Plazmīdu iekšmolekulārās rekombinācijas testsistēmas konstruēšana un pielietojuma...

Plazmīdu iekšmolekulārās rekombinācijas

testsistēmas konstruēšana un pielietojuma perspektīvas

M. Purviņa, I. Muižnieks

LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra

Rekombinācija – bioķīmisku reakciju virkne, kuras rezultātā nukleīnskābēs tiek sarautas un atkal savienotas fosfodiestersaites un notiek nukleīnskābju fragmentu apmaiņa, insercijas, delēcijas, inversijas, kā arī citi pārkārtojumi

Rekombinācijas tipi –

• homologā rekombinācija;

• sait-specifiskā rekombinācija;

• nelikumīgā rekombinācija.

RecA – proteīns, kurš baktērijās nepieciešams homologās (bet ne tikai) rekombinācijas procesam

Darba mērķisIzveidot testsistēmu iekšmolekulārās rekombinācijas novērošanaiUzskaitīt rekombināciju biežumu dažādās testsistēmas plazmīdās, atkarībā no baktēriju recA gēna aktivitātes

Sākotnējie novērojumiPlazmīdās, kuru struktūrā atrodami tieši nukleotīdu secības atkārtojumi, novērojama spontāna delēciju veidošanās.Delēciju veidošanās biežumu ietekmē nukleotīdu secība starp tiešajiem atkārtojumiem.Delēcijas notiek rekombinējot tiešo atkārtojumu secībām.Delēciju veidošanās process ir recA atkarīgs.

Poliadenilēšanas signāla secības tiešo atkārtojumu veidā norobežo reportiergēna rajonu promoteru pārbaudes plazmīdās, regulējot eikariotu šūnās veidojamās mRNS transkripta struktūru

1,2 – sākotnēji iegūto rekombinanto plazmīdu preparāti (no 1,5 ml)

3,4 – no klonu (1) un (2) 50 ml kultūrām attīrīta plazmīdu DNS

Strukturāli nestabilo promotera pārbaudes plazmīdu transformācija dažādos E.coli celmos (Transformantu skaits uz 10 ng DNS / koloniju morfoloģija)

Escherichia coli celmi

Plazmīdas tips XL1 (recA-) TG1 (recA+) GFP-Pau-Inv 400 / dažāda izmēra 10 / dažāda izmēra Del -GFP 400 / viena izmēra 600 / viena izmēra

No transformantu kolonijām izdalītā plazmīdu DNS

1,2 – XL1 + GFP-Pau-Inv, lielas kolonijas; 3,4 – tas pats mazas kolonijas; 5,6 – XL1 + del-GFP; 7 – TG1 + GFP-Pau-Inv, lielas kolonijas; 8 – tas pats, maza kolonija.

Nukleotīdu secības, kuras sekmē delēciju veidošanos

Ar GC nukleotīdu pāriem bagāti rajoni cilvēka ret onkogēna promotera PauI restrikcijas fragmentā

Secības bez C un bez G nukleotīdiem plazmīdas Mph_GL0 polilinkera (MCS) rajonā

Plazmīdas, kurās notikušas delēcijas ir mazāk superspiralizētas

Gels, bez EthBr, krāsots pēc forēzes

Gels, ar EthBr, krāsots forēzes laikā

Plazmīdu lineārās formas

Plazmīdu CCC

formas

SecinājumiPlazmīdu iekšmolekulāru rekombināciju starp tiešajiem atkārtojumiem vecina secības ar nevienmērīgu nukleotīdu sadalījumu. Plazmīdu genoma delēcijas iekšmolekulārās rekombinācijas rezultātā novērojamas replikonos ar samazinātu superspiralizācijas blīvumu.

pBR322 – colE1 plazmīdaAr sarkano bultu apzīmēts ampicilīna gēnsAr zilo bultu apzīmēts tetraciklīna gēnsAr melno bultu apzīmēts rop rajons

pACYC – P1 plazmīdatet – tetraciklīna rezistences gēnscat – hloramfenikola rezistences gēns

pBR322/290Ar taisnstūriem norādīti tiešie atkārtojumiStarp tiešajiem atkārtojumiem ir ieligēts MCS

Izaugušās kolonijas

No cik šūnām viena izaug ar rezistenci pret tetraciklīnu

Secinājumi:Rekombinācijas starp blakusesošiem tiešajiem atkārtojumiem, atšķirībā no rekombinācijām starp atkārtojumiem, kurus šķir klonētu gēnu secības notiek neatkarīgi no recA proteīna aktivitātes. Rekombinācijas ir atkarīgas no insertēto tiešo atkārtojumu garuma. Jo lielāks tiešo atkārtojumu garums, jo biežāk notiek delēcijas.

pACYC plazmīdas ir izdevīgākas iekšmolekulāro rekombināciju regulējošo faktoru pētīšanai, jo tām ir zema spontāno delēciju veidošanās aktivitāte . Zināms, ka pACYC un pBR322 superspiralizācijas blīvumi ievērojami atšķirās.

PALDIES PAR UZMANĪBU !