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MANARA BEZERRA BARBOSA COSTA DAMASCENO
PARTICIPAÇÃO DA NEUROTRANSMISSÃO
DOPAMINÉRGICA NO EFEITO HIPERLOCOMOTOR DO
NEUROPEPTÍDEO S
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.
Natal - RN
2014
MANARA BEZERRA BARBOSA COSTA DAMASCENO
PARTICIPAÇÃO DA NEUROTRANSMISSÃO
DOPAMINÉRGICA NO EFEITO HIPERLOCOMOTOR DO
NEUROPEPTÍDEO S
Dissertação de mestrado apresentada ao curso de Pós-graduação em Psicobiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.
Orientadora: Profa. Dra. Elaine C. Gavioli
Natal – RN
2014
Catalogação da Publicação na Fonte
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Costa, Manara Bezerra Barbosa.
Participação da neurotransmissão dopaminérgica no efeito hiperlocomotor do neuropeptídeo S / Manara Bezerra Barbosa Costa. – Natal, 2014. 76f: il. Orientadora: Profa. Dra. Elaine Cristina Gavioli.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.
1. Atividade locomotora - Dissertação. 2. Dopamina - Dissertação. 3. Neuropeptídeo S. - Dissertação. I. Gavioli, Elaine Cristina. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSE01 CDU 615.21
PARTICIPAÇÃO DA NEUROTRANSMISSÃO
DOPAMINÉRGICA NO EFEITO HIPERLOCOMOTOR DO
NEUROPEPTÍDEO S
Manara Bezerra Barbosa Costa Damasceno
Defesa: 25/04/2014
A harmonia das leis naturais revela uma
inteligência de tal superioridade que,
comparada a ela, todo o pensamento
sistemático e a ações dos seres humanos
são uma reflexão totalmente insignificante.
Albert Einstein
AGRADECIMENTOS
Em primeiríssimo lugar, agradeço à Eterna e Superior Inteligência, a
quem chamo Deus, o idealizador, criador e mantenedor de toda informação
que rege tudo que existe. Dou graças a Ele “pois desde a criação do mundo os
atributos invisíveis de Deus, seu eterno poder e sua natureza divina, têm sido
vistos claramente, sendo compreendidos por meio das coisas criadas”
(Romanos 1:20 – Bíblia Sagrada). A Ele, meu criador, meu companheiro
ajudador, meu mantenedor e meu salvador, dou sempre graças.
Agradeço com profundo carinho e admiração à minha orientadora prof.
Dra. Elaine Gavioli, que por muitas vezes foi também amiga e conselheira.
Sou grata por me ensinar com zelo, por me confortar nos momentos de
angústia, e por se alegrar comigo nas minhas conquistas. Agradeço por todo
ensinamento concedido com humildade, seriedade e verdade. Obrigada,
professora, por ser um exemplo em tantos aspectos que nem sei contar.
Agradeço ilimitadamente à minha família. Nos últimos meses passamos
por momentos difíceis, mas vencemos e aprendemos, porque toda tempestade
é pedagógica, e graças a Deus, também é passageira. Meu esposo, Gerdian,
tem sido meu melhor amigo e meu amor. Você me deu um desafio a mais
nesse período: casar em pleno mestrado. Fui noiva, daquelas cheia de planos,
no período mais difícil de disciplinas. Qualifiquei na semana do casamento.
Tive que aprender a ser esposa, dona de casa, tomar conta de tudo e de você.
Esse desafio fez crescer em mim o significado do amor, e me deu a certeza de
que é com você que quero estar. Aos meus pais, David e Betânia, devo
gratidão eterna! Vocês me ensinaram o amor e o cuidado apesar das
dificuldades! Hoje agradeço a vocês especificamente por terem se sacrificado
por mim, pois eu me lembro das dificuldades que enfrentaram pra dar a mim e
a minhas irmãs a melhor educação possível. Portanto, amados pais, essa
conquista é de vocês! Às minhas irmãs, Yanne e Ingrid, “irmãs mais chegadas
que amigas”, vocês têm sido minhas verdadeiras amigas, me amando
independentemente das circunstâncias, isso já é mais do que mereço! Sem
vocês, minha vida seria mais difícil! Obrigada! Não posso deixar de agradecer à
minha sogra, Rose, e a meu sogro, s. Gerd, que se preocuparam comigo e me
concederam suporte quando necessário. Sei que posso contar com vocês, já
que agora também são meus pais! Muito obrigada!
Também agradeço aos meus colegas de laboratório, que muitas vezes
trouxeram leveza ao ambiente estressante de experimentos, seja com as
literalmente altas gargalhadas de Lisi, seja com as “novidades de corredor” (né
Victor?), e ainda, com os papos com as doutorandas Íris, Laila, Júlia e
Adriana sobre qualquer coisa. Não posso deixar de citar “certas pessoas”,
Décio, aquele que alegrava o lab mesmo “enchendo o saco” de todo mundo.
Muito obrigada pela amizade e companheirismo, queridos! Agradeço de
coração aquela que se chegou com amizade, incentivo e com a ajuda na parte
experimental desse trabalho: a Nataly. Muitas vezes trabalhamos juntas, e
também rimos, brigamos, choramos e isso tudo foi muito bom! Você foi
essencial, muito obrigada! Você também é meu motivo de orgulho, sei que com
você vai longe! Enfim, queridos do laboratório, citados ou não, muito obrigada!
Agradeço também a todos os professores da Psicobiologia, pelo
conhecimento adquirido.
Aos componentes da banca, prof. Dr. Marcelo Duzzioni e prof. Dr.
Judney Cavalcante, muito obrigada pela disponibilidade e contribuição para
este trabalho.
Agradeço à professora Dra. Vanessa, que além de ser um modelo, é
também uma fofa. Que honra ter você na minha banca de TCC, de
qualificação, e agora, apesar das circunstâncias não terem permitido sua
presença na minha banca, agradeço-lhe por todo incentivo e pela
disponibilidade como suplente.
8
SUMÁRIO
RESUMO .......................................................................................................... 10
ABSTRACT ...................................................................................................... 11
LISTA DE FIGURAS......................................................................................... 12
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................. 14
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 16
1.1. O Sistema do Neuropeptídeo S ........................................................ 16
1.2. Ações motoras do NPS ..................................................................... 19
1.3. NPS e sistema dopaminérgico ......................................................... 20
1.4. A neurotransmissão dopaminérgica ............................................... 22
1.4.1. Síntese, envesiculamento e metabolismo da dopamina ............... 23
1.4.2. Receptores dopaminérgicos ......................................................... 26
1.4.3. Vias dopaminérgicas .................................................................... 28
2. JUSTIFICATIVA ........................................................................................ 32
3. OBJETIVOS .............................................................................................. 33
3.1. Geral ................................................................................................... 33
3.2. Específicos ........................................................................................ 33
4. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................... 34
4.1. Animais .............................................................................................. 34
4.2. Drogas e tratamentos farmacológicos ............................................ 34
4.3. Cirurgia para a implantação da cânula intracerebroventricular
(ICV) em camundongos .............................................................................. 36
4.4. Avaliação da atividade locomotora espontânea de camundongos
........................................................................................................................36
4.5. Delineamento experimental .............................................................. 37
4.6. Análise estatística ............................................................................. 45
9
5. RESULTADOS .......................................................................................... 46
5.1. Experimento I: Efeito da administração de NPS na atividade
locomotora dos camundongos no teste do campo aberto ..................... 46
5.2. Experimento II: Efeito do tratamento prévio com AMPT na
hiperlocomoção induzida por metilfenidato e por NPS ........................... 46
5.3. Experimento III: Efeito do tratamento prévio com reserpina na
hiperlocomoção induzida por metilfenidato e por NPS ........................... 49
5.4. Experimento IV: Efeito do tratamento prévio com sulpiride na
hiperlocomoção induzida por metilfenidato e por NPS ........................... 51
6. DISCUSSÃO ............................................................................................. 55
7. CONCLUSÃO ............................................................................................ 69
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 71
10
RESUMO
Neuropeptídeo S (NPS) é um peptídeo endógeno formado por 20 aminoácidos e é o ligante de um receptor acoplado à proteína G chamado NPSR, o qual está envolvido na modulação de várias funções biológicas centrais como locomoção, ansiedade, nocicepção, ingestão de alimento e comportamentos motivacionais. Já é conhecido que o efeito hiperlocomotor do NPS é mediado pelos receptores NPSR e parece depender da ativação do sistema adenosinérgico, dopaminérgico e do sistema peptidérgico do CRF. Considerando o pouco conhecimento acerca do envolvimento do sistema dopaminérgico na mediação do aumento da atividade locomotora induzido pelo NPS, o presente estudo objetiva investigar as ações motoras da administração intracerebroventricular (icv) de NPS em camundongos pré-tratados com α-metil-p-tirosina (AMPT, inibidor da enzima de síntese de dopamina), reserpina (inibidor do armazenamento da dopamina em vesículas) ou sulpiride (inibidor de receptores D2 de dopamina), em animais submetidos ao teste de atividade locomotora no campo aberto. Para fins de comparação, um grupo distinto de animais recebeu os mesmos pré-tratamentos acima descritos (AMPT, reserpina ou sulpiride) e o efeito hiperlocomotor do metilfenidato (inibidor da recaptação de dopamina) foi investigado no campo aberto. O NPS e o metilfenidato aumentaram a atividade locomotora dos animais. O AMPT per se não causou alteração na locomoção dos animais. Por outro lado, o AMPT reduziu parcialmente o efeito hiperlocomotor do metilfenidato, mas não foi capaz de afetar a ação hiperlocomotora do NPS. Tanto o pré-tratamento com reserpina
como com sulpiride foram capazes de inibir o efeito estimulatório do NPS, assim como o do metilfenidato. Estes achados mostram que o efeito hiperlocomotor do metilfenidato, mas não do NPS, foi afetado pela administração de AMPT. Além disso, tanto o efeito do metilfenidato quanto do NPS foram prejudicados pelos pré-tratamentos com reserpina e sulpiride. Em conjunto, sugere-se que o NPS pode promover estímulo excitatório mesmo quando a síntese de catecolaminas está prejudicada. Ainda conclui-se que o efeito hiperlocomotor do NPS e do metilfenidato depende dos estoques vesiculares de monoaminas, em particular dopamina, e da ativação do receptor dopaminérgico D2. O efeito psicoestimulante do NPS por meio da ativação do sistema dopaminérgico pode apresentar importância clínica no tratamento de doenças que envolvem a via dopaminérgica, como a doença de Parkinson e a dependência química.
Palavras-chaves: neuropeptídeo S; atividade locomotora; dopamina;
camundongo.
11
ABSTRACT
Neuropeptide S (NPS) is an endogenous 20-aminoacid peptide which binds a G protein-coupled receptor named NPSR. This peptidergic system is involved in the modulation of several biological functions, such as locomotion, anxiety, nociception, food intake and motivational behaviors. Studies have shown the participation of NPSR receptors in mediating the hyperlocomotor effects of NPS. A growing body of evidence suggests the participation of adenosinergic, dopaminergic and CRF systems on the hyperlocomotor effects of NPS. Considering that little is known about the role of dopaminergic system in mediating NPS-induced hyperlocomotion, the present study aims to investigate the locomotor actions of intracerebroventricular (icv) NPS in mice pretreated with α-metil-p-tirosine (AMPT, inhibitor of dopamine synthesis), reserpine (inhibitor of dopamine vesicle storage) or sulpiride (D2 receptor antagonist) in the open field test. A distinct group of animals received the same pretreatments described above (AMPT, reserpine or sulpiride) and the hyperlocomotor effects of methylphenidate (dopamine reuptake inhibitor) were investigated in the open field. NPS and methylphenidate increased the mouse locomotor activity. AMPT per se did not change the locomotion of the animals, but it partially reduced the hyperlocomotion of methylphenidate. The pretreatment with AMPT did not affect the psychostimulant effects of NPS. Both reserpine and sulpiride inhibited the stimulatory actions of NPS and methylphenidate. These findings show that the hyperlocomotor effects of methylphenidate, but not NPS, were affected by the pretreatment with AMPT. Furthermore, methylphenidate- and NPS-induced hyperlocomotion was impaired by reserpine and sulpiride pretreatments. Together, data suggests that NPS can increase locomotion even when the synthesis of catecholamines was impaired. Additionally, the hyperlocomotor effects of NPS and methylphenidate depend on monoamines vesicular storaged, mainly dopamine, and on the activation of D2 receptors. The psychostimulant effects of NPS via activation of dopaminergic system display clinical significance on the treatment of diseases which involves dopaminergic pathways, such as Parkinson’s disease and drug addiction.
Keywords: neuropeptide S; locomotor activity; dopamine; mice.
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estruturas primárias do Neuropeptídeo S de Humano, chimpanzé,
camundongo, rato, cachorro e galinha. ............................................................ 16
Figura 2 - NPS e o receptor NPSR. .................................................................. 18
Figura 3 – Esquema ilustrativo dos neurônios dopaminérgicos pré- e pós-
sinápticos mostrando o ciclo da dopamina.. ..................................................... 24
Figura 4 - Esquema das estruturas evidenciando diferenças gerais
comparativas entre receptores dopaminérgicos dos tipos D1 e D2. .................. 27
Figura 5 – Vias centrais de dopamina. ............................................................. 29
Figura 6 – Diagrama ilustrativo das vias dopaminérgicas direta e indireta. ...... 30
Figura 7 - Delineamento experimental do Experimento I.................................. 38
Figura 8 - Delineamento experimental da etapa A do experimento II. .............. 39
Figura 9 – Delineamento experimental da etapa B do experimento II. ............. 40
Figura 10 - Delineamento experimental da etapa C do experimento II. ........... 40
Figura 11 - Delineamento experimental da etapa A do experimento III ............ 41
Figura 12 - Delineamento experimental da etapa B do experimento III. ........... 42
Figura 13 - Delineamento experimental da etapa C do experimento III. .......... 43
Figura 14 - Delineamento experimental da etapa A do experimento IV. .......... 43
Figura 15 - Delineamento experimental da etapa B do experimento IV. .......... 44
Figura 16 - Delineamento experimental da etapa C do experimento IV. .......... 45
Figura 17 – Efeito da administração de NPS nas doses de 0,1 e 1 nmol e na
atividade locomotora de camundongos submetidos ao teste do campo aberto 46
13
Figura 18 – Efeito da administração de AMPT nas doses de 100, 200, 250 e
300 mg/kg, ip, 24h após o tratamento,em camundongos submetidos ao teste do
campo aberto ................................................................................................... 47
Figura 19. Efeito do pré-tratamento com AMPT 250 mg/kg na hiperlocomoção
causada por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto. ....................... 48
Figura 20. Efeito do pré-tratamento com AMPT 250 mg/kg na hiperlocomoção
causada pelo tratamento com NPS em camundongos submetidos ao teste do
campo aberto ................................................................................................... 49
Figura 21 – Efeito da administração de reserpina nas doses de 1, 2 e 5 mg/kg,
sc, 24h,em camundongos submetidos ao teste do campo aberto. ................... 50
Figura 22 – Efeito do pré-tratamento com reserpina 2 mg/kg na hiperlocomoção
induzida por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto. ....................... 50
Figura 23 – Efeito do pré-tratamento com reserpina 2 mg/kg na hiperlocomoção
causada pelo tratamento com NPS em camundongos submetidos ao teste do
campo aberto ................................................................................................... 51
Figura 24 – Efeito da administração de sulpiride nas doses de 25 e 50 mg/kg,
ip, 45 min, em camundongos submetidos ao teste do campo aberto ............... 52
Figura 25 – Efeito do pré-tratamento com sulpiride 25 mg/kg na hiperlocomoção
causada por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto. ....................... 53
Figura 26. Efeito do pré-tratamento com sulpiride 25 mg/kg na hiperlocomoção
induzida pelo NPS em camundongos submetidos ao teste do campo aberto. . 54
Figura 27 – O ciclo sináptico.. .......................................................................... 59
14
LISTA DE ABREVIATURAS
6-OHDA – 6-hidroxidopamina
AADC – aminoácido aromático descaboxilase
AMPc – adenosina monofosfato cíclico
AMPT – alfa-metil-para-tirosina
AP – ântero-posterior
ATP – adenosina tri-fosfato
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
CRF – fator liberador de corticotropina
DAT – transportador de dopamina
DOPAC – ácido 3,4-dihidroxifenilacético
DV – dorso-ventral
GPCR –receptores acoplados a proteína G
GABA – ácido gama-aminobutírico
Gs – proteína G estimulatória
Gq – proteína G que ativa fosfolipase C
HPLC – do inglês, high performance liquid chromatography
icv - intracerebroventricular
ip – intraperitonial
iv – intravenoso
KO – knockout
15
L-DOPA - L-3,4-dihidroxifenilalanina
MAO-B – enzima monoamina oxidase-B
ML – médio-lateral
MPTP – 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
NAcSh - parte shell do núcleo accumbens
NMOL – nanomolar
NPS – neuropeptídeo S
NPSR – receptor do neuropeptídeo S
REL – retículo endoplasmático liso
RNAm – ácido ribonucléico mensageiro
RRP – do inglês, readily releasable pool
S – serina
sc – subcutânea
TH – enzima tirosina hidroxilase
VMAT – transportador vesicular de monoaminas
VTA - área tegmental ventral
WT – wildtype
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. O Sistema do Neuropeptídeo S
Novos neurotransmissores ou moduladores podem ser descobertos pelo
uso da técnica da farmacologia reversa, especialmente quando tais ligantes
possuem afinidade por receptores órfãos acoplados a proteínas G (GPCRs, do
inglês G protein-coupled receptors). GPCRs órfãos são proteínas clonadas
cujos ligantes endógenos não foram ainda identificados. Usando GPCRs
órfãos, vários neuropeptídeos têm sido descobertos nos últimos anos, o que
tem ampliado a compreensão de funções particulares do cérebro e auxiliado a
revelar novos alvos terapêuticos para transtornos psiquiátricos (CIVELLI et al.,
2001). Xu e colaboradores (2004) descreveram pela primeira vez as funções
fisiológicas do Neuropeptídeo S (NPS), que foi identificado pela técnica da
farmacologia reversa. O NPS é o ligante endógeno de um GPCR deorfanizado
que foi denominado de NPSR. O NPS foi assim denominado devido à presença
de um aminoácido serina (S) na porção amino-terminal da estrutura primária
desse peptídeo, que se encontra preservada em várias espécies animais, como
mostra a Figura 1.
Figura 1 – Estruturas primárias do Neuropeptídeo S de Humano, chimpanzé, camundongo, rato, cachorro e galinha. Aminoácidos divergentes da seqüência humana são mostrados em negrito. O aminoácido Serina (S) na porção N-terminal está conservado em todas as espécies que expressam o peptídeo. (XU et al., 2004)
17
O receptor NPSR é amplamente distribuido no encéfalo, enquanto a
expressão do peptídeo precursor é limitada a poucas áreas do tronco
encefálico. A expressão do RNAm do precursor do NPS no cérebro exibe uma
distribuição muito limitada, pois a maioria dos neurônios que expressam o NPS
foram encontrados em poucas regiões do tronco cerebral, a citar: núcleo
sensitivo principal do trigêmeo, núcleo parabraquial lateral e na área próxima
ao locus coeruleus (XU et al., 2007). Estudos de hibridização in situ
demonstraram que a maioria das células que expressam NPS na área do locus
coeruleus são neurônios glutamatérgicos, poucos são colinérgicos, enquanto
nenhum produz GABA. No núcleo sensitivo principal do trigêmeo, muitos dos
neurônios que expressam NPS utilizam glutamato como um neurotransmissor.
Finalmente, células positivas para NPS no núcleo parabraquial lateral co-
expressam CRF (XU et al., 2007). O NPS parece estar expresso juntamente
com neurotransmissores excitatórios e, baseado nisso, tem sido proposto que o
NPS fornece elementos excitatórios adicionais aos alvos pós-sinápticos destes
neurônios (XU et al., 2007).
Em oposição ao precursor do NPS, o NPSR é amplamente distribuído no
cérebro. De fato, altos níveis de expressão do RNAm do NPSR foram
encontrados no córtex, núcleo olfatório, tálamo, hipotálamo, amígdala e
subiculum (XU et al., 2004; 2007). Vale ressaltar que o receptor NPSR
encontra-se expresso moderadamente na substância negra e na área
tegmental ventral, o que sugere um papel modulatório desempenhado por este
sistema sobre a neurotransmissão dopaminérgica (XU et al., 2007).
O perfil da expressão do receptor NPSR sugere o envolvimento do
sistema NPS-NPSR na regulação de múltiplas funções centrais, como
18
locomoção, ciclo cicardiano, ingestão de alimentos, ansiedade, memória e
aprendizado, nocicepção, via da recompensa, entre outras funções (para uma
revisão: GUERRINI et al., 2009).
O NPSR é um típico receptor acoplado a proteína G, formado por 7
domínios transmembrana. As características farmacológicas da interação entre
NPS e NPSR foram determinadas pelo uso de linhagens celulares CHO e
HEK293 T, expressando NPSR recombinante (XU et al., 2004), nas quais,
quando o NPSR foi ativado por NPS em concentrações nanomolares, foi
induzida mobilização de cálcio intracelular, aumento dos níveis intracelulares
de AMPc e aumento na concentração intracelular de proteínas quinases
fosforiladas (Figura 2; XU et al., 2004; REINSCHEID et al., 2005), sugerindo
que o NPSR pode sinalizar via proteína Gq e Gs a fim de aumentar a
excitabilidade celular.
Figura 2 - NPS e o receptor NPSR. A ligação do NPS ao seu receptor NPSR desencadeia a síntese de AMPc intracelular via proteína G (G) por ativação da adenililciclase (AC). Além disso, a interação entre o NPS e o NPSR leva a um aumento significante da concentração de cálcio (Ca2+), devido a ativação de canais de Ca2+ da membrana plasmática e/ou do retículo endoplasmático liso (REL). Fonte: PAPE et al., 2010.
19
1.2. Ações motoras do NPS
Fisiologicamente, Xu e colaboradores (2004) demonstraram pela
primeira vez que a administração supraespinhal de NPS 0,1 nmol causou
hiperlocomoção em camundongos familiarizados ou não ao ambiente. A
duração do efeito hiperlocomotor produzido pela administração
intracerebroventricular (icv) de NPS foi de aproximadamente uma hora. Estes
resultados foram posteriormente confirmados por vários grupos de pesquisa,
tanto para camundongos (ROTH et al., 2006; LEONARD et al., 2008;
OKAMURA et al., 2008; RIZZI et al., 2008; CASTRO et al., 2009; PAÑEDA et
al., 2009), quanto para ratos (SMITH et al., 2006), mostrando que o efeito
estimulatório da atividade locomotora é robusto e consistente apesar das
diferentes condições experimentais e das espécies animais.
O envolvimento do NPSR na atividade locomotora foi demonstrado com
o uso de três antagonistas quimicamente não relacionados, o composto não-
peptídico SHA 6824 (OKAMURA et al., 2008; RUZZA et al., 2010) e os
peptídicos [D-Val5]NPS (GUERRINI et al., 2010) e [tBu-D-Gly5]NPS (RUZZA
et al., 2012). Os antagonistas foram eficazes em antagonizar o efeito
estimulatório do NPS na locomoção, mas não produziram efeito na locomoção
per se. Estes achados obtidos em diferentes condições laboratoriais e
utilizando moléculas de naturezas diferentes demonstram que a ação do
peptídeo na atividade locomotora ocorre devido à ativação do NPSR e sugerem
que o sistema endógeno de NPS não exerce um controle tônico no
comportamento motor do animal.
20
Estudos com diferentes linhagens de camundongos knockout (KO) tem
confirmado essa hipótese. Camundongos KO para o gene do
NPSR(NPSR(−/−)), não apresentaram diferenças no comportamento locomotor
em relação aos animais selvagens, e ainda, o efeito hiperlocomotor do NPS foi
observado em camundongos NPSR(+/+) mas não em camundongos
NPSR(−/−), quando injetados com NPS icv (DUANGDAO et al., 2009; FENDT
et al., 2011; RUZZA et al., 2010). Em conjunto, estes dados indicam que o NPS
produz efeito estimulatório sobre a atividade locomotora mediado pela ativação
do NPSR.
1.3. NPS e sistema dopaminérgico
Baseados no fato de o NPSR estar distribuído em várias áreas
cerebrais, incluindo a área tegmental ventral (VTA; XU et al., 2007), Mochizuki
e colaboradores (2010) propuseram o estudo do envolvimento do sistema
dopaminérgico pela via mesolímbica, que tem sua origem na VTA, na atividade
locomotora de ratos sob o efeito do NPS. A hipótese do grupo era de que a
atividade hiperlocomotora induzida por NPS pode ser mediada por ativação da
via dopaminérgica mesolímbica através da ativação do NPSR expresso na
VTA. A injeção intra-VTA de NPS causou aumento da atividade motora
horizontal e vertical em ratos de forma significativa, nas doses de 0,05 nmol e
0,5 nmol (por hemisfério), e a hiperatividade foi dose-dependente e
significativamente inibida por pré-administração local na parte shell do núcleo
accumbens (NAcSh) de sulpiride, um antagonista do receptor D2 de dopamina,
21
nas doses de 0,5 e 5 nmol (por hemisfério). Por meio de microdiálise, foi
possível mensurar e constatar o aumento significativo de metabólitos de
dopamina (DOPAC) no NAcSh. Estes resultados suportam a hipótese de que o
NPS ativa o sistema mesolímbico dopaminérgico, presumivelmente através do
NPSR localizado na VTA, estimulando a atividade motora (MOCHIZUKI et al.,
2010). Além desse estudo, Si e colaboradores (2010) investigaram o efeito do
NPS na liberação de dopamina e serotonina no córtex medial pré-frontal por
microdiálise em ratos e observaram que o NPS icv aumentou os níveis de
dopamina e de seu principal metabólito, mas não encontraram diferença nos
níveis de serotonina. Em conjunto, esses dados evidenciam a participação da
neurotransmissão dopaminérgica no efeito hiperlocomotor do NPS (SI et al.,
2010).
Estudos de diferentes grupos avaliaram a capacidade do NPS em
modular comportamentos relacionados à ativação do sistema de recompensa.
Em 2008, BADIA-ELDER e colegas concluíram que administração de NPS
aumentou a busca pela ingestão de álcool em ratos (BADIA-ELDER et al.,
2008). Já foi demonstrado também que a administração icv de NPS reintegrou
o comportamento extinto de busca por cocaína de forma dose-dependente, no
qual o NPS causou aumento do pressionamento da alavanca em níveis
equivalentes aos observados durante a auto-administração de cocaína
(CANNELLA et al., 2009; PAÑEDA et al., 2009). Em oposição a estes estudos,
Li e colaboradores (2009) relataram que o NPS bloqueou a aquisição da
preferência condicionada por lugar causada por morfina, enquanto que o NPS
per se não causou nem preferência nem aversão por lugar (LI et al., 2009).
Mais recentemente, CAO e colegas observaram que ratos pressionavam com
22
alta frequência a alavanca de auto-administração de NPS icv, o que foi
diminuído por antagonista de receptor de dopamina e de hipocretina-1(orexina-
1), concluindo-se que o NPS pode interferir com o sistema de recompensa
induzindo a procura por reforço positivo e isto parece ser mediado pelos
receptores de dopamina e de hipocretina (CAO et al., 2011).
Tendo em vista a relação intrínseca entre a dopamina e a Doença de
Parkinson, um estudo feito em nosso laboratório visou investigar o papel do
NPS no prejuízo motor de camundongos induzido pela administração de 6-
OHDA. Os danos motores induzidos pela administração de 6-OHDA foram
revertidos pelo tratamento central com NPS, sugerindo que o NPS parece
facilitar a liberação de dopamina na via nigroestriatal, o que justificaria a
melhora do desempenho motor induzida pela administração do NPS em
animais tratados com 6-OHDA. Estes dados apontam, pela primeira vez, para a
possibilidade de agonistas do receptor NPSR atuarem como agentes
terapêuticos ou adjuvantes no tratamento da Doença de Parkinson (DIDONET
et al., 2014).
1.4. A neurotransmissão dopaminérgica
Dopamina é um neurotransmissor catecolaminérgico conhecido por
regular muitas atividades neuronais e fisiológicas. Este neurotransmissor
participa do ciclo sono-vigília (DZIRASA et al., 2006), é crítico para a
motivação, recompensa e aprendizado (WISE, 2004) e modula o controle do
movimento voluntário (GRAYBIEL, 2005) (para revisão: BEST et al., 2009;
PANDEY et al., 2013). Estudos indicam que há uma regulação anormal da
23
liberação e recaptação de dopamina na síndrome de Tourette (JANKOVIC,
2001). Além disso, a dopamina parece ser essencial para mediar respostas
sexuais (HEATON, 2000). Vários transtornos comportamentais/sociais, como
alcoolismo e transtorno bipolar também parecem estar associadas com
desequilíbrio do sistema de dopamina (para revisão: BEAULIEU e
GAINETDINOV, 2011). Estudos de microdiálise têm mostrado que drogas de
abuso aumentam a dopamina extracelular e imagens cerebrais têm mostrado
uma correlação entre euforia e aumento da dopamina extracelular induzido por
psicoestimulantes (DI CHIARA, et al., 2004). Essas e outras consequências da
disfunção do metabolismo da dopamina indicam a importância da manutenção
da funcionalidade através de mecanismos homeostáticos que têm sido
atribuídos ao delicado balanço entre síntese, estoque, liberação, metabolismo e
recaptação de dopamina (BEST et al., 2009; ELSWORTH e ROTH, 1997;
GAINETDINOV et al., 1998; KIENAST e HEINZ, 2006).
1.4.1. Síntese, envesiculamento e metabolismo da dopamina
A síntese de dopamina ocorre primariamente no terminal pré-sináptico
via hidroxilação de tirosina pela enzima tirosina hidroxilase (TH), para formar L-
3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). L-DOPA é, então, descarboxilada pela
enzima aminoácido aromático descarboxilase (AADC) para produzir dopamina
(KUHN, 1983). Após a síntese, a dopamina é sequestrada do citosol e
armazenada dentro de vesículas sinápticas pelo transportador de monoaminas
vesicular (VMAT) (ERICKSON et al., 1992; LIU et al., 1992). A dopamina
vesicular é liberada na sinapse no terminal neuronal por exocitose após
estimulação (TRIFARÓ et al., 1992). A dopamina extracelular é reciclada de
volta para dentro do terminal pelo transportador de dopamina (DAT), quando é
24
também recolocada dentro das vesículas pelo VMAT ou é degradada pela
monoamino oxidase B (MAOB) para formar peróxido de hidrogênio (H2O2) e
3,4-dihidroxifeniladeildo, que é rapidamente oxidado pela aldeído
desidrogenase a ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC). A figura 3 mostra um
esquema simplificado desse processamento (para revisão: EISENHOFER et
al., 2004).
Figura 3 – Esquema ilustrativo dos neurônios dopaminérgicos pré- e pós-sinápticos mostrando o ciclo da dopamina. (SMITH et al., 1999).
Inúmeras substâncias capazes de alterar a homeostase da
neurotransmissão dopaminérgica têm sido utilizadas na pesquisa científica
básica (para revisão: BEAULIEU e GAINETDINOV, 2011). Muitas delas
simulam estados semelhantes aos transtornos que acontecem na clínica, como
na doença de Parkinson, e assim, novos alvos terapêuticos podem ser
estudados, como alternativa aos tratamentos que ainda não são satisfatórios,
ou ainda, pode-se promover entendimento mais aprofundado sobre o
funcionamento fisiológico e o mecanismo de ação dos fármacos. A depleção
25
farmacológica de catecolaminas tem sido uma ferramenta útil nesse tipo de
estudo.
A substância α-metil-para-tirosina (AMPT) é um agente de depleção
conhecido por inibir a etapa limitante da síntese de dopamina no citosol
catalizada pela TH, reduzindo a quantidade de dopamina encefálica
(PAPESCHI, 1975; SCHEEL-KRÜGER, 1971; SPECTOR et al., 1965). A
reserpina é outro instrumento utilizado na depleção de catecolaminas,
inicialmente utilizado empiricamente como agente anti-hipertensivo (FRIEDEN,
1963). A reserpina é conhecida atualmente por bloquear o VMAT, impedindo
que a dopamina seja estocada em vesículas (ERICKSON et al., 1992;
WATANABE et al., 2005). São necessárias duas bombas moleculares
separadas para o transporte da dopamina nas vesículas sinápticas. Uma
ATPase de prótons concentra prótons na vesícula, criando uma concentração
elevada de prótons, e um interior eletropositivo da vesícula. Esse gradiente é
explorado por um antiportador de prótons, o VMAT, que permite o
deslocamento de prótons ao longo do gradiente (para fora da vesícula)
enquanto efetua o transporte simultâneo de DA para dentro da vesícula, contra
o seu gradiente de concentração (GOLAN et al., 2009).
Após o estímulo neural e a consequente liberação do conteúdo das
vesículas sinápticas para o meio extracelular, o transportador de dopamina,
que fica na membrana pré-sináptica, exerce a função de recaptar a dopamina
da fenda sináptica para ser recolocada em vesículas sinápticas ou ser
metabolizada. A inibição desse processo pode ser feita pela injeção de
metilfenidato, um potente inibidor do transportador de dopamina (EMILIEN et
al., 1999). O metilfenidato é um medicamento psicoestimulante usado no
26
tratamento do transtorno de déficit de atenção e hiperatividade e da
narcolepsia, embora também venha sendo utilizado com fins não terapêuticos,
por exemplo para produzir euforia, aumentar a autoestima e obter o chamado
aprimoramento neurocognitivo, diminuindo a sensação de cansaço e
aumentando o foco e a atenção, o que tem gerado extrema discussão no
âmbito social. Entretanto, o metilfenidato é uma substância que promove
robusto efeito hiperlocomotor em roedores, amplamente utilizado para estudo
de perturbações comportamentais, como por exemplo, para promover em
animais de laboratório o comportamento semelhante ao estado de mania do
transtorno bipolar (BARBOSA et al., 2011).
1.4.2. Receptores dopaminérgicos
Interações moleculares específicas determinam a especificidade e
eficácia da sinalização das vias dopaminérgicas, que são amplamente
conservadas em animais vertebrados e invertebrados. O efeito da dopamina é
transduzido através de receptores acoplados a proteína G (GPCRs) presentes
na superfície das células, que são caracterizados por sete domínios
transmembranas e baseado nos perfis farmacológicos e na especificidade de
ligação ao tipo de proteína G, são classificados como do tipo D1 ou D2
(GINGRICH e CARON, 1993; MISSALE et al., 1998). Os receptores do tipo D1
sinalizam por meio de proteína G estimulatória, enquanto os receptores do tipo
D2 sinalizam por meio de proteína G inibitória (figura 5).
27
Figura 4 - Esquema das estruturas evidenciando diferenças gerais comparativas entre receptores dopaminérgicos dos tipos D1 e D2.O 3º loop intracelular de D2 é maior que o de D1, característica peculiar dos receptores acoplados a proteína G inibitória (Fonte: PANDEY et al., 2013).
Ambos os tipos de receptor de dopamina, D1 e D2, estão envolvidos no
controle da locomoção. Desde que foram identificados, observou-se que os
diferentes subtipos de receptores da dopamina possuem papeis
fisiopatológicos distintos nas vias de sinalização de disfunções (ZHANG et al.,
2007). Estes receptores têm representado alvos para o desenvolvimento de
drogas e radioligantes para tratamentos e diagnósticos por imagem.
Componentes que se ligam especificamente a certo tipo de receptor de
dopamina podem ativar ou inibir suas ações biológicas, assim como promover
um tratamento racional para o mau funcionamento da sinalização decorrente
deste subtipo de receptor (para revisão: ZHANG et al., 2007; BEAULIEU et al.,
2011).
Embora a família D1 de receptores seja mais abundante no cérebro de
mamíferos, há grande interesse terapêutico no estudo da família D2. Agonistas
do receptor D2 têm sido utilizados com sucesso para reduzir sintomas da
doença de Parkinson, enquanto que os antagonistas deste têm sido úteis no
28
tratamento da esquizofrenia e de transtornos psicóticos (para revisão, ZHANG
et al., 2007).
O sulpiride é um antagonista seletivo de receptores D2 e tem sido
classificado clinicamente como um antipsicótico atípico ou de segunda geração
(BEAULIEU e GAINETDINOV, 2011). Na pesquisa básica, a inibição do
receptor D2 por meio da administração de sulpiride tem sido uma ferramenta
oportuna para influenciar a transmissão dopaminérgica e as funções
dependentes de dopamina bloqueando essa atividade, o que auxilia o estudo
de novos compostos e distúrbios em nível sistêmico.
1.4.3. Vias dopaminérgicas
Para efeitos didáticos, sumariamente são descritas quatro vias
dopaminérgicas: mesolímbica, mesocortical, nigroestriatal e túbero-infundibular.
As vias dopaminérgicas centrais estão esquematizadas na figura 6. Os
neurônios dopaminérgicos que se originam na área tegmentar ventral formam
duas vias: a via mesolímbica, com neurônios que se projetam para regiões
subcorticais límbicas (núcleo accumbens, septo, corpo amigdalóide), que está
envolvida na regulação de emoções e motivação; e a via mesocortical, cujos
terminais se distribuem para áreas corticais límbicas, como o córtex piriforme, o
córtex entorrinal e, principalmente, para o córtex pré-frontal. Já os neurônios
dopaminérgicos hipotalâmicos que se projetam para a glândula pituitária
formam a via túbero-infundibular, cujo papel funcional é suprimir a liberação de
prolactina (para revisão: TARAZI, 2001).
Ainda, a via nigroestriatal tem origem em neurônios do mesencéfalo
provenientes da parte compacta da substância nigra (SNc). Os axônios desses
29
neurônios fornecem inervação rica em dopamina para o estriado e também, de
forma mais limitada, para outras regiões nos núcleos basais (para revisão:
RICE, PATEL e CRAGG, 2011).
O desequilíbrio das vias centrais produtoras de dopamina pode levar a
diferentes estados patológicos. Redução da dopamina no córtex pré-frontal e a
desinibição da liberação de dopamina na via mesolímbica são vistas em
pacientes esquizofrênicos (KIENAST e HEINZ, 2006). Além disso, os neurônios
dopaminérgicos do núcleo accumbens encontram-se implicados em estados de
dependência e também exercem papel nos processos de recompensa,
motivação, aprendizado e memória (para revisão: GRAYBIEL, 2005). Ainda,
perda da dopamina do estriado é a causa da perda do controle motor em
pacientes com doença de Parkinson (LOTHARIUS e BRUNDIN, 2002).
Figura 5 – Vias centrais de dopamina. Os neurônios dopaminérgicos originam-se de certo número de núcleos específicos no cérebro. Os neurônios que se originam no hipotálamo e projetam-se para a hipófise (seta azul - via túbero-infundibular) são tonicamente ativos e inibem a secreção de prolactina. Os neurônios que se projetam da substância negra para o estriado (setas em pontilhado – via nigroestriatal) regulam o movimento. Acredita-se que os neurônios dopaminérgicos que se projetam da área tegmental ventral para o sistema límbico e o córtex pré-frontal (setas pretas cheias – vias mesolímbica e mesocortical, respectivamente) desempenham papéis na regulação do humor e do comportamento. (GOLAN et al., 2009)
30
É sabido que os núcleos da base, cujos neurônios recebem projeções
dopaminérgicas da substância nigra, controlam finamente o movimento
voluntário. Os núcleos da base contêm caminhos distintos para exercer o
controle do movimento: a via direta e a via indireta. Em linhas gerais, a via
direta é a via estimulatória do movimento, enquanto a via indireta é inibitória, e
o equilíbrio de atividade entre as vias direta e indireta regula o movimento
conforme esquematizado na figura 6.
Figura 6 – Diagrama ilustrativo das vias dopaminérgicas direta e indireta. (a) A via direta (que conduz à liberação de movimento) é constituído por duas conexões GABAérgicas sucessivas, partindo do corpo estriado para o pálido interno, e do pálido interno para o tálamo. Este diagrama de fluxo sugere que o influxo excitatório (glutamato; Glu) do neocórtex para o estriado iria desinibir neurônios talâmicos. A dopamina modula o sistema principalmente no estriado, onde ativa os receptores de dopamina D1-classe e da classe D2. (b) Na via indireta (que conduz à inibição de movimento), há um passo extra após o pálido externo, de modo que o núcleo subtalâmico excita o pálido interno. (c) O equilíbrio é atingido quando estes sistemas antagonistas são combinados sob circunstâncias normais. Figura adaptada de GRAYBIEL, 2000
31
A via direta, formada por neurônios estriatais que expressam
primariamente receptores D1, projeta fibras inibitórias para o segmento interno
do globo pálido, o qual inibe tonicamente o tálamo, que, por sua vez, envia
projeções excitatórias ao córtex dando início ao movimento. Dessa maneira, a
ativação da via direta desinibe o tálamo, isto é, a via direta estimula o
movimento. A dopamina oriunda da substância negra estimula os receptores
excitatórios D1, que por sua vez, estimulam a via direta. A via indireta, formada
por neurônios estriatais que expressam predominantemente receptores D2,
projeta-se para o segmento externo do globo pálido, que, por sua vez, inibe
neurônios no núcleo subtalâmico. Os neurônios no núcleo subtalâmico são
neurônios glutamatérgicos excitatórios que se projetam para o segmento
interno do globo pálido. Em consequência dessa via em múltiplas etapas, a
ativação da via indireta desinibe os neurônios do núcleo subtalâmico, que, por
sua vez, estimulam neurônios no segmento interno do globo pálido a inibir o
tálamo, isto é, a via indireta inibe o movimento. Os receptores inibitórios do tipo
D2 presentes no estriado exercem o papel de bloquear essa via indireta,
contribuindo para a execução o movimento (para revisão: GRAYBIEL, 2000).
Dessa forma, a dopamina tem papel fundamental na locomoção, pois
age como neurotransmissor excitatório na via direta, e inibitório na via indireta,
de modo que a via nigroestriatal facilita o movimento estimulando a via que
promove o movimento e dificultando a via que inibe o movimento.
32
2. JUSTIFICATIVA
Pouca informação está disponível na literatura sobre o papel da
neurotransmissão dopaminérgica na mediação das ações biológicas induzidas
pelo NPS. Apenas um estudo comportamental destacou a participação do
neurotransmissor dopamina no efeito hiperlocomotor oriundo da administração
central de NPS em ratos (MOCHIZUKI et al., 2010). Os mecanismos pelos
quais a ativação do receptor NPSR desencadeia a estimulação das vias
dopaminérgicas centrais ainda não foram completamente compreendidos. No
presente estudo, a administração central de NPS e seu efeito comportamental
na atividade locomotora serão avaliados mediante o desafio do sistema
dopaminérgico com substâncias que interferem com a homeostase da
dopamina em diferentes níveis.
Uma vez que a ativação do receptor NPSR produz ações mais restritas,
devido ao perfil único de expressão encefálica desses receptores, em
detrimento de drogas que influenciam sistemas de neurotransmissores
clássicos e, portanto, expressos de maneira indiscriminada no cérebro, o NPS
e seu receptor tornam-se um sistema de transmissão de grande valor para
novos alvos farmacológicos que podem ser úteis no tratamento de transtornos
que sabidamente envolvem a participação do sistema dopaminérgico, tais
como doença de Parkinson, esquizofrenia e abuso de drogas.
33
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
Este estudo objetivou investigar os efeitos locomotores da administração
icv de NPS em camundongos pré-tratados com substâncias mediadoras de
diferentes fases do processamento da neurotransmissão dopaminérgica.
3.2. Específicos
1. Verificar o efeito da injeção intracerebroventricular de NPS nas doses de
0,1 e 1 nmol na atividade locomotora espontânea de camundongos
avaliada no teste do campo aberto;
2. Avaliar o efeito do tratamento prévio com AMPT, um inibidor da síntese
de dopamina, na hiperlocomoção induzida por metilfenidato e por NPS
em camundongos submetidos ao teste do campo aberto;
3. Avaliar o efeito do tratamento prévio com reserpina, um inibidor do
transportador vesicular de catecolaminas, na hiperlocomoção induzida
por metilfenidato e por NPS em camundongos submetidos ao teste do
campo aberto;
4. Avaliar o efeito do tratamento prévio com o antagonista de receptor de
dopamina do tipo D2, o sulpiride, na hiperlocomoção induzida por
metilfenidato e por NPS em camundongos submetidos ao teste do
campo aberto.
34
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Animais
Para a execução deste estudo, foram empregados camundongos Swiss
machos pesando entre 30 e 35 g provenientes do biotério do Departamento de
Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os
animais foram alojados em caixas de polietileno, com livre acesso a comida e
água e foram mantidos em ciclo de 12 horas luz-escuro (6:00-18:00 h), em
ambiente climatizado. Todos os procedimentos experimentais deste plano de
trabalho foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA)
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Protocolos Nº 001/2009 e
015/2013).
4.2. Drogas e tratamentos farmacológicos
Para a realização deste estudo, foi utilizada a forma humana do
Neuropeptídeo S (hNPS), doado pelo Prof. R. Guerrini (Dept. of Biotechnology
and Pharmaceutical Chemistry, University of Ferrara, Itália). O NPS foi
solubilizado em solução salina e administrado intracerebroventricularmente
(icv) (XU et al., 2004).
O metilfenidato (Ritalina®; Novartis Brasil; São Paulo, SP) é um inibidor
preferencial da recaptação de dopamina. O metilfenidato foi utilizado como
controle positivo dos nossos experimentos devido ao fato desta droga produzir
efeito hiperlocomotor mediado pelo neurotransmissor dopamina. O
metilfenidato foi dissolvido em solução salina e administrado por via
subcutânea (sc), 15 min antes do início dos testes comportamentais
(BARBOSA et al., 2011).
35
O inibidor da enzima tirosina hidroxilase, α-metil-p-tirosina (AMPT;
Sigma-Aldrich, San Louis, MO, USA), foi utilizado para inibir a síntese de
dopamina. A substância foi dissolvida em solução salina com 2% de Tween-80,
administrado intraperitonealmente (ip), 24 horas antes do teste do campo
aberto, cujo protocolo foi adaptado de Fuentes et al.(2010).
A reserpina (Sigma-Aldrich, San Louis, MO, USA) é um fármaco
alcalóide que se liga aos transportadores presentes nas vesículas de
armazenamento de neurotransmissores catecolamínicos (a citar a dopamina,
noradrenalina e adrenalina) e serotonina, tornando estes neurotransmissores
indisponíveis para serem liberados na fenda sináptica. A reserpina foi
solubilizada em salina com quanto bastasse de ácido clorídrico. Depois de
solubilizada, a solução teve seu pH corrigido para níveis fisiológicos através da
adição de bicarbonato de sódio. A reserpina foi administrada sc 24h antes do
teste (BISONG et al., 2010).
O antagonista seletivo de receptores D2 sulpiride (Sigma-Aldrich, San
Louis, MO, USA) foi dissolvido em solução salina com ácido clorídrico e o pH
foi controlado com bicarbonato de sódio. O sulpiride foi administrado por via ip
45 minutos antes do teste comportamental (BINFARÉ et al., 2009).
As doses de AMPT, reserpina e sulpiride foram padronizadas em nossas
condições experimentais e foram testadas de acordo com a literatura, e com o
intuito de não causar alteração na atividade locomotora dos animais quando
submetidos ao teste do campo aberto em relação aos animais controles.
36
Grupos tratados com o veículo apropriado foram utilizados
simultaneamente como forma de controle. Todas as drogas foram
administradas em um volume de 10 ml/kg de camundongo.
4.3. Cirurgia para a implantação da cânula intracerebroventricular
(ICV) em camundongos
A implantação de uma cânula no ventrículo lateral de camundongos foi
realizada em camundongos anestesiados com ketamina 100 mg/kg e xilasina
10 mg/kg, ip, com auxílio do aparelho estereotáxico. A pele dos camundongos
da região craniana foi removida para facilitar a visualização do bregma, o qual
serve de ponto de partida para a orientação das coordenadas. Uma cânula-
guia de 8 mm foi implantada unilateralmente no ventrículo lateral de acordo
com as seguintes coordenadas: AP - 0,6 mm; ML + 1,1 mm; DV - 1,0 mm (de
acordo com Paxinos e Franklin (2008)). A cânula foi fixada com acrílico. Todo o
procedimento foi executado em condições de higiene e o local da incisão foi
tratado com o agente antisséptico iodo-povidine. Três a cinco dias após a
cirurgia de implantação da cânula no ventrículo lateral, os animais foram
tratados pela via intracerebroventricular com o auxílio de uma agulha (cujo
comprimento excede 1 mm a cânula-guia implantada), que permite a
administração da droga através da cânula-guia. A agulha foi ligada a um tubo
de polietileno, que por sua vez se encontrava conectado a uma microseringa
de Hamilton. O NPS foi injetado por meio desse sistema, em volume de 2 µl
administrados na velocidade de 1 µl/minuto.
4.4. Avaliação da atividade locomotora espontânea de camundongos
37
Cinco minutos após a injeção icv de NPS ou salina, os animais foram
submetidos ao teste do campo aberto por 60 min, sendo este período dividido
em blocos de 5 min. Este teste foi realizado em uma caixa de fórmica preta
quadrada contendo quatro campos abertos medindo 40 cm x 40 cm x 40 cm
cada um, de forma que quatro animais foram filmados e avaliados
simultaneamente. Os animais foram submetidos individualmente à exploração
no aparato e durante este período tiveram sua atividade locomotora aferida
através do emprego do software Any-Maze (Stoelting, USA), usando os
seguintes parâmetros comportamentais: distância percorrida (m) e tempo de
imobilidade (s), sendo que o tempo de imobilidade só foi mostrado para os
grupos testes NPS.
No início do teste, os animais costumam explorar mais o ambiente do
campo aberto, uma vez que não estão habituados àquele local. Ao longo do
teste, existe uma tendência dos animais a permanecerem menos ativos e mais
imóveis. Uma vez que o efeito do NPS é duradouro (XU et al., 2004), neste
trabalho as sessões de teste tiveram duração de uma hora.
4.5. Delineamento experimental
Experimento I: Avaliação do efeito comportamental do NPS em camundongos
no campo aberto
A fim de buscar a dose de NPS que provocasse efeito hiperlocomotor nos
animais em nossas condições experimentais, um grupo de camundongos foi
submetido à cirurgia estereotáxica para implantação da cânula-guia no
ventrículo lateral. Depois de 3 a 5 dias de recuperação, os camundongos foram
38
administrados com salina, NPS 0,1 nmol ou NPS 1 nmol via icv por meio da
cânula-guia, e submetidos ao campo aberto 5 min após a administração (figura
7).
Figura 7 - Delineamento experimental do Experimento I.
Experimento II: Efeito do tratamento prévio com AMPT na hiperlocomoção
induzida por metilfenidato e por NPS
Etapa A: Avaliação do efeito comportamental do AMPT em camundongos
no campo aberto
Na etapa A do experimento II, demonstrada na figura 8, os camundongos
receberam a injeção de veículo ou de uma das seguintes doses de AMPT:
100, 200, 250 ou 300 mg/kg, ip. Após o período de 24 h, os animais foram
submetidos ao campo aberto. A atividade locomotora dos animais foi
acessada a fim de saber qual das doses não alterava a locomoção dos
animais em relação ao grupo controle (veículo).
39
Figura 8 - Delineamento experimental da etapa A do experimento II.
Etapa B: Efeito da administração prévia de AMPT sobre a
hiperlocomoção do metilfenidato em camundongos no campo aberto
Vinte e quatro horas antes do teste comportamental, uma parte dos
animais recebeu injeção de AMPT 250 mg/kg, ip, e a outra parte
recebeu a injeção apenas do veículo onde o AMPT foi solubilizado. No
dia do teste, parte dos animais que receberam AMPT foi administrada
com metilfenidato 5 mg/kg, sc, e a outra parte foi administrada com
veículo de metilfenidato; da mesma forma, uma parte dos animais que
haviam recebido apenas o veículo de AMPT foi injetada com
metilfenidato e o restante recebeu o veículo do metilfenidato (figura 9).
Quinze minutos após a administração de metilfenidato ou veículo, os
animais foram submetidos ao campo aberto. O metilfenidato foi
empregado como forma de controle positivo do experimento, por possuir
efeito hiperlocomotor consistente ocasionado por aumento da
disponibilidade sináptica de dopamina.
40
Figura 9 – Delineamento experimental da etapa B do experimento II.
Etapa C: Efeito da administração prévia de AMPT sobre a
hiperlocomoção do NPS em camundongos no campo aberto
Camundongos passaram por cirurgia estereotáxica para implantação da
cânula no ventrículo lateral e tiveram 3 a 5 dias de recuperação. Os
animais devidamente canulados receberam AMPT 250 mg/kg, ip, ou
veículo de AMPT, ip, e 24 h depois, receberam NPS 1 nmol ou salina,
icv, visando avaliar se a pré-administração de AMPT modifica a
atividade locomotora dos animais que receberam NPS. O esquema
dessa etapa está mostrado na figura 10 a seguir.
Figura 10 - Delineamento experimental da etapa C do experimento II.
41
Experimento III: Efeito do tratamento prévio com reserpina na hiperlocomoção
induzida por metilfenidato e por NPS
Etapa A: Avaliação do efeito comportamental da reserpina em
camundongos no campo aberto
A fim de investigar a dose de reseprina a ser empregada neste estudo,
camundongos foram administrados com as doses de 1, 2 ou 5 mg/kg de
reserpina, sc, ou ainda, veículo de reserpina. Vinte e quatro horas
depois, os animais foram submetidos ao campo aberto, conforme mostra
a figura 11.
Figura 11 - Delineamento experimental da etapa A do experimento III
Etapa B: Efeito da administração prévia de reserpina sobre a
hiperlocomoção do metilfenidato em camundongos no campo aberto
Camundongos receberam reserpina 2 mg/kg ou veículo, por via s.c., e
vinte e quatro horas depois, foram administrados com o controle positivo
metilfenidato 5 mg/kg, s.c. ou salina, conforme esquematizado na figura
42
12. A avaliação do comportamento locomotor do animal foi acessada no
campo aberto.
Figura 12 - Delineamento experimental da etapa B do experimento III.
Etapa C: Efeito da administração prévia de reserpina sobre a
hiperlocomoção do NPS em camundongos no campo aberto
A figura 13 demonstra o esquema da etapa C. Camundongos foram
submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação de cânula guia no
ventrículo lateral, e foram tratados 3 a 5 dias depois com reserpina 2
mg/kg, sc, ou com veículo. Após 24 h, os animais receberam NPS 1
nmol ou salina icv e foram submetidos ao campo aberto depois de 5 min,
a fim de avaliar se o tratamento com reserpina altera a atividade
locomotora dos animais que receberam NPS.
43
Figura 13 - Delineamento experimental da etapa C do experimento III.
Experimento IV: Efeito do tratamento prévio com sulpiride na hiperlocomoção
induzida por metilfenidato e por NPS
ETAPA A: Avaliação do efeito comportamental de sulpiride em
camundongos no campo aberto
Camundongos foram tratados com veículo ou sulpiride nas doses de 25
ou 50 mg/kg, ip, então, depois de 45 min, foram colocados no campo
aberto para avaliação da atividade locomotora, conforme esquematizado
na figura 14. Essa etapa visou escolher a dose de sulpiride que não
afetasse a locomoção espontânea dos animais no campo aberto.
Figura 14 - Delineamento experimental da etapa A do experimento IV.
44
ETAPA B: Efeito da administração prévia de sulpiride sobre a
hiperlocomoção do metilfenidato em camundongos no campo aberto
Camundongos foram pré-tratados com sulpiride 25 mg/kg ou veículo, ip,
e 45 min depois, foram administrados com metilfenidato 5 mg/kg ou
veículo, sc, conforme esquematizado abaixo na figura 15. Quinze
minutos após a administração de metilfenidato ou veículo, os animais
foram submetidos ao campo aberto.
Figura 15 - Delineamento experimental da etapa B do experimento IV.
ETAPA C: Efeito da administração prévia de sulpiride sobre a
hiperlocomoção do NPS em camundongos no campo aberto
Camundongos canulados no ventrículo lateral por meio de cirurgia
estereotáxica foram utilizados. Três a 5 dias após o procedimento, eles
receberam injeção de sulpiride 25 mg/kg ou veículo, ip. Os animais
foram administrados com NPS 1 nmol ou salina, icv, 45 min depois da
administração de sulpiride ou veículo, conforme esquematizado abaixo
45
(figura 16), a fim de avaliar se a pré-administração de sulpiride provoca
alteração na hiperlocomoção causada pela administração de NPS em
camundongos submetidos ao campo aberto.
Figura 16 - Delineamento experimental da etapa C do experimento IV.
4.6. Análise estatística
Os dados foram demonstrados por média ± erro padrão da média da
distância percorrida e do tempo de imobilidade dos animais. Os grupos
controles foram tratados com veículo do pré-tratamento e do NPS, os quais
foram a referência para os grupos com diferentes pré-tratamentos. As
diferenças entre os grupos experimentais foram determinadas por ANOVA de
uma via seguida do teste de post-hoc Gabriel. O nível de significância
assumido foi para valores de p≤0,05. Para a realização das análises
estatísticas empregadas neste estudo foram utilizados os softwares GraphPad
Prism 5 e PASW Statistic 18.
46
5. RESULTADOS
5.1. Experimento I: Efeito da administração de NPS na atividade
locomotora dos camundongos no teste do campo aberto
A atividade locomotora de camundongos submetidos ao teste do campo
aberto após a administração de duas doses de NPS, a saber, 0,1 e 1 nmol, foi
acessada no experimento I. ANOVA de uma via seguida pelo teste de post hoc
de Gabriel apontou diferença estatística na distância total percorrida entre o
grupo que recebeu a dose de 1 nmol de NPS e o grupo controle (F(2,27)=13,580,
p<0,05) (figura 17). Portanto, apenas a dose mais alta de NPS promoveu ação
hiperlocomotora em nossas condições experimentais, sendo esta a escolhida
para guiar as fases seguintes deste estudo.
Figura 17 – Efeito da administração de NPS nas doses de 0,1 e 1 nmol e na atividade locomotora de camundongos submetidos ao teste do campo aberto: (a) distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min;(b)distância total percorrida (m). Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 5-10 animais por grupo. *p<0,05 vs. controle, ANOVA, post hoc de Gabriel.
5.2. Experimento II: Efeito do tratamento prévio com AMPT na
hiperlocomoção induzida por metilfenidato e por NPS
47
O efeito da administração de AMPT nas doses de 100, 200, 250 e 300
mg/kg na atividade locomotora de camundongos foi avaliado no teste do campo
aberto. Os animais que foram tratados com a dose de 300 mg/kg
demonstraram menor distância percorrida (F(4,37)=4,517, p<0,05) em relação ao
grupo controle, enquanto que as outras doses administradas não causaram
efeito na locomoção, como mostrado da figura 18 abaixo. A dose de 250 mg/kg
de AMPT foi a escolhida para ser usada na fase experimental por não causar
prejuízo na locomoção espontânea dos animais e por estar em conformidade
com a literatura (FUENTES et al., 2009).
Figura 18 – Efeito da administração de AMPT nas doses de 100, 200, 250 e 300 mg/kg, ip, 24h após o tratamento,em camundongos submetidos ao teste do campo aberto durante 60 min de observação. (a) distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min; (b) distância total percorrida. Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 5-10 animais por grupo. *p<0,05, ANOVA, post hoc Gabriel.
A figura 19 a seguir mostra o efeito do pré-tratamento com AMPT 250
mg/kg na atividade locomotora de animais tratados com metilfenidato 5 mg/kg e
submetidos ao teste do campo aberto. O metilfenidato per se causou
hiperlocomoção nos animais. A hiperlocomoção causada pelo metilfenidato foi
parcialmente revertida pelo pré-tratamento com AMPT, mostrando que o
comprometimento na síntese de dopamina afetou a ação hiperlocomotora de
48
metilfenidato (F(3,30)=35,968, p<0,05 metilfenidato vs. controle; p<0,05
AMPT/metilfenidato vs. metilfenidato; ANOVA, post hoc Gabriel).
Figura 19. Efeito do pré-tratamento com AMPT 250 mg/kg na hiperlocomoção causada por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto, durante 60 min de observação. (a) Distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min. (b) Distância total percorrida (m). Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 5-10 animais por grupo.*p<0,05 vs. controle; #p<0,05 vs. metilfenidato; ANOVA, post hoc Gabriel.
A figura 20 mostra o efeito do pré-tratamento com AMPT 250 mg/kg na
hiperlocomoção causada pelo NPS. ANOVA de uma via seguida do post hoc
de Gabriel apontou diferença estatística entre o grupo NPS em relação ao
grupo controle, bem como entre o grupo que foi administrado com a associação
AMPT/NPS em relação ao grupo controle (distância total percorrida:
F(3,43)=8,926, p<0,05 vs. controle; tempo de imobilidade total: F(3,43)=10,120,
p<0,05), porém não apontou diferença estatística entre o grupo NPS e o grupo
da associação AMPT/NPS em nenhum dos parâmetros, demonstrando que o
efeito hiperlocomotor do NPS não fora prejudicado pelo pré-tratamento com
AMPT.
49
Figura 20. Efeito do pré-tratamento com AMPT 250 mg/kg na hiperlocomoção causada pelo tratamento com NPS em camundongos submetidos ao teste do campo aberto por 60 min. (a) Distância percorrida (m) ao longo do tempo,apresentada em blocos de 5 min. (b) Distância total percorrida (m). (c) Tempo de imobilidade (s) apresentado em blocos de 5 min. (d) Tempo de imobilidade (s) acumulado durante o teste. *p<0,05 vs. Controle; ANOVA, post hoc de Gabriel.
5.3. Experimento III: Efeito do tratamento prévio com reserpina na
hiperlocomoção induzida por metilfenidato e por NPS
A figura 21 ilustra o efeito da administração de reserpina nas doses de 1,
2 e 5 mg/kg na distância percorrida (m) e no tempo de imobilidade (s) dos
camundongos durante 60 min de teste do campo aberto. ANOVA de uma via
não apontou diferença estatística entre as doses administrada. A dose
intermediária de 2 mg/kg foi escolhida para conduzir os experimentos
seguintes.
50
Figura 21 – Efeito da administração de reserpina nas doses de 1, 2 e 5 mg/kg, sc, 24h,em camundongos submetidos ao teste do campo aberto durante 60 min de observação. (a) distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min; (b)distância total percorrida. Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 7-10 animais por grupo.
A figura 22 ilustra o efeito do pré-tratamento com reserpina 2 mg/kg na
hiperlocomoção induzida por metilfenidato. ANOVA de uma via seguida do post
hoc de Gabriel mostrou diferença significativa entre o grupo metilfenidato e o
grupo controle, assim como mostrou diferença entre o grupo
reserpina/metilfenidato em relação ao grupo metilfenidato (F(3,51)=85,227,
p<0,05), mostrando que o pré-tratamento com reserpina reduziu parcialmente o
efeito hiperlocomotor induzido por metilfenidato.
Figura 22 – Efeito do pré-tratamento com reserpina 2 mg/kg na hiperlocomoção induzida por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto, durante 60 min de observação. (a) Distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min. (b) Distância total
51
percorrida. Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 5-10 animais por grupo.*p<0,05 vs. Controle; #p<0,05 vs. Metilfenidato; ANOVA, post hoc Gabriel.
O resultado da pré-administração de reserpina 2 mg/kg na atividade
locomotora de animais tratados com NPS está demonstrado na figura 23.
ANOVA de uma via seguida do post hoc de Gabriel apontou diferença
estatística na distância total percorrida entre o grupo reserpina/NPS e o grupo
NPS, mostrando que a reserpina provocou perda parcial do efeito
hiperlocomotor induzido pelo NPS (F(3,50)=8,46; p<0,05).
Figura 23 – Efeito do pré-tratamento com reserpina 2 mg/kg na hiperlocomoção causada pelo tratamento com NPS em camundongos submetidos ao teste do campo aberto por 60 min. (a) Distância percorrida(m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min. (b) Distância total percorrida (m). (c) Tempo de imobilidade (s) , apresentadoem blocos de 5 min. (d) Tempo de imobilidade (s) acumulado durante o teste. *p<0,05 vs. Controle; #p<0,05 vs. NPS. ANOVA, post hoc de Gabriel.
5.4. Experimento IV: Efeito do tratamento prévio com sulpiride na
hiperlocomoção induzida por metilfenidato e por NPS
52
A figura 24 mostra o efeito da administração de sulpiride nas doses de
25 e 50 mg/kg na distância percorrida (m) e no tempo de imobilidade (s) de
camundongos submetidos ao teste do campo aberto. ANOVA de uma via
apontou diferença estatística entre o grupo que recebeu a dose de 50 mg/kg
em relação ao grupo controle (F(2,25)=3,548, *p<0,05). A dose de 25 mg/kg foi a
escolhida para dar prosseguimento ao estudo por não causar alteração na
atividade locomotora dos animais.
Figura 24 – Efeito da administração de sulpiride nas doses de 25 e 50 mg/kg, ip, 45 min, em camundongos submetidos ao teste do campo aberto durante 60 min de observação. (a) distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min, (b) distância total percorrida (m). Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 7-10 animais por grupo. *p<0,05 vs. Controle. ANOVA, post hoc de Gabriel.
O efeito da administração de sulpiride em animais tratados com
metilfenidato está demonstrado nos gráficos da figura 25. O pré-tratamento
com sulpiride inibiu de forma parcial a hiperlocomoção induzida por
metilfenidato, conforme apontado pela ANOVA de uma via seguida de post hoc
de Gabriel (F(3,37)=40,202, p<0,05).
53
Figura 25 – Efeito do pré-tratamento com sulpiride 25 mg/kg na hiperlocomoção causada por metilfenidato 5 mg/kg no teste do campo aberto, durante 60 min de observação. (a) Distância percorrida (m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min. (b) Distância total percorrida (m). Os pontos representam a média ± erro padrão da média de 5-10 animais por grupo.*p<0,05 vs. Controle; #p<0,05 vs. Metilfenidato; ANOVA, post hoc Gabriel.
Os gráficos da figura 26 abaixo apresentam o efeito do pré-tratamento
com sulpiride na distância percorrida (m) e no tempo de imobilidade (s) dos
animais tratados com NPS e submetidos ao teste do campo aberto. ANOVA de
uma via seguida do teste de post hoc de Gabriel apontou diferença estatística
entre o grupo tratado com sulpiride/NPS e o grupo tratado somente com NPS
(distância total percorrida: F(3,43)=9,932, p<0,05 para NPS vs. controle e
sulpiride/NPS vs. NPS; tempo de imobilidade: F(3,43)=13,363, p<0,05 para NPS
vs. controle e sulpiride/NPS vs. NPS).
54
Figura 26. Efeito do pré-tratamento com sulpiride 25 mg/kg na hiperlocomoção induzida pelo NPS em camundongos submetidos ao teste do campo aberto por 60 min. (a) Distância percorrida(m) ao longo do tempo, apresentada em blocos de 5 min. (b) Distância total percorrida (m). (c) Tempo de imobilidade (s) apresentado em blocos de 5 min. (d) Tempo de imobilidade (s) acumulado durante o teste. *p<0,05 vs. Controle; #p<0,05 vs. NPS. ANOVA, post hoc de Gabriel.
55
6. DISCUSSÃO
Dados da literatura apontam para um efeito hiperlocomotor consistente
produzido pela administração de NPS em roedores. No entanto, pouca
informação está disponível sobre o mecanismo pelo qual o NPS promove ação
psicoestimulante. Assim, considerando que os fármacos psicoestimulantes
clássicos, como anfetaminas, cocaína e metilfenidato, promovem ação
mediada pelo incremento da neurotransmissão dopaminérgica, o presente
estudo visou investigar o papel da neurotransmissão dopaminérgica no efeito
hiperlocomotor do NPS. Para tanto, inicialmente verificou-se o efeito da
administração icv de NPS bem como do metilfenidato, administrado por via
sistêmica, em camundongos em nossas condições experimentais.
No experimento I deste estudo, foram testadas as doses de NPS que
causariam efeito hiperlocomotor em nosso ambiente de experimentação, e
conforme mostrado na figura 17, a dose que produziu efeito hiperlocomotor
consistente e duradouro foi a de 1 nmol de NPS. O efeito psicoestimulante da
administração central de NPS (icv) em roedores já foi observado em vários
laboratórios, e em diversas doses, variando entre 0,07 nmol (LEONARD et al.,
2008) e 1 nmol (RIZZI et al., 2008). A dose de 0,1 nmol foi utilizada em
diferentes condições experimentais e, na maioria dos estudos publicados na
literatura, esta dose promoveu efeito hiperlocomotor tanto em animais naive
quanto naqueles familiarizados ao ambiente, com duração de efeito de
aproximadamente uma hora (XU et al., 2004; ROTH et al., 2006; RIZZI et al.,
2008; CASTRO et al., 2009; JÜNGLING et al., 2009).
56
Estudos que utilizaram antagonistas do receptor NPSR mostraram que o
efeito psicoestimulante do NPS se dá exclusivamente por meio da ativação do
receptor NPSR, uma vez que a administração de antagonistas de NPSR não
mostrou efeito per se na atividade locomotora dos animais (GUERRINI et al.,
2010; OKAMURA et al., 2008; RUZZA et al., 2010, 2012). Outros estudos
utilizando camundongos knockout (KO) para o receptor NPSR observaram que
animais KO que receberam NPS via icv não apresentaram hiperlocomoção e
exibiram comportamento indistinguível de animais wildtype (WT) ou de animais
KO que receberam administração de veículo (DUANGDAO et al., 2009; FENDT
et al., 2011; RIZZI et al., 2012). Tomados em conjuntos, estes dados sugerem
que o sistema do NPS não controla de forma tônica a atividade locomotora e
promove seu efeito psicoestimulante por meio da ativação do receptor NPSR.
Para dar prosseguimento a discussão dos dados aqui descritos, foi útil o
emprego de animais tratados com metilfenidato, que é considerada uma droga
psicoestimulante clássica. O metilfenidato possui mecanismo de ação
conhecido, interferindo com o turnover de dopamina por inibir os recaptadores
desse neurotransmissor (GATLEY et al., 1999), permitindo que as moléculas
de dopamina fiquem mais tempo disponíveis na fenda sináptica, livres para
ativar receptores dopaminérgicos. Gatley e colaboradores (1999) fizeram um
estudo de avaliação da ocupação do transportador de dopamina após injeção
intravenosa de metilfenidato e cocaína em camundongos, e observaram que
doses de 1 mg/kg de ambas as substâncias foram associadas com ocupação
de cerca de 80% dos transportadores no estriado, 5 minutos depois da injeção,
e isso causou aumento da atividade locomotora dos animais, sendo que o
metilfenidato produziu ação estimulatória mais pronunciada que a cocaína.
57
Neste estudo, por se tratar de um agente psicoestimulante clássico, o efeito
hiperlocomotor do metilfenidato foi avaliado em animais pré-tratados com as
mesmas substâncias que foram administradas aos grupos experimentais de
NPS, como o AMPT, a reserpina e o sulpiride.
Na fase experimental II, na etapa A, foi avaliado o efeito do pré-
tratamento com a dose de AMPT, 250 mg/kg em animais tratados com
metilfenidato e NPS (figuras 19 e 20). Nesta fase do estudo, foi observado que
o tratamento prévio com AMPT reduziu o efeito estimulatório do metilfenidato,
mas não causou alteração na hiperlocomoção promovida pelo NPS. Espera-se
que com o tratamento com AMPT 24 h antes da administração de metilfenidato
e do teste do campo aberto, feito na etapa B, tenha ocorrido uma inibição
provisória da síntese de catecolaminas, reduzindo os estoques de dopamina e
noradrenalina “recém-sintetizadas” e não necessariamente citosólicos. Logo,
sendo a dopamina o neurotransmissor principal responsável por causar
hiperlocomoção quando os animais são tratados com metilfenidato, acredita-se
que a disponibilidade reduzida de dopamina “recém-sintetizada” devido ao
bloqueio da enzima tirosina hidroxilase afetou o efeito estimulante do
metilfenidato, reduzindo-o.
A redução do efeito hiperlocomotor do metilfenidato em animais pré-
tratados com AMPT não está de acordo com a literatura. De fato, Finn e
colegas (1990) mostraram que o pré-tratamento com AMPT per se,
administrado em duas doses de 50 mg/kg, 6 h e 2 h antes do teste, não
apresentou efeito na atividade locomotora de ratos e também não afetou o
efeito hiperlocomotor produzido por nenhuma das doses de metilfenidato
administradas (1-30 mg/kg) (FINN et al., 1990). O mesmo protocolo de
58
administração de AMPT (50 mg/kg, 6h e 2h antes da decaptação) foi utilizado
para contagem de catecolaminas e foi observada redução nos conteúdos de
dopamina e noradrenalina de 52% e 37%, respectivamente, em relação aos
animais controles (FINN et al. 1990). Portanto, pode-se concluir que a
administração de AMPT em doses e tempos de pré-tratamento bem menores
que as utilizadas no presente estudo afetaram significativamente os níveis de
monoaminas no encéfalo. Entretanto, neste mesmo estudo, os autores
mostraram que o pré-tratamento com AMPT produziu um robusto bloqueio da
estimulação da atividade locomotora de ratos tratados com anfetamina. Diante
desses achados, os autores concluíram que o metilfenidato, diferente da
anfetamina, tinha seu efeito estimulante baseado nos estoques de dopamina
vesicular (mas não citosólica). Ainda, conclui-se que a dopamina “recém-
sintetizada” e livre no citosol tem importância no efeito estimulatório produzido
pela anfetamina. Em acordo com esta hipótese, estudos apontam que a
anfetamina libera dopamina para o espaço extracelular por meio da inversão da
função do transportador de dopamina (para revisão: ESPAÑA e JONES, 2014).
No presente estudo, a dose de AMPT administrada e o tempo de sua
administração podem ter favorecido a redução da dopamina citosólica, mas
também vesicular, o que contribuiria para reduzir o efeito hiperlocomotor do
metilfenidato, haja visto que esse efeito parece depender somente dos níveis
de dopamina vesicular. De fato, o emprego de altas doses de AMPT (250
mg/kg) têm por objetivo induzir um estado semelhante ao Parkinson em
camundongos mutantes para o transportador da dopamina (FUENTES et al.,
2009).
59
Evidências apontam que a dopamina vesicular está separada em 3
pools: o pool “prontamente liberável” (readily releasable pool – RRP, que sofre
exocitose a estimulação moderada), o pool de reciclagem (que reabastece o
RRP) e o pool de reserva (que constitui cerca de 80 % das vesículas e é
mobilizado em períodos longos de estimulação) (NEVES e LAGNADO, 1999;
ORTIZ et al., 2011; RIZZOLI e BETZ, 2005). As vesículas que estocam
neurotransmissores nas sinapses químicas participam de um ciclo de
reciclagem (figura 4; para revisão, SUDHOF, 2004). Sudoff e colaboradores
(2004) propuseram um modelo de reciclagem e re-preenchimento de vesículas
por meio de duas vias: uma via rápida, quando as vesículas permanecem
ligadas a membrana pré-sináptica e estão prontas para liberar os
neurotransmissores novamente, e uma lenta, envolvendo endocitose, conforme
esquematizado na figura 27 (SUDHOF, 2004).
Figura 27 – O ciclo sináptico. Vesículas sinápticas são preenchidas com neurotransmissores por transporte ativo (passo 1) e formam um aglomerado de vesículas que podem representar o pool de reserva (passo 2). Vesículas cheias
ancoram na zona ativa (passo 3), onde elas passam por uma reação de fusão (passo 4) que deixam elas prontas para uma abertura de um poro de fusão desencadeado por
60
Ca2+ (passo 5). Depois da abertura do poro de fusão, as vesículas sinápticas sofrem endocitose e se reciclam por diferentes vias: reutilização local (passo 6), reciclagem rápida em intermediário endossomal (passo 7), ou endocitose mediada por clatrina (passo 8) com reciclagem via endossomo (passo 9). Os passos na exocitose estão indicados por setas vermelhas e os passos de endocitose e reciclagem por setas amarelas. Figura adaptada de SUDHOF, 2004.
De acordo com essa teoria, pode-se propor que quando ocorre a inibição
reversível da enzima produtora de dopamina por meio da administração de
AMPT, os estoques de dopamina continuam sendo suficientes para
manutenção basal das funções motoras, de modo que não é observado
qualquer estado hipolocomotor nos animais, embora estejam com a reposição
de dopamina recém-sintetizada deficiente. Cabe ressaltar que apesar do pré-
tratamento com AMPT ter prejudicado o efeito hiperlocomotor do metilfenidato,
nenhuma alteração da ação do NPS foi observada, sugerindo que
possivelmente o efeito hiperlocomotor do NPS não dependa do pool de
vesículas dopaminérgicas e noradrenérgicas possivelmente afetadas por este
protocolo de tratamento do AMPT. Experimentos que visam inibir a atividade da
enzima tirosina hidroxilase e, consequentemente, reduzir especificamente os
níveis citosólicos de dopamina, como através da administração de AMPT em
doses menores e com menores períodos de pré-tratamento, são fundamentais
para verificar se o efeito hiperlocomotor do metilfenidato e NPS é dependente
dos estoques citosólicos de catecolaminas. .
A proposição de que nos neurônios dopaminérgicos existem dois tipos
de dopamina é para fins didáticos. Sugere-se que a dopamina recém-
sintetizada ou citosólica é sensível ao AMPT (BESSON et al., 1969), e aquela
guardada em vesículas, é sensível à reserpina (ARBUTHNOTT et al., 1990). A
reserpina afeta todos os estoques de dopamina vesicular, deixando intacto o
61
compartimento de dopamina que não é guardado em vesículas, ou seja, aquele
disponível no citosol. Propõe-se que em situação de emergência, como aquela
durante estimulação elétrica de alta frequência nas vias dopaminérgicas,
ambos os estoques de dopamina são mobilizados (MICHAEL et al., 1987).
A fim de avaliar a participação dos estoques vesiculares na
hiperlocomoção causada por NPS, no experimento III, a reserpina, substância
que prejudica o armazenamento de catecolaminas em vesículas, foi utilizada
como pré-tratamento. Os neurotransmissores que estão contidos em vesículas
são liberados na fenda sináptica para atingirem seus respectivos receptores e
produzir uma resposta neuronal. Em resposta à sinalização gerada pelo
impulso nervoso, ocorre a fusão entre a membrana da vesícula e a membrana
pré-sináptica, liberando no espaço sináptico os neurotransmissores estocados.
A dopamina é uma das catecolaminas que teve o processo de armazenamento
em vesículas prejudicado nos animais que receberam injeção de reserpina, 24h
antes do tratamento com metilfenidato ou NPS. Thomas e colaboradores
(2008) realizaram um trabalho em que a administração de reserpina foi feita
usando um protocolo muito próximo ao que foi feito no presente estudo, 2,5
mg/kg, ip, 24 h de pré-tratamento em camundongos, e eles encontraram que a
reserpina causou a perda quase total de dopamina do estriado, diminuindo o
conteúdo deste neurotransmissor em até 97% (THOMAS et al., 2008).
A capacidade tanto do metilfenidato quanto do NPS em causar efeito
hiperlocomotor foi reduzida após o tratamento prévio com reserpina, como
mostram os dados das etapas B e C do experimento III (figuras 22 e 23); porém
cabe ressaltar que o pré-tratamento com reserpina não inibiu completamente o
efeito hiperlocomotor do metilfenidato e nem do NPS. Nossos achados estão
62
de acordo com os estudos de Scheel-Kruger (1971) que mostrou que altas
doses de reserpina (7,5 mg/kg, 18 h) inibem completamente o efeito
hiperlocomotor de metilfenidato em ratos, enquanto que baixas doses (1 mg kg)
só reduzem esse efeito parcialmente.
É esperado que devido ao efeito estimulante do NPS, ao ativar o
receptor NPSR, ocorra elevação do Ca+2 citoplasmático (PAPE et al., 2010),
promovendo consequentemente estimulação intracelular e inclusive liberação
de vesículas de neurotransmissores. Porém, supõe-se que o tratamento prévio
com reserpina tenha reduzido a quantidade de monoaminas estocadas em
vesículas, o que pode, por consequência, afetar o efeito hiperlocomotor do
NPS. Todavia, com os dados oriundos do pré-tratamento com reserpina não
podemos afirmar que dopamina é o único neurotransmissor envolvido na
mediação do efeito estimulante do NPS. Cabe considerar também uma
possível participação dos neurotransmissores serotonina e noradrenalina nesse
efeito. No entanto, é importante mencionar que as drogas estimulantes
atualmente conhecidas, como as anfetaminas e cafeína, promovem sua ação
mediada pela ativação da neurotransmissão dopaminérgica e bloqueio de
receptores adenosinérgicos, respectivamente (SCHEEL-KRÜGER, 1971; FINN
et al., 1990). Considerando que o efeito psicoestimulante do metilfenidato é
dependente do estoque dopaminérgico sensível à reserpina, pois depende da
dopamina que é liberada na fenda sináptica, é possível dizer que, de fato, o
tratamento com reserpina nas nossas condições experimentais tenha reduzido
a quantidade de dopamina que teve acesso ao interior das vesículas de
dopamina, haja visto que o metilfenidato teve seu efeito prejudicado.
63
Não há relato na literatura sobre a atuação do NPS especificamente em
pools vesiculares de dopamina, mas aqui neste estudo encontrou-se evidência
de que a atuação de NPS depende do estoque de dopamina vesicular, uma
vez que a inibição do processo de envesiculamento promovido pelo tratamento
com reserpina impediu que o NPS produzisse efeito hiperlocomotor nos
camundongos. No entanto, conforme já discutido, a inibição prévia da síntese
de dopamina por meio da administração de AMPT não inibiu o efeito do NPS,
evidenciando que o pool de dopamina “recém-sintetizada”, conforme o
protocolo de pré-tratamento com AMPT aqui utilizado, parece não ser relevante
para o aumento da atividade locomotora do NPS.
A fim de avaliar a participação dos receptores D2 dopaminérgicos no
efeito hiperlocomotor do NPS, foi utilizado o sulpiride como pré-tratamento no
experimento IV, devido ao seu papel de antagonista seletivo do receptor D2. O
receptor D2 de dopamina é modulador da própria transmissão dopaminérgica, e
participa da via indireta de coordenação do movimento. Os receptores
dopaminérgicos estão envolvidos em muitas funções, mas estão fortemente
comprometidos com a coordenação dos movimentos. Os receptores
dopaminérgicos do tipo D2 são predominantemente autorreceptores que estão
envolvidos na regulação pré-sináptica da taxa de disparo neuronal, bem como
no controle da síntese e da liberação de dopamina (BEAULIEU e
GAINETDINOV, 2011).
Os receptores D1 e D2 estão presentes na substância nigra, estriado e no
núcleo accumbens. O estriado é um dos principais componentes dos núcleos
basais, responsáveis pelo controle do movimento. A importância da liberação
de dopamina no estriado é evidente a partir das dificuldades motoras
64
apresentadas por pacientes com doença de Parkinson, a qual é caracterizada
por uma perda acentuada de neurônios nigroestriatais. A dopamina liberada no
estriado controla o movimento por duas vias, a direta e a indireta, que já foram
comentadas neste trabalho. Vale relembrar que o receptor D2 de dopamina
está expresso na via indireta, e a ativação desta se faz importante no controle
voluntário do movimento, tanto quanto a via direta, onde estão presentes os
receptores do tipo D1 (ELSWORTH e ROTH, 1997; GRAYBIEL, 2000;
BEAULIEU e GAINETDINOV, 2011).
Na primeira etapa do experimento IV do presente estudo (figura 24),
observou-se que a dose escolhida de sulpiride, 25 mg/kg, não causou alteração
da atividade locomotora per se. Na segunda etapa, a administração de sulpiride
antecedida à administração de metilfenidato reduziu o efeito hiperlocomotor
deste (figura 25).
De acordo com um estudo feito por Koek e Colpaert (1993), vários
antagonistas dopaminérgicos, seletivos ou não, inibiram de forma dose-
dependente os efeitos comportamentais (movimentos estereotipados e
hiperlocomoção) causados por metilfenidato em ratos (KOEK e COLPAERT,
1993). Outro estudo mostrou que a buspirona, agonista parcial de receptor de
serotonina 5-HT1A e antagonista de receptores D2 de dopamina, inibia os
comportamentos induzidos por metilfenidato em ratos, inclusive a
hiperlocomoção, e esse efeito era devido à sua atividade em receptores D2,
uma vez que a administração de um antagonista de serotonina não inibiu essa
ação da buspirona (KLEVEN et al., 1996).
O efeito do NPS mediante a pré-administração de sulpiride foi avaliado
na terceira etapa do estudo. O sulpiride administrado sistemicamente foi capaz
65
de inibir o efeito hiperlocomotor induzido pela administração central de NPS.
Dados da literatura mostram que a administração de NPS diretamente na área
tegmental ventral não promoveu efeito hiperlocomotor quando sulpiride foi
administrado no núcleo accumbens de ratos (MOCHIZUKI et al., 2010),
mostrando que a ativação da via dopaminérgica mesolímbica participa do efeito
do NPS na intensificação da locomoção.
No presente estudo, sulpiride foi administrado sistemicamente, na dose
de 25 mg/kg, 45 min antes da administração de metilfenidato ou NPS e
submissão ao teste. Embora o grupo tenha encontrado evidência da
participação da via mesolímbica no efeito hiperlocomotor do NPS, visto que as
administrações de NPS e sulpiride foram feitas na área tegmentar ventral e no
núcleo accumbens, respectivamente, a via nigroestriatal constitui a maior via da
transmissão dopaminérgica, possuindo cerca de 80% dos neurônios
dopaminérgicos. Além disso, esta via está completamente relacionada com
coordenação do movimento, uma vez que a perda desses neurônios está
relacionada à doença de Parkinson, uma das doenças degenerativas centrais
mais incapacitantes. Tendo em vista que a substância nigra, de onde partem os
neurônios dopaminérgicos da via, apresenta receptores NPSR, não se pode
descartar a participação desta via na excitação da atividade locomotora
promovida por NPS.
Visando investigar especificamente a participação da via nigroestriatal
no efeito hiperlocomotor do NPS, seriam úteis testes experimentais para
detecção local de monoaminas em decorrência do tratamento com NPS. O
modo mais comum de detecção de monoaminas é através de técnicas
eletroquímicas ou de microdiálise. Em técnicas eletroquímicas, com a ajuda de
66
microeletrodos implantados no cérebro, pode-se detectar de forma específica o
aumento de determinado neurotransmissor, no caso, a dopamina. A técnica de
microdiálise baseia-se no implante encefálico de sondas que recolhem
amostras do conteúdo extracelular, e este conteúdo é posteriormente separado
para detecção de substâncias por cromatografia líquida de alta performance
(HPLC, do inglês, high performance liquid chromatography) (PERRY, LI e
KENNEDY, 2009). Portanto, o emprego destas técnicas de detecção de
dopamina pode gerar resultados interessantes sobre a participação direta da
dopamina na mediação do efeito hiperlocomotor do NPS.
Outros dados da literatura suportam a participação da neurotransmissão
monoaminérgica, em particular dopaminérgica e serotoninérgica, na mediação
das ações induzidas por NPS. Si e colaboradores (2010) avaliaram o efeito da
administração central (icv) de NPS na liberação de dopamina e serotonina no
córtex medial pré-frontal por meio de microdiálise seguida de HPLC com
detecção eletroquímica para analisar as mudanças de dopamina, serotonina e
seus metabólitos extracelulares in vivo. Estes autores observaram por meio
dessa técnica que os níveis extracelulares de dopamina e de seus metabólitos
aumentaram no córtex pré-frontal de forma dose-dependente, enquanto que
não houve efeito significativo na transmissão serotoninérgica. Diante destes
dados, os autores defendem que o NPS pode aumentar a síntese de dopamina
nos neurônios pré-sinápticos, ou simplesmente aumentar o turnover de
dopamina, incluindo a liberação e a recaptação deste neurotransmissor (SI et
al., 2010). No entanto, na contramão da hipótese aqui proposta, Raiteri e
colegas (2009) demonstraram, através da técnica in vitro de sinaptossomas em
córtex frontal de camundongos, que o NPS inibiu fracamente a liberação de
67
dopamina dos sinaptossomas, enquanto que, neste mesmo estudo, o NPS, em
baixas concentrações (na faixa picomolar), inibiu a liberação dos
neurotransmissores serotonina e noradrenalina (RAITERI et al., 2009). O
presente estudo está baseado nessas hipóteses dos autores supracitados, os
quais apoiam a proposição da participação da dopamina no efeito
hiperlocomotor do NPS. Aqui neste estudo, buscou-se avaliar o comportamento
de camundongos frente à manipulação farmacológica do funcionamento da
neurotransmissão dopaminérgica por meio de substâncias que inibem alguma
das etapas limitantes do trajeto da dopamina no neurônio dopaminérgico,
compreendendo a síntese, o estoque e a ativação de receptores de dopamina.
Outros mecanismos de ação, além do dopaminérgico, já foram
propostos para explicar o efeito hiperlocomotor do NPS. Pañeda e
colaboradores (2009) demonstraram que o comportamento hiperlocomotor
induzido pelo NPS em camundongos foi prevenido quando os animais foram
previamente tratados com o antagonista do receptor CRF1 e também quando o
NPS foi administrado em camundongos knockout para o receptor CRF1.
Posteriormente, foi demonstrado o papel do sistema adenosinérgico na
hiperlocomoção induzida por NPS (BOECK et al., 2010). A administração de
antagonistas não-seletivos e seletivos para o receptor A2A inibiu o efeito
hiperlocomotor dos animais. No entanto, a administração do antagonista
seletivo para o receptor A1 aumentou a distância percorrida pelos animais
tratados com NPS (BOECK et al., 2010). Além disso, Pacheco e colaboradores
(2011) observaram a dependência do efeito hiperlocomotor induzido pelo NPS
da enzima ecto-5´-nucleotidase, responsável pela geração de adenosina a
partir do ATP. Em conjunto, estas evidências suportam a participação dos
68
sistemas adenosinérgico e peptidérgico do CRF na mediação do efeito
hiperlocomotor do NPS.
Os dados aqui apresentados trazem evidências que reforçam a
participação do sistema dopaminérgico no efeito psicoestimulante do NPS. O
sistema dopaminérgico tem sido alvo de discussão devido a vários motivos. Os
neurônios dopaminérgicos estão envolvidos criticamente em várias funções
vitais desenvolvidas pelos sistemas centrais incluindo movimento voluntário,
ingestão de alimento, reforço, sono, atenção, memória e aprendizado entre
outras tarefas. Devido aos problemas sociais e clínicos envolvidos no
desequilíbrio das vias dopaminérgica, especialmente no abuso de drogas,
pelas propriedades de reforço exercidos pela dopamina, e na doença de
Parkinson, onde há degeneração irreversível de neurônios dopaminérgicos,
esse sistema tem sido estudado intensivamente a fim de buscar novas
propostas para tratamentos com efeitos colaterais mínimos. O envolvimento do
sistema dopaminérgico nas ações promovidas pelo NPS candidatam o receptor
NPSR como alvo farmacológico para novos antiparkinsonianos, por exemplo,
embora deva ser considerado a dependência química como potencial efeito
adverso.
69
7. CONCLUSÃO
No presente estudo observou-se que, em nossas condições de
experimentação, o efeito hiperlocomotor do NPS, revelado no aumento da
distância percorrida e na redução do tempo de imobilidade de camundongos
submetidos ao campo aberto, foi presente em animais tratados com a dose de
1 nmol, mas não com doses mais baixas.
O efeito hiperlocomotor do NPS não foi afetado em camundongos que
foram previamente administrados com AMPT, inibidor da síntese de dopamina,
administrado 24 h antes da administração de NPS. Esse pré-tratamento
diminuíu o efeito estimulante do metilfenidato, sugerindo que a ação
hiperlocomotora do metilfenidato, mas não do NPS, dependa dos estoques de
catecolaminas “recém-sintetizadas”.
Foi encontrado também que o efeito do NPS foi prejudicado pelo tratamento
prévio com reserpina (inibidor da captação da monoaminas pelas vesículas
sinápticas) e sulpiride (antagonista de receptores dopaminérgicos D2), assim
como o foi prejudicado o efeito do metilfenidato, que foi parcialmente inibido.
Esses dados propõem que as monoaminas, em particular a dopamina, contidas
em estoques vesiculares, bem como a ativação dos receptores dopaminérgicos
D2 são necessários para a manutenção da hiperlocomoção promovida por NPS
e metilfenidato.
Tomados em conjunto, esses dados apontam para novas evidências da
participação do sistema dopaminérgico central no efeito hiperlocomotor do
NPS. Esses resultados reafirmam a potencialidade do sistema do NPS em ser
70
candidato para novos alvos terapêuticos, como no tratamento da doença de
Parkinson, porém, para isso, ainda ficam outros questionamentos que serão
discutidos em estudos futuros.
71
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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