View
226
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Jure Stojan
2. predavanje
termodinamične osnove,
encimske katalize
encimska kataliza
časovni potek encimske
reakcije
začetna hitrost
Matjaž Zorko
3. predavanje
vplivi na hitrost encimske
reakcije
vpliv substrata (Michaelisova
kinetika)
ravnotežno - stacionarno
stanje
VPLIV:- koncentracije substrata- koncentracije encima- pH- temperature
FFA: Laboratorijska medicina, Molekularna encimologija, 2010/2011 3.predavanje
kA + B → C
2
*
RT
G
eNh
RTk
∆−
⋅=2
A ↔ BK
Encimska kinetika
• Obravnava hitrost, s katero se spreminjajo reaktanti (substrati S) v produkte (P):
S → P
• Hitrost podaja spremembo koncentracije substrata/produkta v časovni enoti
(mol/s) V = -d(S)/dt = d(P)/dt
• Hitrost encimske reakcije je merilo za aktivnost encima; enote za encimsko
aktivnost: U = 1μmol/min ali katal (SI sistem) = 1mol/s
• Specifična aktivnost encimskega pripravka: aktivnost/mg proteina; enote za
specifično aktivnost: μmol/min/mg ali katal/min/mg
A B
•Masa proteinov (vse kroglice) je večja v čaši A kot v čaši B•Št. molekul encima (rdeče kroglice) je enako v obeh čašah – encimska aktivnost enaka v obeh čašah•Encimska aktivnost, izražena na mg proteinov (specifična aktivnost) je večja v čaši B kot v čaši A
Začetna hitrost in vpliv koncentracije substrata
S → P
v = ∆(P)/∆t
Koncentracija substrata se s časom zmanjšuje, zato se zmanjšuje tudi hitrost! → začetna hitrost (vo)……je hitrost pri t = 0
S4 > S3 > S2 > S1
V0=k[S]1
1. order reaction
V0=k[S]0
0. order reaction
Če so nanašali vo v diagram v odvisnosti od [S], so dobili krivuljo nasičenja
Krivulja nasičenja ���� nasičenje E s S
E
ES
S
][][
][
][
]][[
S
K
ES
EK
ES
SE S
s =→=
Henry (1903) in kasneje Michaelis in Mentenova (1913) so skušali na osnovi ravnotežja najti enačbo za popis eksperimentalno dobljene krivulje.
Pogoj: k2 mora biti zelo majhna (k2<<k-1)!
][]][[ 11 ESkSEk −= �sK
k
k
ES
SE== −
1
1
][
]][[
Ks je disociacijska konstanta kompleksa ES – substratna konstanta!
sKES
SE=
][
]][[
KAJ SKUŠAMO NAREDITI:1. IZRAZITI [ES], ker vo=k2[ES]2.VPELJATI [Eo], ker je to merljiva količina!
[E] = [Eo] – [ES]
sKES
SESEo=
−
][
]])[[]([�
sKS
SEoES
+=
][
]][[][
sKS
SEoES
+=
][
]][[][
vo=k2[ES]upoštevamo:
sKS
SEokESk
+=
][
]][[][ 2
2pomnožimo s k2
s
oKS
SEokv
+=
][
]][[2
Vmax=k2[Eo]upoštevamo:s
oKS
SVv
+=
][
][max
[So]>>[Eo]upoštevamo:
zato je [S] = [So]
,in
so
oo
KS
SVv
+=
][
][max
so
oo
KS
SVv
+=
][
][max
1
1
k
kKS
−=
je Michaelis-Mentenova enačba
POZOR: (E) = konst.!
Ker pogoj ravnotežja ni bil v celoti izpolnjen, enačba ni imela splošne veljave – veljala je le za omejeno količino encimov!
Zato so iskali splošno rešitev. Briggs-Haldanov pristop:
STACIONARNO STANJE!
OPIŠI RAZLIKO MED RAVNOTEŽNIM IN STACIONARNIM STANJEM!
RAVNOTEŽNO STANJEZAČETNO STANJE
Višini vode v ‘sodih’ sta odvisni od dotoka in iztoka ter debeline prehodne cevi; pri konstantnem dotoku in iztoku se višini ne spreminjata: STACIONARNO STANJE
[S]o
E+S
E+P
ES
Če je koncentracija ES stalna, mora [ES] enako hitro nastajati kot razpadati!
)]([][][]][[ 21211 kkESESkESkSEk +=+= −−
MKk
kk
ES
SE=
+= −
1
21
][
]][[
Mo
oo
KS
SVv
+=
][
][max
Podobno kot M.- M. dobimo analogno enačbo, ki pa velja za STACIONARNO STANJE, takorekoč splošno:
nastajanje ES razpadanje ES razpadanje ES
)]([]][[ 211 kkESSEk += −
Pag
e 47
9
[ ][ ]SK
SVv
M
o+
⋅= max
Michaelis–Mentenova enačba in krivulja
1
21
k
kkKM
+= −
Dvojno recipročni (Lineweaver–Burkov) diagramP
age
480
[ ] maxmax
111
VSV
K
v
M
o
+⋅=
0.2 21
Mo
oo
KS
SVv
+=
][
][max
KDAJ Michaelis-Mentenova ENAČBA VELJA:
1. KADAR SMO V RAZMERAH ZAČETNE HITROSTI
2. KADAR JE [S]>>[E]
3. KADAR IMAMO LE EN AKTIVNI CENTER ali
4. KADAR JE AKTIVNIH CENTROV VEČ, A SO NEODVISNI
PRI KONSTRUKCIJI M.-M. KRIVULJE ALI NJENIH DERIVATOV (L.-B. KRIVULJA) MORAMO DRŽATI [E]O KONSTANTNO!
Pomen Km
• Vmax , Km določimo eksperimentalno
• Km - odraža afiniteto encima do substrata
- in tudi fiziološke razmere:
Km ≈ [S]physiol.
≈ = KS
≈
POMNI: - velika Km ���� majhna afiniteta encima do substrata
- majhna Km ���� velika afiniteta encima do substrata
KM - odraža afiniteto encima do substrata in nam pove pri katerih koncentracijah substrata bo encim učinkovit!
Pomen KM v fiziologiji
primer: občutljivost Azijcev na alkohol
• Japonci in Kitajci dosežejo isti učinek alkohola (vazodilatacija, pospešen ritem
srca...) že pri nižji koncentraciji zaužitega alkohola kot Evropejci
• Reakcije razgradnje alkohola
CH3CH2OH + NAD+ → CH3CHO + H+ + NADH encim: alkoholna
dehidrogenaza
CH3CHO + NAD+ → CH3COOH + H+ + NADH encim: aldehidna
dehidrogenaza
• Azijci nimajo izoencimske oblike encima aldehidne dehidrogenaze
z nizko KM ; posledica: aldehid v krvi dolgo kroži po telesu
Izoemcimi: katalizirajo isto reakcijo (isti substrat), različne pa so molekulske lastnosti
encimov: različna molekulska masa (Mr), različna encimska aktivnost (V0), različna
MM konstanta (Km); izoencime kodirajo različni geni!
kkat
• kkat = k najpočasnejše stopnje v desno!
• kkat - pretvorbeno število (turnover number):
število molekul (molov) substrata, ki se pretvori
v produkt na eni molekuli (molu) encima v
časovni enoti (navadno sekundi).
Kinetična učinkovitost encimov: pretvorbeno število (turnover
number), kkat
Zakaj za mero učinkovitosti encima ne uporabljamo Vmax? Ker je odvisna od koncentracije encima, saj velja enačba:
Vmax=k2[E]o
kkat/Km
vo=kkat[ES]
Vmax=kkat[E]o
1
1
k
kkK kat
M
+= − Kadar je k2 = kkat!
Mo
oo
KS
SVv
+=
][
][max
A B P Q
E EA EAB EPQ EQ E
E
QB P
E
EQEA
A
AB
EBEABEPQ
EP
Q P
-
A
EA FA F FB EQ E
P B Q
E - -
urejen sekvenčni mehanizem:
naključni sekvenčni mehanizem:
ping-pong mehanizem:
Bisubstratne reakcije:
Zelo različni mehanizmi!
A A
A
B
B
B
E
A A
A
B
B
B
E
Ping Pong mehanizem [B] = konstanten.
Ping Pong mehanizem [A] = konstanten.
Vsi sekvenčni mehanizmi imajo dvojne
recipročne diagrame, kjer se premice sekajo.
Vpliv koncentracije encima na aktivnost.
Dokler velja [S] >> [E] se s povečanjem [E]
proporcionalno poveča [ES].
Ker velja enačba vo= kkat[ES], velja linearna zveza med vo
in [E]: če se [E] dvakrat poveča, se tudi vo dvakrat poveča.
vo
[E]
Vpliv pH na aktivnost encima (fumaraza).
Zelo različne krivulje za
različne encime,
navadno so v skladu s
fiziološkim delovanjem
pH profil peptidaze – pomen skupin v
aktivnem mestu encima in v substratu
pKa!
KAJ PA POMEN SKUPIN DRUGJE V STRUKTURI ENCIMA?
Različni encimi – različni pH profili(zaradi različnih disociabilnih skupin v encimu in substratu)
pepsin glukoza-6-fosfataza
Učinek pH je lahko kompleksen –npr. kimotripsin
Cumulative pH effect
pH affects kcat pH affects KM
M
cat
K
kv ∝
pH optimum 17β-HSD
Krivulji temperaturne in pH odvisnosti sta si podobni
2
*
RT
G
eNh
RTk
∆−
⋅=
vo=k2[ES]
T narašča do Topt: več in močnejši trki, zato hitrost narašča!
ToptpHopt
T narašča nad Topt: encim se denaturira, zato hitrost pada!
Razpad IV., III. in II. strukture encima, zato encim ni več aktiven!
Navidezni temperaturni optimum 17β-HSD
Temperaturna stabilnost 17β-HSD
Jure Stojan
4. predavanje
Inhibicija - aktivacija -
modulacija encimske
katalize
hitre kinetične metode
matematično modeliranje -
analiza podatkov
Matjaž Zorko
3. predavanje
vplivi na hitrost encimske
reakcije
vpliv substrata (Michaelisova
kinetika)
ravnotežno - stacionarno stanje
VPLIV:
- koncentracije substrata
- koncentracije encima
- pH
- temperature
Recommended