Upload
biobiome
View
313
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
Molecular Genetics
Objectives
1. สรปุหลกัฐานที่แสดงใหเ้หน็วา่ DNA เปน็สารพนัธกุรรม
2. อธบิายและเขยีนแผนภาพแสดงลกัษณะทางกายภาพและ
โครงสรา้งทางเคมขีอง nucleic acid
3. อธบิายและเขยีนแผนภาพแสดงกระบวนการ DNA replication
4. เปรยีบเทยีบการจดัระเบยีบของ DNA บนโครโมโซมของ
prokaryote และ eukaryote
5. สรปุการสง่ผา่น genetic information ภายในเซลลจ์าก gene ถึง
protein
6. เปรยีบเทยีบโครงสรา้งและบทบาทภายในเซลลข์อง DNA,
mRNA, tRNA และ rRNA
7. อธบิายและเขยีนแผนภาพแสดงกระบวนการ transcription และ
translation
DNA replication
สมมตฐิานของ Watson & Crick
ก่อนที่ DNA replication พนัธะไฮโดรเจน
ที่จบัคูก่นัระหวา่ง polynucleotide 2 strands
จะถูกท าลายและคลายเกลยีว แยกออกจากกนั
แตล่ะ strand ของ polynucleotide ท าหนา้ที่
เปน็ template ส าหรบัสรา้ง strand ใหมข่ึน้มา
เรยีกสมมตฐิานนี้วา่ semiconservative type
หรือ complementary type
DNA replication
DNA replication components;
1. Helicase; ท าลาย H bound ที่เกิดจากการจบัคูก่นัของเบส A
กบั T และ C กบั G เพื่อให ้double strand เปน็ single strand
DNA
2. ssDNA binding protein; จบักบั ssDNA เพื่อปอ้งกันไมใ่หม้า
จบักนัเปน็ dsDNA
3. DNA gyrase (topoisomerase); คลายปมทีอ่ยู่เหนือจดุแรก
ของเกลยีวคู ่
4. primase; สงัเคราะห ์RNA primer
5. 5’->3’ exonuclease; ตดั nucleotide จากปลายดา้น 5’-PO4
ไปยงัดา้น 3’-OH
DNA replication
DNA replication
DNA replication components;
6. 3’->5’ exonuclease; ตดั nucleotide molecule จากปลาย
ดา้น 3’-OH ไปยงัดา้น 5’-PO4
7. Endonuclease; ท าลาย ester bound ท าให ้DNA ถกูตดั เกดิ
ปลาย 3’-OH และปลาย 5’-PO4 รอยขาด เรยีกวา่ nick
8. DNA ligase; เชื่อมต่อปลาย 3’-OH กบัปลาย 5’-PO4 ดว้ย
ester bound (close nick)
9. DNA polymerase;
DNA replication
1
2
3
Initiation point
4
5
67
DNA replication
DNA replication; 5’->3’
• Unidirectional replication: การจ าลองโมเลกลุแบบทิศทางเดยีว
• bidirectional replication: การจ าลองโมเลกุลแบบ 2 ทิศทาง พบใน
prokaryote และ eukaryote
Unidirectional replication bidirectional replication
ความสมัพนัธร์ะหว่าง DNA,
RNA และโปรตีน
โมเลกลุ หน้าทีก่ารท างาน
สมบัติทางกายภาพและเคมี
ความ
เสถยีร
โครงสรา้ง หน่วยย่อย ความหลากหลาย
ทางเคมี
จ านวน
โมเลกลุใน
เซลล์
DNA บรรจขุ้อมลู
พันธกุรรมระยะยาว
สูง สายคู่ ยาว
ขดแน่น
เบส 4 ชนดิ ต่ า น้อย
RNA บรรจขุ้อมลู
พันธกุรรมระยะสั้น
ต่ า สายเดีย่ว
สั้นเคลื่อนที่
สะดวก
เบส 4 ชนดิ ต่ า มาก
โปรตนี เปน็โครงสร้างและ
เปน็ตัวท างานหลกั
มีหลาย
ระดับ
หลากหลาย
ซบัซ้อน
กรดอะมโิน
20 ชนิด
สูง มาก
ตารางแสดงความสอดคลอ้งระหวา่งหนา้ทีก่ารท างานและสมบตัทิาง
กายภาพและเคมขีอง DNA RNA และโปรตนี
Central Dogma
DNA
replication
RNA
Protein
transcription
translation
Reverse
transcription
• กระบวนการสร้างโปรตนีม ี2 กระบวนการหลกัคอื
- TRANSCRIPTION (การลอกรหสั)
- TRANSLATION (การแปลรหสั, การถอดรหสั)
• กระบวนการ transcription จดัเปน็ gene expression เนือ่งจากยนีมี
การท าหนา้ที่
Gene Expression
การแสดงออกของยนี เปน็การทีย่นีใดๆ มกีารท าหนา้ทีไ่ปจนถงึ
กระบวนการสรา้งโปรตีน
Gene Expression
Gene Expression
คอื การลอกรหัสจาก DNA เพื่อสังเคราะหส์าย RNA
• RNA ที่ถกูสงัเคราะห์หลกั ๆ คอื
• rRNA
• mRNA
• tRNA
Transcription
การสงัเคราะห ์RNA จ าเปน็ตอ้งมี:
1. DNA template
2. RNA polymerase
3. Nucleotides: ATG, UTG, CTG, GTG
Transcription
5’ 3’
3’ 5’
coding strand
anti-coding strand
non-coding strand
DNA template
สาย mRNA มลี าดบัเบสเหมอืนสาย DNA coding เพราะ
คดัลอกมาจาก DNA สายที่เปน็ anti-coding ซึ่งถกูเรยีกวา่ DNA
template
Complementary
Transcription
บรเิวณทีจ่ะ transcribe บน DNA template ประกอบดว้ย 3 สว่นหลกั
คอื
• Promoter: ส าหรบั eukaryote เหนอื start site 25 bp. เรยีกวา่
Hogness box (TATAAAAG) ส าหรบั prokaryote เรยีก
Pribnow box (TATAATG) โดยทัว่ไปอาจเรยีกวา่ TATA box
• Gene content: Exon and Intron
• Terminator: AATAAA อกี 20 bp. Stop transcribe
promoter gene content terminator
ORF
Transcription
1. Initiation การเขา้เกาะของ RNA polymerase ที ่promoter
2. Elongation การสรา้งสาย RNA ใหย้าวออกไปอยา่งตอ่เนื่อง
3. Termination การเคลือ่นตวัไปถงึ terminator point จนหลดุ
ออกไปของ RNA polymerase ไปจนสิน้สุดการลอกรหสั
เกิดขึน้บริเวณ nucleus ม ี3 ขัน้ตอน
Transcription
• Promoter
• Start point
• Termination point
• Terminator
http://kentsimmons.uwinnipeg.ca/cm1504/proteinsynth.htm
Transcription
Prokaryote เมื่อ transcription แลว้ mRNA ที่ได้จะถกู
modified โดยการเตมิ 5’-Cap และ 3’- Poly (A) tail
กอ่นที่จะไป translate ที่ ribosome
Eukaryote เมือ่ transcription แลว้ mRNA ที่ได้
นอกจากจะถกู modified โดยการเติม 5’-Cap และ 3’-
Poly (A) tail เชน่เดยีวกบัใน prokaryoteแลว้ ยงัมี
กระบวนการตัดสว่นของ intron ออกอกีกระบวนการหนึ่ง
ด้วย
mRNA processing
1. 7-methyl guanosine was capped at 5’
2. Added poly A at 3’
3. Intron sequens are spiced out of pre-mRNA
4. Exon is joined by phosphodiester bond
mature mRNA transfer to cytoplasm for protein
translation
mRNA processing
prokaryote
eukaryote
mRNA processing
RNA polymerase I + Transcription unit = rRNA
RNA polymerase II + Transcription unit = mRNA
RNA polymerase III+ Transcription unit = tRNA
rRNA + ribosomal protein = ribosome
mRNA + ribosome + aminoacyl tRNAs = translation
tRNA + amino acid = aminoacyl tRNA
Transcription Product
Eukaryote มีน้ าหนัก 80S ประกอบดว้ย 2 subunits คือ small
subunit หนัก 40S และ large subunit หนัก 60S
Prokaryote มีน้ าหนัก 70S ประกอบดว้ย 2 subunits คือ
small subunit หนัก 30S และ large subunit หนัก 50S
Ribosome
Ribosome
Translation
กระบวนการแปลรหสั หรอืถอดรหัสจาก mRNA ไปเป็นสาย
polypeptide
Translation เป็นกระบวนการที่เกิดใน cytoplasm
เกิดขึ้นได้เมื่อม ี:
-mRNA
-aminoacyl tRNA
-ribosome
Translation
Genetic code
1. รหสัพนัธกุรรม 1 รหสั ประกอบดว้ยเบส 3 เบส (triple code or codon)
2. รหสัพนัธกุรรมไมม่กีารเหลือ่มซอ้นกนั (non overlapping)
3. รหสัพนัธกุรรมไมม่กีารเวน้หรอืขา้มเบสระหวา่งพนัธกุรรม (commaless)
4. รหสัพนัธกุรรมหลายรหสัสามารถก าหนดกรดอะมโินตวัเดยีวกนั (degenerate
code)
5. รหสัพนัธกุรรมบางรหสัสามารถก าหนดกรดอะมโินไดห้ลายตวั (ambiguous
code)
6. รหสัพนัธกุรรมบางรหสัไมท่ าหนา้ทีก่ าหนดกรดอะมโินตวัใดเลย (nonsense
codon)
7. รหสัพนัธกุรรมทีก่ าหนดกรดอะมโินแตล่ะชนดินัน้ จะเหมอืนกนัในสิง่มชีวีติทกุ
ชนดิ (universal code)
8. Translation 5’(PO4)->3’(OH)
3 bases = 1 codon
• Start codon: AUG
• Stop codon: UAA,
UAG, UGA
1 codon : Met, Trp
Genetic code
Protein Synthesis
1. Transcription:
- RNA synthesis (DNA template, RNA
polymerase)
- Nucleus
2. Translation: Polypeptide, Ribosome, Cytoplasm
- amino acid activation reaction
- initiation of polypeptide chain
- elongation cycle
- termination of peptide chains
Translation
กระบวนการแปลล าดบัของเบสของ mRNA ให้เปน็ล าดบั
ของ amino acid ที่ตอ่กนัเปน็ polypeptides
• amino acid activation reaction
• initiation of polypeptide chain
• elongation cycle
• termination of peptide chains
Amino Acid Activation Reaction
• cytoplasm
• aminoacyl-tRNA synthetase or amiacyl-tRNA
ligase
การกระตุน้ให ้amino acid ตอ่กบั tRNA
Amino acid + tRNA + ATP aminoacyl-tRNA + AMP + PPiMg2+
Amino Acid Activation Reaction
Initiation of polypeptide chain
• Start codon: AUG (N-formyl methionyl-tRNA or f met-
tRNA)
• ribosome; 50s and 30s
• Initiation Factor (IF); IF1 IF2 and IF3
• mRNA
• peptidyl site or P-site of ribosome
1. ribosome 30s + IF3 ribosome
30s IF3 complex IF1 complex
2. f met-tRNA-GTP + IF2 + ribosome
30s IF3 IF1 + mRNA = initiation
complex
3. initiation complex + ribosome 50s =
ribosome70s (GTP)
IF1
Initiation of polypeptide chain
Elongation cycle
Amino acid ต่อกนัเปน็ polypeptide
• Aminoacyl site or
A-site
• EF-T; EF-Ts & EF-Tu
• peptide bond
• peptidyl transferase
• do not use GTP
Termination of polypeptide chain
• A-site: UAA, UAG or UGA
• RF: RF1 & RF2 (prokaryote), eRF (eukaryote)
5’ 3’
promoter terminator
5’ 3’
amino group ของ Met
start codon stop codon
start point terminator point
carboxylic group
NH2 COOH
Transcription and translation
Amino acid
-ประกอบดว้ย อะตอมคารบ์อนอยูต่รงกลางที่ต่อเขา้กบัอะตอมโดย
ใช ้covalent bond 4 bonds โดยมปีลายดา้นหนึง่ตอ่อยูก่บั
carboxyl group (COOH) และอกีดา้นหนึง่ต่อกบั Amino group
(NH2)
- พบในธรรมชาต ิ20 ชนดิ
- เชือ่มต่อกนัดว้ย peptide bond
- polypeptide มากกวา่ 1 สายประกอบกนัเปน็ protein
Denaturation
Renaturation
BIOTECHNOLOGY
• ความหมายและความส าคญัของเทคโนโลยชีวีภาพ
Biotechnology = Bio + Technology
BIOTECHNOLOGY (Cont.)
• ความหมายและความส าคญัของเทคโนโลยชีวีภาพ
- เปน็เทคนคิกระบวนการหรือการใชส้ิง่มีชวีติ และส่วนประกอบของ
สิง่มชีีวติ เพือ่ปรบัปรุงและพัฒนาทางการเกษตร อาหาร การแพทย ์
และสิง่ตา่งๆทีผ่ลติเปน็อตุสาหกรรม
- เป็นการประยกุตใ์ชห้ลกัฐานของวทิยาศาสตรแ์ละวิศวกรรมศาสตร์
ในกระบวนการผลติ โดยใชส้ารทางชวีภาพ เพือ่ใหไ้ดส้นิคา้ในระบบ
อตุสาหกรรม และเปน็การเพิ่มมลูคา่ของสินคา้ดว้ย
Why do we need ‘BIOTECHNOLOGY’??
เพื่อหาทางแกป้ญัหาส าคญัที่โลกก าลงัเผชญิอยู่ ได้แก่
• เกษตรกรรม
• อาหาร
• การแพทย ์
• เภสชักรรม และ
• สิง่แวดล้อม
Biotechnology
พันธวุศิวกรรม คอื
เทคนคิการตดัตอ่ยนีจากสิง่มชีวีติชนดิหนึ่ง หรือหลายชนดิแลว้
ถา่ยเทใหก้บัสิง่มชีีวติชนดิเดยีวกนั หรือตา่งชนดิกนั
เทคนคิพนัธวุิศวกรรมประกอบดว้ย 4 ขัน้ตอน ดงันี้
1. การแยกยนีทีส่นใจ (gene of interest)
2. เพิ่มปรมิาณยนีทีส่นใจดว้ยเทคนคิ PCR
3. น าชิ้นสว่นยนีที่แยกไดไ้ปตอ่กบัพาหะ (vector)
4. การโคลนยนี (gene cloning)
5. ถา่ย recombinant DNA ใสใ่นสิง่มชีวีติเปา้หมาย
Genetic Engineering
Genetic Engineering
ProkaryoticVectors
Plasmid
• เป็นดเีอ็นเอที่อยูน่อก
โครโมโซม
• พบในแบคทีเรยีหลายชนดิ
• โครงสรา้งเปน็ดเีอน็เอวง
แหวนเกลยีวคู่
• สามารถจ าลองตวัเองได้
• lambda phage
• cosmid
• M13 phage
• shuttle vector
ProkaryoticVectors
Restriction Enzymes
• เอนไซมต์ดัจ าเพาะจะตดัดเีอน็เอทีต่ าแหนง่จดจ า ในลกัษณะทีเ่รยีกวา่ palindrome
• การเรยีกชือ่เอนไซมไ์ดม้าจาก genus name และ species name โดยใชร้ะบบ
อกัษร 3 ตวั พมิพต์วัเอน
Cut EndsBlunt ends
Sticky ends
: เทคนคิทีท่ าใหเ้กิดการรวมตวักนัของสารพนัธกุรรมในสภาพ
หลอดทดลองประกอบดว้ย
1. ใช้ restriction enzyme ตัดโมเลกลุ DNA ใหไ้ด้ target DNA
2. เชือ่มตอ่ชิน้ DNA เขา้กบั vector โดยเทคนคิ ligation
3. สอดแทรก recombinant DNA molecule เขา้ไปใน host ทีท่ าให้
recombinant DNA molecule เพิ่มจ านวนได้
Recombinant DNA technique
DNA digestion
DNA ligation
Transformation
Transformation Screening
White blue colony screening
12
1. การตรวจสอบวา่พลาสมดิ
เขา้สูแ่บคทเีรยีหรอืไม่
2. การคดัเลอืกเซลล์
แบคทเีรยีที่มดีเีอน็เอสาย
ผสม
Blue Roses
http://www.isaaa.org/Kc/inforesources/biotechcro
ps/The_Golden_Rice_Technology.htm
Golden Rice
สิ่งมชีีวติดัดแปลงพันธุกรรม
GMOs / LMOs
- Genetically Modified Organisms (GMOs)- Living Modified Organisms (LMOs)- Transgenic plant- Transgenic animal
เทคนคิทางพนัธุวศิวกรรม (genetic
engineering)
การยา้ยยนีเขา้สูพ่ชืทางพันธวุิศวกรรมสามารถแบ่ง
ไดเ้ปน็ 2 วิธดีังนี้
1. การย้ายยีนโดยใช ้Agrobacterium tumerfaciens เปน็พาหะ
2. การย้ายยีนโดยไมต่อ้งใชพ้าหะ
ที่มา:
https://www.msu.edu/course/is
b/202/ebertmay/2004/notes/in
otes/02_28_06_bghuman.html
การยา้ยยนีเข้าสูพ่ืช
ทางพนัธวุศิวกรรม
เทคนคิทางพนัธุวศิวกรรมในสัตว์
(genetic engineering)
พันธวุิศวกรรมในสตัวส์ามารถแบ่งไดเ้ปน็ 3 วิธดีงันี้
1. DNA microinjection
2. Embryonic stem cell (homologous
recombination)
3. การถา่ยยนีโดยใช ้Retrovirus (SV 40)
Polymorphism
คอื ความแตกตา่งของรปูแบบพนัธกุรรมมากกวา่ 1
แบบขึน้ไป ความแตกตา่งที่เกิดขึน้นีจ้ะตอ้งมคีวามถีไ่ม่
น้อยกวา่ 1 เปอร์เซ็นต ์โดยปกตคิวามแตกตา่งทีเ่กิดขึน้ม ี
3 ระดบั คอื
1. ระดบัโครโมโซม
2. ระดบัยนี
3. ระดบัความยาวของชิน้สว่นดีเอ็นเอเมือ่ตดัดว้ย
เอนไซมต์ดัจ าเพาะ
ประโยชนข์องเทคนิคพนัธุวศิวกรรม
Genetic Engineering
1. ดา้นการแพทย:์ ผลติinsulin, growth hormone,
vaccine และ gene theraphy (โรคภมูิคุม้กนั
บกพร่อง (SCID)
2. ดา้นการเกษตร: transgenic plant, transgenic
animal
3. ดา้นอตุสาหกรรมและสภาพแวดลอ้ม: ผลติ
เชือ้จลุนิทรียพ์ันธุท์ี่มปีระสทิธภิาพสงูในการหมกั
อ.ดร.ภญิญารตัน ์ กงประโคน
สาขาทรพัยากรเกษตรชวีภาพ
คณะทรัพยากรธรรมชาตแิละอตุสาหกรรมเกษตร
มหาวทิยาลยัเกษตรศาสตร ์วทิยาเขตเฉลิมพระเกยีรต ิจังหวดัสกลนคร
ขอขอบคุณ