View
733
Download
4
Category
Preview:
DESCRIPTION
sebuaah laporan penelitian sederhana mengenai uji protein menggunakan metode Bradford
Citation preview
PRAKTIKUM UJI KANDUNGAN PROTEIN DENGAN METODE
BRADFORD
Disusun Oleh :
ARGHYA NARENDRA DIANASTYA (111510501105)
(Mahasiswa Penerima Beasiswa Unggulan S-1 PS. Agroteknologi Fakultas
Pertanian UNEJ)
PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGIFAKULTAS PERTANIANUNIVERSITAS JEMBER
2012
1. PENDAHULUAN
Semua sistem kehidupan mengandung sejumlah besar protein yang berbeda.
Perbedaannya terdapat pada asam amino, urutan asam amino, kandungan non-
asam amino, bobot molekul, dan faktor yang menentukan konformasi protein.
Dalam hal tersebut, untuk menentukan struktur protein tertentu kita diharuskan
untuk protein tersebut dari bahan non protein dan dari protein yang lain
(Robinson, 1995).
Protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan
unsur air dari gugus aminop dan gugus karboksil yang dimiliki. Jika protein
tersebut memiliki bobot senyawa yang kurang dari 6.000, biasanya digolongakn
kedalam polipeptida. Secara umum, pada hidrolisis protein tertentu biasanya
ditemukan 16 sampai 20 asam amino yang berlainan. Asam amino dalam sebuah
protein tersusun secara saling berkaitan membentuk rantai polimer lurus dengan
sambung silang antara gugus sulfhidril sisteina membentuk jembatan disulfida
(Robinson, 1995).
Protein memiliki beberapa fungsi, lima diantaranya adalah sebagai:
biokatalisator, protein cadangan, biomol pentrasfer bahan, struktural, dan
protektif.namun demikian, pada umumnya protein dikenal sebagai bagian dari
makanan yang dipergunakan sebagai pengganti jaringan sel (Martoharsono,
1998).
Protein memiliki keragaman dan kerumitan. Adanya keragaman dan
kerumitan tersebut mendorong terciptanya bagan penggolongan. Protein
tumbuhan sebagai contoh telah dikelompokkan berdasarkan sumbernya. Secara
umum didalam tumbuhan terdapat dua portein, yaitu portein biji dan protein daun.
Protein tersebut lebih lanjut dibagi menjadi protein embrio dan protein
endosperma pada protein biji dan protein kloroplas unttuk protein daun
(Robinson, 1995).
Bagan penggolongan lain didasarkan kepada penglompokan menjadi protein
sederhana, yaitu protein yang pada hidrolisisnya hanya menghasilkan asam amino
alfa, dan protein konjugasi. Protein konjugasi adalah protein yang pada proses
hidrolisisnya menghasilkan asam amino dan senyawa lain. Anak golongan utama
protein sederhana dicantumkan dalam “Penggolongan Osborne”. Beberapa contoh
protein tersebut adalah Albumin, Globulin, Glutelin, Prolamin Histon (Robinson,
1995).
Terdapat beberapa golongan protein sederhana yang tidak dapat dimasukkan
ke dalam salah satu golongan pada bagan klasik ini. Satu kelompok protein
penting ialah protein yang bersifat asam yang berkaitan dengan DNA kromosom
atau RNA ribosom (Robinson, 1995).
Pada tanaman, konsentrasi protein tertinggi didapati dalam biji sebesar 40%
dan ditemukan dalam biji dari berat keringnya. Protein dalam biji akan digunakan
sebagai energi dalam perkecambahan biji. Protein dalam tanaman larut dalam air,
namun demikian terdapat protein yang terikat pada membran lipoprotein sehingga
yang akan dihitung adalah total protein terlarut. Hal tersebut dikarenakan sebagai
pelarut atau buffernya merupakan air (Siswoyo dan Handoyo, 2012).
Terdapat beberapa cara untuk menentukan konsentrasi protein, salah
satunya menggunakan pengujian bradford. Pengujuian Bradford merupakan
metode yang sering digunakan, khususnya dalam penentuan kandungan protein
dari fraksi sel atau dari gel electrophoresis. Metode ini merupakan prosedur
standar dengan sensivitas antara 20 – 200 ug protein. Lebih lanjut, pengujian ini
ddidasarkan pada observasi bahwa absorban maksimum untuk larutan asam dari
CBB G-250 antara 165 nm sampai 595 nm ketika protein terikat (Siswoyo dan
Handoyo, 2012). Untuk mengetahui langkah pengukuran kandungan protein
dengan meode Branford, dilaksanakan praktikum yang mengukur kandungan
protein dalam biji dan daun tanaman kakao.
1. TUJUAN
1. Untuk mengetahui cara pengukuran kandungan protein dengan meode
Bradford menggunakan bahan biji dan daun tamaman kopi dan kakao;
2. Untuk mengetahui seberapa besar kandungan protein pada biji dan daun
tanaman kopi dan kakao;
3. Untuk membandingkan kadar protein antara biji dan daun kopi serta kakao.
3. BAHAN DAN METODE
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat :
1. Tabung Reaksi
2. Mikropipet (20, 200 dan 1000 ul)
3. Inkubator
4. Spekrofotometer
5. Rak tabung reaksi
3.1.2 Bahan :
1. Coomassie Brilliant Blue G-250
2. 95 % Ethanol
3. 85% Phosphoric Acid
4. BSA (Bovine Serum Albumine) sebagai standar
5. Bradford reagent : 100 mg Coomasie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml ethanol
95% dan ditambahkan 100 ml (w/v) Phosphoric acid dan tambahkan aquades
sampai volume 1 liter. Saring larutan dengan kertas whatman sebelum
digunakan.
3.2 Cara kerja :
1. 2 gr sampel digerus dengan mortar pestle setelah diberi nitrogen cair.
2. Tambahkan 3 kali volume buffer ekstraksi yang mengandung (100 mM MOPS-
NaOH (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM beta-2 mercaptoenol
dan 10 % PVP.
3. Homogenat dimasukkan dalam 4 ependorf dan disentrifugasi pada kecepatan
10.000 rpm 4oC selama 10 menit, kemudian ambil supernatan dan digunakan
sebagai sumber enzim (satu epedorf untuk pengukuran protein ).
Pembuatan grafik standar BSA
1. Siapkan 5 tabung mikro sentrifuse (beri nomor 1-5), kemudian isi masing
masing dengan bahan seperti table dibawah ini :
Nomor
Tabung
Volume BSA
(uL)
Larutan Buffer
(uL)
Bradford Reagent (uL)
1. 5 45 950
2. 10 40 950
3. 20 30 950
4. 25 25 950
Catatan : - Konsentrasi larutan stok BSA = 1 UG UL-1
Setelah didiamkan selama 15 menit ukur OD 595 nm dengan spektrofotometer.
Cari persamaan regresinya sebagai X adalah OD 596 dan sebagai Y adalah jumlah
BSA.
Pengukuran sampel
1. Masukkan sampel protein sebanyak 25 uL ke dalam tabung mikrosentrifugasi
dilakukan 4 kali pengenceran dan ditambah larutan buffer sebanyak 30 uL dan
divortex.
2. Tambahkan 950 ul reagent Bradford dan divortex.
3. 15 menit kemudian ukur OD pada panjang gelombang 595 nm
4. Hitung kandungan protein sampel menggunakan grafik standar BSA
4. HASIL PERCOBAAN
4.1 Pembuatan Kurva Standar Analisis Protein Metode Bradford
Kurva Standar
Absorban Konsentrasi BSA (mg/ml)
0,000 0,000
0,427 5,000
0,516 10,000
0,655 20,000
0,665 25,000
4.2 Pengukuran Absorban Sampel Kopi-Kakao
SampelA595
Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3
Biji Kopi 0,601 0,610 0,587
Daun Kopi 0,583 0,571 0,595
Biji Kakao 0,401 0,434 0,431
Daun Kakao 0,409 0,438 0,418
4.3 Penentuan Persamaan Regresi
Persamaan Regresinya adalah y = 33,36x - 3,102
4.4 Penentuan Persamaan Regresi
Sampel
Kadar Protein (mg/ml) Kandungan Protein
Sampel dan
Toleransi
Kesalahannya
Ulangan
ke- 1
Ulangan
ke- 2
Ulangan
ke- 3Rata-rata Stdev
Biji Kopi 3,389 3,450 3,296 3,378 0,077 3,378 ± 0,077
Daun
Kopi 3,269 3,189 3,349 3,269 0,080 3,269 ± 0,080
Biji
Kakao 2,055 2,275 2,255 2,195 0,122 2,193 ± 0,099
Daun
Kakao 2,108 2,302 2,168 2,193 0,099 2,195 ± 0,123
5. PEMBAHASAN
Metode Bradford adalah salah satu metode yang digunakan untuk mengukur
kandungan protein. Metode tersebut dilakukan pertama kali oleh Bradford
(Bradford et al., 1976). Pada saat ini, metode Bradford telah banyak dilakukan
untuk mengukur kandungan protein karena metode tersebut dinilai mudah, cepat,
dan hasilnya cukup akurat. Selain itu, pengukuran kandungan protei dengan
metode Bradford lebih tahan terhadap interferensi senyawaan nonprotein yang
sering kali mengganggu jalannya pengujian kuantitatif protein.
Pengujian kandungan protein dengan metode Bradford didasarkan pada
pengikatan zat warna Coomassie Briliant Blue G-250 terhadap protein. Coomassie
Briliant Blue G-250 memiliki formasi ion berbeda dengan nilai pKa 1.15, 1.82
dan 12.4. Bentuk kationik zat warna tersebut berwarna merah dan hijau dengan
panjang gelombang serapan maksimum pada 470 dan 650 nm. Sedangkan bentuk
anioniknya berwarna biru dengan absorbansi (panjang gelombang serapan)
maksimum 590 nm. Namun, untuk pengukuran protein dilakukan dengan
menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anionik (biru) serta dilakukan dengan
mengukur absorbansi larutan pada 595 nm. Zat warna Coomassie Blue G-250
bereaksi cepat dengan residu arginil dan lysil dari protein, sehingga menyebabkan
adanya variasi hasil pengukuran untuk jenis protein yang berbeda. Protein dengan
residu arginil dan lysil lebih banyak, akan menghasilkan warna biru yang lebih
intens. Sedangkan, protein yang memiliki residu arginil dan lysil lebih sedikit,
warna biru tidak lebih intens, walaupun jumlah proteinnya sama.
Metode Bradford merupakan metode yang paling sesuai dan umum
digunakan. Metode Bradford memiliki dua jenis assay protein, yaitu Standar
Assay dan Microassay. Standar Assay digunakan untuk pengukuran kadar protein
antara 10 sampai 100 µg, sedangkan Microassay digunakan untuk pengukuran
kadar protein antara 1 sampai 10 µg. Namun, pengukuran dengan Microassay
umumnya lebih rentan terhadap interferensi senyawaan nonprotein.
Prinsip kerja analisis protein dengan metode Bradford adalah
spektrofometri. Spektrofotometri adalah sebuah alat yang dapat memberikan nilai
absorban pada sampel. Spektrofotometri akan mengirimkan cahaya berupa cahaya
tampak yang akan diserap oleh sampel. Semakin besar cahaya yang diserap, maka
semakin besar nilai absorbannya. Namun, kandungan protein tidak dapat langsung
diketahui. Kandungan protein setiap sampel harus dihitung lagi menggunakan
nilai absorban setiap sampel.
Secara umum, protein terdapat pada hampir setiap susunan sel mahluk
hidup. Pada tanaman yang menghasilkan biji, kandungan protein lebih dominan
terdapat pada bagian biji. Sebagai contoh pada tanaman kopi dan kakao. Hasil
percobaan yang kami lakukan dengan membandingkan kandungan protein pada
biji dan daun menunjukkan bahwa kandungan protein pada biji lebih banyak
dibandingkan pada bagian daun. Hasil rata-rata perhitungan kandungan protein
pada biji kopi 3,378 sedangkan pada daun kopi 3,269, sehingga kita dapat
mengetahui bahwa kandungan protein pada biji jauh lebih tinggi 0,109
dibandingkan pada bagian daun kopi. Sedangkan, hasil perhitungan rata-rata
kandungan protein dalam biji kakao sebesar 2,881 dan pada daun kakao 2,193.
Selisih yang didapatkan dari perbedaan kandungan protein biji kakao dan daun
kakao adalah 0,688.
Dari hasil analisa protein yang dilakukan, dapat diketahui pula bahwa
kandungan protein pada biji dan daun kopi lebih besar terhadap biji dan daun
kakao. Hal tersebut dikarenakan pada tanaman kopi, sebagian hasil fotosintat
diubah menjadi protein, sedangkan pada tanaman kakao, hasil fotosintat secara
umum diubah menjadi bentuk lemak. Namun demikian, kandungan dari hasil
fotosintat yang tersimpan masih tergantung pada usia tanaman. Seperti hasil
penelitian Wealth of India (1990), kandungan protein dari 100 gram biji kopi
adalah sebesar 11,23 gram. Menurut Belitz et al., kandungan protein biji kakao
adalah 11,5. Perbedaan kandungan protein dengan metode Bradford pada
penelitian kami tidak sesuai dengan pernyatan tersebut, karena terdapat faktor-
faktor kesalahan terjadi ketika penelitian. Sehingga, hal itu memengaruhi hasil
dari kandungan protein.
Didalam praktikum terdapat faktor-faktor kesalahan yang mempengaruhi
hasil pengukuran kandungan protein, hal tersebut diantaranya meliputi
penggerusan biji dan daun pada kopi dan kakao. Penggerusan akan mempengaruhi
halus tidaknya bahan yang digerus. Semakin halus, maka analisis protein yang
dilakukan akan semakin mudah. Hal tersebut dikarenakan, semakin halus substrat
yang ditumbuk, maka akan memudahkan dalam hal reaksi terhadap Bradford
reagen. Selain itu, faktor keseterilan alat sangat berpengaruh. Semakin steril alat
praktikum yang digunakan, maka semakin baik hasil yang diperoleh. Faktor
manusia, juga mmempengaruhi dalam analisa protein. Hal tersebut dikarenakan
sering terjadinya human eror dalam pencatatan hasil dan pengelolahan data.
Kandungan protein semua bahan, protein2 itu berada dimana?
Perbandingan protein pada biji dan daun kopi dan kakao, kenapa kok beda
Perbandingan protein pada kopi dan kakao, kenapa kok beda
6. KESIMPULAN DAN REKOMENDASI
6.1 Kesimpulan
Uji kandungan protein dengan metode Bradford sangat mudah dan cukup
akurat. Kandungan protein pada tanaman yang menghasilkan biji umumnya
banyak terdapat pada bijinya dibandingkan pada daunnya, seperti pada kakao dan
kopi. Hal itu karena hasil fotosintat lebih banyak disimpan pada biji kakao
maupun kopi.
6.2 Rekomendasi
Sebaiknya dalam melaksanakan praktikum penentuan kandungan protein
dengan metode Bradford harus benar-benar teliti. Tingkat ketelitian akan
memengaruhi keakuratan hasil. Selain itu, alat-alat yang digunakan harus steril
serta sampel yang digerus benar-benar halus agar hasilnya juga akurat.
DAFTAR PUSTAKA
Bradford, MM. 1976. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254.
Martoharsono, S. 1998. Biokimia Jilid I. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.
Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung: Penerbit ITB.
Siswoyo, T.A. dan Handoyo, T. 2012. Petunjuk Praktikum Biokimia Tanaman (Tidak Diterbitkan). Jember: Universitas Negeri Jember
Recommended