่วยย่อย ความหลากหลาย

ทางเคมี

จ านวน

โมเลกลุใน

เซลล์

DNA บรรจขุ้อมลู

พันธกุรรมระยะยาว

สูง สายคู่ ยาว

ขดแน่น

เบส 4 ชนดิ ต่ า น้อย

RNA บรรจขุ้อมลู

พันธกุรรมระยะสั้น

ต่ า สายเดีย่ว

สั้นเคลื่อนที่

สะดวก

เบส 4 ชนดิ ต่ า มาก

โปรตนี เปน็โครงสร้างและ

เปน็ตัวท างานหลกั

มีหลาย

ระดับ

หลากหลาย

ซบัซ้อน

กรดอะมโิน

20 ชนิด

สูง มาก

ตารางแสดงความสอดคลอ้งระหวา่งหนา้ทีก่ารท างานและสมบตัทิาง

กายภาพและเคมขีอง DNA RNA และโปรตนี

Central Dogma

DNA

replication

RNA

Protein

transcription

translation

Reverse

transcription

• กระบวนการสร้างโปรตนีม ี2 กระบวนการหลกัคอื

- TRANSCRIPTION (การลอกรหสั)

- TRANSLATION (การแปลรหสั, การถอดรหสั)

• กระบวนการ transcription จดัเปน็ gene expression เนือ่งจากยนีมี

การท าหนา้ที่

Gene Expression

การแสดงออกของยนี เปน็การทีย่นีใดๆ มกีารท าหนา้ทีไ่ปจนถงึ

กระบวนการสรา้งโปรตีน

Gene Expression

Gene Expression

คอื การลอกรหัสจาก DNA เพื่อสังเคราะหส์าย RNA

• RNA ที่ถกูสงัเคราะห์หลกั ๆ คอื

• rRNA

• mRNA

• tRNA

Transcription

การสงัเคราะห ์RNA จ าเปน็ตอ้งมี:

1. DNA template

2. RNA polymerase

3. Nucleotides: ATG, UTG, CTG, GTG

Transcription

5’ 3’

3’ 5’

coding strand

anti-coding strand

non-coding strand

DNA template

สาย mRNA มลี าดบัเบสเหมอืนสาย DNA coding เพราะ

คดัลอกมาจาก DNA สายที่เปน็ anti-coding ซึ่งถกูเรยีกวา่ DNA

template

Complementary

Transcription

บรเิวณทีจ่ะ transcribe บน DNA template ประกอบดว้ย 3 สว่นหลกั

คอื

• Promoter: ส าหรบั eukaryote เหนอื start site 25 bp. เรยีกวา่

Hogness box (TATAAAAG) ส าหรบั prokaryote เรยีก

Pribnow box (TATAATG) โดยทัว่ไปอาจเรยีกวา่ TATA box

• Gene content: Exon and Intron

• Terminator: AATAAA อกี 20 bp. Stop transcribe

promoter gene content terminator

ORF

Transcription

1. Initiation การเขา้เกาะของ RNA polymerase ที ่promoter

2. Elongation การสรา้งสาย RNA ใหย้าวออกไปอยา่งตอ่เนื่อง

3. Termination การเคลือ่นตวัไปถงึ terminator point จนหลดุ

ออกไปของ RNA polymerase ไปจนสิน้สุดการลอกรหสั

เกิดขึน้บริเวณ nucleus ม ี3 ขัน้ตอน

Transcription

• Promoter

• Start point

• Termination point

• Terminator

http://kentsimmons.uwinnipeg.ca/cm1504/proteinsynth.htm

Transcription

Prokaryote เมื่อ transcription แลว้ mRNA ที่ได้จะถกู

modified โดยการเตมิ 5’-Cap และ 3’- Poly (A) tail

กอ่นที่จะไป translate ที่ ribosome

Eukaryote เมือ่ transcription แลว้ mRNA ที่ได้

นอกจากจะถกู modified โดยการเติม 5’-Cap และ 3’-

Poly (A) tail เชน่เดยีวกบัใน prokaryoteแลว้ ยงัมี

กระบวนการตัดสว่นของ intron ออกอกีกระบวนการหนึ่ง

ด้วย

mRNA processing

1. 7-methyl guanosine was capped at 5’

2. Added poly A at 3’

3. Intron sequens are spiced out of pre-mRNA

4. Exon is joined by phosphodiester bond

mature mRNA transfer to cytoplasm for protein

translation

mRNA processing

prokaryote

eukaryote

mRNA processing

RNA polymerase I + Transcription unit = rRNA

RNA polymerase II + Transcription unit = mRNA

RNA polymerase III+ Transcription unit = tRNA

rRNA + ribosomal protein = ribosome

mRNA + ribosome + aminoacyl tRNAs = translation

tRNA + amino acid = aminoacyl tRNA

Transcription Product

Eukaryote มีน้ าหนัก 80S ประกอบดว้ย 2 subunits คือ small

subunit หนัก 40S และ large subunit หนัก 60S

Prokaryote มีน้ าหนัก 70S ประกอบดว้ย 2 subunits คือ

small subunit หนัก 30S และ large subunit หนัก 50S

Ribosome

Ribosome

Translation

กระบวนการแปลรหสั หรอืถอดรหัสจาก mRNA ไปเป็นสาย

polypeptide

Translation เป็นกระบวนการที่เกิดใน cytoplasm

เกิดขึ้นได้เมื่อม ี:

-mRNA

-aminoacyl tRNA

-ribosome

Translation

Genetic code

1. รหสัพนัธกุรรม 1 รหสั ประกอบดว้ยเบส 3 เบส (triple code or codon)

2. รหสัพนัธกุรรมไมม่กีารเหลือ่มซอ้นกนั (non overlapping)

3. รหสัพนัธกุรรมไมม่กีารเวน้หรอืขา้มเบสระหวา่งพนัธกุรรม (commaless)

4. รหสัพนัธกุรรมหลายรหสัสามารถก าหนดกรดอะมโินตวัเดยีวกนั (degenerate

code)

5. รหสัพนัธกุรรมบางรหสัสามารถก าหนดกรดอะมโินไดห้ลายตวั (ambiguous

code)

6. รหสัพนัธกุรรมบางรหสัไมท่ าหนา้ทีก่ าหนดกรดอะมโินตวัใดเลย (nonsense

codon)

7. รหสัพนัธกุรรมทีก่ าหนดกรดอะมโินแตล่ะชนดินัน้ จะเหมอืนกนัในสิง่มชีวีติทกุ

ชนดิ (universal code)

8. Translation 5’(PO4)->3’(OH)

3 bases = 1 codon

• Start codon: AUG

• Stop codon: UAA,

UAG, UGA

1 codon : Met, Trp

Genetic code

Protein Synthesis

1. Transcription:

- RNA synthesis (DNA template, RNA

polymerase)

- Nucleus

2. Translation: Polypeptide, Ribosome, Cytoplasm

- amino acid activation reaction

- initiation of polypeptide chain

- elongation cycle

- termination of peptide chains

Translation

กระบวนการแปลล าดบัของเบสของ mRNA ให้เปน็ล าดบั

ของ amino acid ที่ตอ่กนัเปน็ polypeptides

• amino acid activation reaction

• initiation of polypeptide chain

• elongation cycle

• termination of peptide chains

Amino Acid Activation Reaction

• cytoplasm

• aminoacyl-tRNA synthetase or amiacyl-tRNA

ligase

การกระตุน้ให ้amino acid ตอ่กบั tRNA

Amino acid + tRNA + ATP aminoacyl-tRNA + AMP + PPiMg2+

Amino Acid Activation Reaction

Initiation of polypeptide chain

• Start codon: AUG (N-formyl methionyl-tRNA or f met-

tRNA)

• ribosome; 50s and 30s

• Initiation Factor (IF); IF1 IF2 and IF3

• mRNA

• peptidyl site or P-site of ribosome

1. ribosome 30s + IF3 ribosome

30s IF3 complex IF1 complex

2. f met-tRNA-GTP + IF2 + ribosome

30s IF3 IF1 + mRNA = initiation

complex

3. initiation complex + ribosome 50s =

ribosome70s (GTP)

IF1

Initiation of polypeptide chain

Elongation cycle

Amino acid ต่อกนัเปน็ polypeptide

• Aminoacyl site or

A-site

• EF-T; EF-Ts & EF-Tu

• peptide bond

• peptidyl transferase

• do not use GTP

Termination of polypeptide chain

• A-site: UAA, UAG or UGA

• RF: RF1 & RF2 (prokaryote), eRF (eukaryote)

5’ 3’

promoter terminator

5’ 3’

amino group ของ Met

start codon stop codon

start point terminator point

carboxylic group

NH2 COOH

Transcription and translation

Amino acid

-ประกอบดว้ย อะตอมคารบ์อนอยูต่รงกลางที่ต่อเขา้กบัอะตอมโดย

ใช ้covalent bond 4 bonds โดยมปีลายดา้นหนึง่ตอ่อยูก่บั

carboxyl group (COOH) และอกีดา้นหนึง่ต่อกบั Amino group

(NH2)

- พบในธรรมชาต ิ20 ชนดิ

- เชือ่มต่อกนัดว้ย peptide bond

- polypeptide มากกวา่ 1 สายประกอบกนัเปน็ protein

Denaturation

Renaturation

BIOTECHNOLOGY

• ความหมายและความส าคญัของเทคโนโลยชีวีภาพ

Biotechnology = Bio + Technology

BIOTECHNOLOGY (Cont.)

• ความหมายและความส าคญัของเทคโนโลยชีวีภาพ

- เปน็เทคนคิกระบวนการหรือการใชส้ิง่มีชวีติ และส่วนประกอบของ

สิง่มชีีวติ เพือ่ปรบัปรุงและพัฒนาทางการเกษตร อาหาร การแพทย ์

และสิง่ตา่งๆทีผ่ลติเปน็อตุสาหกรรม

- เป็นการประยกุตใ์ชห้ลกัฐานของวทิยาศาสตรแ์ละวิศวกรรมศาสตร์

ในกระบวนการผลติ โดยใชส้ารทางชวีภาพ เพือ่ใหไ้ดส้นิคา้ในระบบ

อตุสาหกรรม และเปน็การเพิ่มมลูคา่ของสินคา้ดว้ย

Why do we need ‘BIOTECHNOLOGY’??

เพื่อหาทางแกป้ญัหาส าคญัที่โลกก าลงัเผชญิอยู่ ได้แก่

• เกษตรกรรม

• อาหาร

• การแพทย ์

• เภสชักรรม และ

• สิง่แวดล้อม

Biotechnology

พันธวุศิวกรรม คอื

เทคนคิการตดัตอ่ยนีจากสิง่มชีวีติชนดิหนึ่ง หรือหลายชนดิแลว้

ถา่ยเทใหก้บัสิง่มชีีวติชนดิเดยีวกนั หรือตา่งชนดิกนั

เทคนคิพนัธวุิศวกรรมประกอบดว้ย 4 ขัน้ตอน ดงันี้

1. การแยกยนีทีส่นใจ (gene of interest)

2. เพิ่มปรมิาณยนีทีส่นใจดว้ยเทคนคิ PCR

3. น าชิ้นสว่นยนีที่แยกไดไ้ปตอ่กบัพาหะ (vector)

4. การโคลนยนี (gene cloning)

5. ถา่ย recombinant DNA ใสใ่นสิง่มชีวีติเปา้หมาย

Genetic Engineering

Genetic Engineering

ProkaryoticVectors

Plasmid

• เป็นดเีอ็นเอที่อยูน่อก

โครโมโซม

• พบในแบคทีเรยีหลายชนดิ

• โครงสรา้งเปน็ดเีอน็เอวง

แหวนเกลยีวคู่

• สามารถจ าลองตวัเองได้

• lambda phage

• cosmid

• M13 phage

• shuttle vector

ProkaryoticVectors

Restriction Enzymes

• เอนไซมต์ดัจ าเพาะจะตดัดเีอน็เอทีต่ าแหนง่จดจ า ในลกัษณะทีเ่รยีกวา่ palindrome

• การเรยีกชือ่เอนไซมไ์ดม้าจาก genus name และ species name โดยใชร้ะบบ

อกัษร 3 ตวั พมิพต์วัเอน

Cut EndsBlunt ends

Sticky ends

: เทคนคิทีท่ าใหเ้กิดการรวมตวักนัของสารพนัธกุรรมในสภาพ

หลอดทดลองประกอบดว้ย

1. ใช้ restriction enzyme ตัดโมเลกลุ DNA ใหไ้ด้ target DNA

2. เชือ่มตอ่ชิน้ DNA เขา้กบั vector โดยเทคนคิ ligation

3. สอดแทรก recombinant DNA molecule เขา้ไปใน host ทีท่ าให้

recombinant DNA molecule เพิ่มจ านวนได้

Recombinant DNA technique

DNA digestion

DNA ligation

Transformation

Transformation Screening

White blue colony screening

12

1. การตรวจสอบวา่พลาสมดิ

เขา้สูแ่บคทเีรยีหรอืไม่

2. การคดัเลอืกเซลล์

แบคทเีรยีที่มดีเีอน็เอสาย

ผสม

Blue Roses

http://www.isaaa.org/Kc/inforesources/biotechcro

ps/The_Golden_Rice_Technology.htm

Golden Rice

สิ่งมชีีวติดัดแปลงพันธุกรรม

GMOs / LMOs

- Genetically Modified Organisms (GMOs)- Living Modified Organisms (LMOs)- Transgenic plant- Transgenic animal

เทคนคิทางพนัธุวศิวกรรม (genetic

engineering)

การยา้ยยนีเขา้สูพ่ชืทางพันธวุิศวกรรมสามารถแบ่ง

ไดเ้ปน็ 2 วิธดีังนี้

1. การย้ายยีนโดยใช ้Agrobacterium tumerfaciens เปน็พาหะ

2. การย้ายยีนโดยไมต่อ้งใชพ้าหะ

ที่มา:

https://www.msu.edu/course/is

b/202/ebertmay/2004/notes/in

otes/02_28_06_bghuman.html

การยา้ยยนีเข้าสูพ่ืช

ทางพนัธวุศิวกรรม

เทคนคิทางพนัธุวศิวกรรมในสัตว์

(genetic engineering)

พันธวุิศวกรรมในสตัวส์ามารถแบ่งไดเ้ปน็ 3 วิธดีงันี้

1. DNA microinjection

2. Embryonic stem cell (homologous

recombination)

3. การถา่ยยนีโดยใช ้Retrovirus (SV 40)

Polymorphism

คอื ความแตกตา่งของรปูแบบพนัธกุรรมมากกวา่ 1

แบบขึน้ไป ความแตกตา่งที่เกิดขึน้นีจ้ะตอ้งมคีวามถีไ่ม่

น้อยกวา่ 1 เปอร์เซ็นต ์โดยปกตคิวามแตกตา่งทีเ่กิดขึน้ม ี

3 ระดบั คอื

1. ระดบัโครโมโซม

2. ระดบัยนี

3. ระดบัความยาวของชิน้สว่นดีเอ็นเอเมือ่ตดัดว้ย

เอนไซมต์ดัจ าเพาะ

ประโยชนข์องเทคนิคพนัธุวศิวกรรม

Genetic Engineering

1. ดา้นการแพทย:์ ผลติinsulin, growth hormone,

vaccine และ gene theraphy (โรคภมูิคุม้กนั

บกพร่อง (SCID)

2. ดา้นการเกษตร: transgenic plant, transgenic

animal

3. ดา้นอตุสาหกรรมและสภาพแวดลอ้ม: ผลติ

เชือ้จลุนิทรียพ์ันธุท์ี่มปีระสทิธภิาพสงูในการหมกั

อ.ดร.ภญิญารตัน ์ กงประโคน

สาขาทรพัยากรเกษตรชวีภาพ

คณะทรัพยากรธรรมชาตแิละอตุสาหกรรมเกษตร

มหาวทิยาลยัเกษตรศาสตร ์วทิยาเขตเฉลิมพระเกยีรต ิจังหวดัสกลนคร

ขอขอบคุณ