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PROTEASAS
Prof. Andrés R. Alcántara.Grupo de Biotransformaciones
Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica. Fac. Farmacia
2Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Enzimas que catalizan procesos reversibles de hidrólisis de diferentes
sustratosNomenclatura según el Enzyme Commission (E.C.)
E.C.3.X.Y.Z
Tipo de enzimas: Hidrolasas
Tipo de sustratosobre el que actúan
3Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
3.1 Sobre ésteres3.2 Glicosidasas (rompen enlaces glicosídicos)3.3 Sobre éteres3.4 Peptidasas (rompen enlaces peptídicos)3.5 Sobre otros enlaces C-N no peptídicos3.6 Sobre anhidridos de ácido3.7 Sobre enlaces C-C3.8 Sobre enlaces C-X3.9 Sobre enlaces P-N3.10 Sobre enlaces S-N3.11 Sobre enlaces C-P3.12 Sobre enlaces S-S3.13 Sobre enlaces C-S
4Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
E.C.3.4.-.- Acting on peptide bonds (peptide hydrolases).There are 1582 PDB entries in enzyme class E.C.3.4.-.-
E.C.3.4.11.- Aminopeptidases. [ 46 PDB entries ] E.C.3.4.13.- Dipeptidases. [ 8 PDB entries ] E.C.3.4.14.- Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases. [ 4 PDB entries ] E.C.3.4.15.- Peptidyl-dipeptidases. [ 3 PDB entries ] E.C.3.4.16.- Serine-type carboxypeptidases. [ 27 PDB entries ] E.C.3.4.17.- Metallocarboxypeptidases. [ 35 PDB entries ] E.C.3.4.18.- Cysteine-type carboxypeptidases. [ 1 PDB entry ] E.C.3.4.19.- Omega peptidases. [ 6 PDB entries ] E.C.3.4.21.- Serine endopeptidases. [ 780 PDB entries ] E.C.3.4.22.- Cysteine endopeptidases. [ 122 PDB entries ] E.C.3.4.23.- Aspartic endopeptidases. [ 338 PDB entries ] E.C.3.4.24.- Metalloendopeptidases. [ 196 PDB entries ] E.C.3.4.25.- Threonine endopeptidases. [ 2 PDB entries ] E.C.3.4.99.- Endopeptidases of unknown catalytic mechanism. [ 14 PDB entries ]
5Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
LAS MÁS IMPORTANTES EN BIOCATÁLISIS
1. SERIN PROTEASAS2. ASPARTIL PROTESASA3. METALOPROTEASAS4. CISTEIN PROTEASAS
DENTRO DE ELLAS, LAS SERIN PROTEASAS SON LAS MÁS USADAS:SE SUBDIVIDEN EN:
GRUPO A:TripsinaQuimotripsinaElastasaTrombina
GRUPO B:Subtilisina
Los miembros de cada grupo tienen un ancestro común,Los grupos A y B se han hecho similares a través de un proceso de evolución
convergente
6Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Identidad de secuencia redspecto a la tripsina pancreática de mamíferos.
Fish trypsin 69%
Bacterial trypsin 43%
Mammalian chymotrypsin 50%
Mammalian elastase 48%
Fungal elastase 26%
Mammalian plasma thrombin 38%
Bacterial subtilisin 0%
7Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
LAS PROTEASAS DIFIEREN EN SU ESPECIFICIDAD
HN
NH
HN
NH
HN
R3
O
O
R2
R1
O R'1
O R'2
O
HIDROLISIS
SUBSITIO S3
S2
S1
S'1
S'2
8Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
S1-S’1
9Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Prsentan un centro de especificaidaddistinto del centro catalítico.Reconocen las cadenas laterales antes de la ruptura.Quimotripsina: aromáticos o voluminosos
Phe, Tyr, Trp, Leu, MetTripsina: grandes, y con carga positiva.
Lys, ArgElastasa: pequeños, hidrofóbicos
Ala
10Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Asp
His
SerON NH H
O
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
Asp
His
SerO
C
R1
N N
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
OO
O
O H
H
R2HN O-
Asp
His
SerO
C OR1
N NH
O
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
Asp
His
SerO
C
R1
N N
O(Glu)
NH
HNHN O
HN
O
HN
NH
O
OHN
O
O
O
O H
H
HO O-
C O
R1
R2HN INTERMEDIOTETRAÉDRICO #1
INTERMEDIOTETRAÉDRICO #2 ENZIMA ACILADA
C O
R1
R2HNC O
R1
HO
OH
H
H2O
R2NH2
11Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Mecanismo de acción de las hidrolasas dependientes de serina PASO 1
12Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
PASO 2
13Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
PASO 3
14Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
PASO 4
15Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
PASO 5
16Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
PASO 6
17Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
PASO 7
18Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Estructuras cristalográficas
Varias enzimas nativas:Tripsina, quimotripsina, elastasa…Proteínas pequeñas (15-34 kD), alta resolución (1-2Å)
Varios complejos: Enzima-Producto (análogos), eg:
L-formamil-L-Trp embebido en la quimotripsinaEnzima-InhibidoresEnzima-Acilada
Condicionessustratos no naturales que deacilen lentamente:
Indolilacriloil-quimotripsina @ pH4Carbobenzoxi-Ala-elastasa @ -55°C
19Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Catalisis: Enlaces de H del bolsillo oxianionico
2 enlaces de H con NH193, NH195.El enlace NH195 es más largi en los complejos enzima-sustrato o enzimaproducto.(3.6Å)
Carbonilo trigonalSe acorta cuando el carbonilopiramidaliza
carbon tetrahedralC==O C—O¯
Favoreciendo el estado de transición.
20Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Evidencias que implican los enlaces de H en el oxianión
Thioester substrates less reactiveLonger / weaker H-bondsPerhaps other effects?
Zymogen (inactive) precursorsGly193 points away
Main chain H-bonds being usedDesign for rigidity?
21Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Otros enlaces de H del esqueleto peolipeptídico.
Los tres resíduos antes del enlace que se corta (S1, S2, S3) están unidos por enlaces de H a la enzimaSe forma un a modo de “complejo enzima sustrato tipolámina beta)
CO214 con NHR1NH216 con COR3.CO216 con NHR3.
Se mantiene una estructura rígida
cleaved bond
R1(in specificitypocket)
Non-specificH-bonding tobackbone
Residues importantfor specificity
215
216227
226
189
oxyanion hole
substrate peptide
Ser195His57Asp102Catalytic triad
R2
R3
HN
NH
HN
NH
HN
R3
O
O
R2
R1
O R'1
O R'2
O
HIDROLISIS
S3
S2
S1
S'1
S'2
22Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Triada catalítica
El Nε del resíduo His57 actúacomo una base
La protonación de la histidinaes vital
No – proton stabilized on Nδ by Asp102.
La atraccion del Hδ por el Asp102 aumenta su pKa.
Si se transfiere por completo, existe un relé de carga.
Cuando se devuelve el protónHε,, el Asp102 devuelve el Hδ:
Asp102/His57: buffer protónico
23
SINTESIS de AMIDAS
R1
O
O R2
R3 NH2
R3 NH NH2
HIDROLASEORGANIC SOLVENT
R1
O
HN R3
R1
O
HN NH R3
R2 OH+
R2 OH+
R
NH2
R
NH2
R
NH-Acyl
+LIPASE
Acyl Donor
Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
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SÍNTESIS PEPTÍDICALa síntesis peptídica catalizada por enzimas se puede llevar a cabo de tres maneras: AMIDACÍON (reverso de la hidrólisis), TRANSPEPTIDACIÓN (menos frecuente) y AMINOLISIS DE ESTERES.
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SÍNTESIS PEPTÍDICACONTROL TERMODINÁMICO: en condiciones fisiológicas (entornos acuosos) el equilibrio está muy desplazado hacia la proteólisis. Por tanto, hemos de “tirar”del equilibrio en sentido de la síntesis:
Usar algún reactivo en exceso
Eliminar los productos:PÉPTIDO
formacion de un derivado insoluble por complejación.Extracción del producto con un cosolventeinmiscible.
AGUAEvaporación en contínuoDisminución de awusando un cosolvente miscible.
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CONTROL CINÉTICO: la aminólisis de ésteres supone un proceso irreveresible donde dos nucleófilos (agua y amina) compiten por el intermedio acil-enzima.
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SÍNTESIS PEPTÍDICA
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28Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
29Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
30Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
SÍNTESIS PEPTÍDICA
31Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
SÍNTESIS PEPTÍDICA
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EJEMPLO 1: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE UNA ENCEFALINA
Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
33Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
EJEMPLO 2: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE Met- o Leu-ENCEFALINA
34Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
EJEMPLO 3: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE Met-ENCEFALINA
35Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
EJEMPLO 4: SÍNTESIS QUIMIOENZIMÁTICA DE UN UNDECAPÉPTIDO
36Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
NH2
O OMe+ OH
O
O
HONH
Xtermolisina NH2
O OMe+
NH
O OMe
ONH O
OH
X
(D,L)-fenilalaninatode metilo
Ácido aspártico(N-protegido)
(D)-fenilalaninatode metilo
α-aspartamo(N-protegido)
EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS
SÍNTESIS PEPTÍDICA:ESTEREO y REGIOSELECTIVA
Azul: enantiómero convertido; Rojo: enantiómero no convertido
37Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
NH2
O OMe+ OH
O
O
HONH
Xtermolisina NH2
O OMe+
NH
O OMe
ONH O
OH
X
(D,L)-fenilalaninatode metilo
Ácido aspártico(N-protegido)
(D)-fenilalaninatode metilo
α-aspartamo(N-protegido)
38Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
NH2
O OMe+ OH
O
O
HONH
Xtermolisina NH2
O OMe+
NH
O OMe
ONH O
OH
X
(D,L)-fenilalaninatode metilo
Ácido aspártico(N-protegido)
(D)-fenilalaninatode metilo
α-aspartamo(N-protegido)
Principal problema en la síntesis química: formación del β−aspartamo (AMARGO), que habría que separar.
VENTAJAS DEL PROCESO ENZIMÁTICO:•No se produce nada del isómero beta (100 % REGIOSELECCIÓN)•La enzima es completamente enantioselectiva (se puede partir del ester racémico)•La reacción tiene lugar en medio acuoso, en condiciones suaves.•La termolisina se obtiene de Bacillus proteoliticus, un microorganismo termófilo aislado en una fuente termal (Rokko Hot Spring) en Japón, por lo que puede trabajar hasta 60ºC.
Al ser un equilibrio hay que eliminar los productos para desplazarlo. Se añade exceso de fenilaninato de metilo (inocuo para la enzima), por lo que se forma el carboxilato del alfa-aspartamo, que precipita en el medio de reacción, y se aisla facilmente.
39Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
The global market volume for this peptide sweetener, with a sweeteningpower about 200 times that of sucrose, has been estimated at 14,000–15,000 tons in 2003 (Ajinomoto 2003).
40Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
PROTEASAS PARA LA OBTENCIÓN DE INSULINA
Aislada por primera vez en 1921 a partir de páncreas de perro.Secuencia identificada por Sanger en 1955.Regula los niveles de azúcar en sangre, usada para el
tratamiento de la diabetes mellitus (aprox. 5% población occidental).
Es una proteína, no puede suministrarse oralmente (proteolisis)Hoy día existen 4 rutas de obtención de insulina:1. Extracción de páncreas humano2. Síntesis a partir de los aminoácidos individuales3. Conversión de insulina porcina en humana4. Fermentación a partir de microorganismos modificados
genéticamente
41Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
3. Conversión de insulina porcina en humana
Proteasa de Achromobacter lyticus
Cadena A
Cadena B
42Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.1. Producción de pro-insulina, transformada en insulina por transpeptidación (Novo Nordisk)
Ester de la insulina humana
Obtenida a través de fermentaciónde células de S. cerevisiae modificadas
genéticamentePro-insulina
43Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.2. Producción de mono/di-arg-insulina usando células de E. coli modificadas genéticamente y posteriores pasos de síntesis y purificación (ELI LILY)
44Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Conversión: sobre 70 %.Reactor tipo batch
Pro-Arg -insulina
Mono/di-Arg -insulina
45Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Mono/di-Arg -insulina
Insulina humana
46Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.3. Producción de pre-pro-insulina usando células de E. coli modificadas genéticamente y posteriores pasos de síntesis y purificación (Hoechst MarionRoussel)
Pre-pro-Arginsulina
Mono/di-Arg -insulina
47Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Mono/di-Arg -insulina
Insulina humana
48Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
49Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS
OEtO
EtOO
subtilisina(R)
ONaO
EtOO
+(S)
OEtO
EtOO
Azul: enantiómero convertido; Rojo: enantiómero no convertido
ENANTIÓMERO BUSCADO
1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES
50Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
OEtO
EtOO
subtilisin(R)
ONaO
EtOO
+(S)
OEtO
EtOO
20% emulsion en 30 mM NaHCO3 acuoso en un sistema
bifásico con tolueno Separación &
Extracción
(S)OEt
O
EtOO
HCl
(R)OH
O
EtOO
Secado del tolueno&
NaOEt / Δ
OEtO
EtOO Rend. global: 87%
Sintón para la obtención de inhibidores de colagenasa
(osteoartritis)
51Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS
Azul: enantiómero convertidoRojo: enantiómero no convertido
ENANTIÓMERO BUSCADO
1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES
52Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
53Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
Peptidomiméticos inhibidoresde renina
54Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS
Azul: enantiómero convertidoRojo: enantiómero no convertido
ENANTIÓMERO BUSCADO
1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES
55Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
56Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
57Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASAS
Azul: enantiómero convertidoRojo: enantiómero no convertido
ENANTIÓMERO BUSCADO
1.-HIDRÓLISIS ESTEREOSELECTIVA DE ESTERES
58Prof. A. R. Alcántara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
EJEMPLOS INDUSTRIALES: HIDROLASAS: PROTEASASCompañía: PGG Industries, USA
Utilidad: sintón para la obtención de LY333531, un inhibidor de la protein Kinasa C
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