View
228
Download
7
Category
Preview:
Citation preview
protein veriminin belirlenmesi
saflık kontrolu
deneylerin optimizasyonu
spesifik aktivite tayini ve saflaştırma
derecesinin belirlenmesi (enzimler için)
Total protein miktarının bilinmesi
şarttır:
KULLANILAN YÖNTEMLER
Kjeldahl yöntemi (azot miktarının tayinine dayanır)
Kızıl ötesi spektrometri Türbidimetri Fluorimetri Refraktometri Polarografi Amino asit analizine dayanarak (asit hidrolizden sonra
yapılır. Trp, Cys asit hidrolize duyarlı; Gln, Asn, asit forma dönüşür. Bunlar da hatalar yol açar)
ZOR ,
duyarlılığı düşük,
hata payı yüksek
yöntemler
UV ve GÖRÜNÜR ALANDA ABSORBSİYONA DAYANAN
SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER
Son yıllarda en çok kullanılan yöntemler:
OPTİK ANALİZ YÖNTEMLERİ HAKKINDA KISA BİLGİ:
ELEKTROMANYETİK IŞINLAR ile MADDE arasındaki etkileşimden yararlanan yöntemlerdir.
ELEKTROMANYETİK IŞIN NE DEMEKTİR?
Elektromanyetik Işın: Uzayda büyük bir hızla ilerleyen bir enerji
İki önemli karakteri var:
1) Dalga karakteri: Uzayda sinüzoidal (dalga hareketiyle) yayılan elektrik ve manyetik vektörlere sahiptir. Madde ile etkileşiminde elektrik vektörü rol oynar.
(lambda)= c/(nü)
= Dalga boyu
c= Işık hızı (3x1010 cm/sn)
= frekans (birim zamanda belli bir noktadan geçen dalga sayısı)
2) Tanecik karakteri: Bir ışın demeti çok sayıda tanecikten oluşur. Enerjili bu taneciklere FOTON denir.
E = h x h= Planck sabiti (6.626 x 10-34 j.sn)
MADDE-IŞIN ETKİLEŞİMİ
Işının elektrik alanı ile maddenin bağ elektronları arasında gerçekleşir
Maddenin yapısına göre değişir.
Madde ortamına giren ışın değişime uğrar:
Doğrultusu değişir
YANSIMA (REFLECTION)
KIRILMA (REFRACTION)
Başka demetlere ayrılır:
KIRINIMA UĞRAR
(DIFFRACTION)
ÇİFTE KIRILMAYA UĞRAR
(DOUBLE REFRACTION)
SAÇILIMA UĞRAR
(SCATTERING)
Kutuplaşma düzlemi değişir:
OPTİK ÇEVİRME
Kutuplaşma derecesi azalır: DEPOLARİZASYON
Bu fiziksel değişimler maddenin enerji
düzeylerinde herhangi bir değişime yol açmaz.
Işının belli dalga boyları madde tarafından ABSORBLANIR (SOĞURULUR, EMİLİR): ABSORBSİYON
Bu enerji maddeyi (yani onu oluşturan atom veya molekülleri) UYARILMIŞ (EKSİTE) hale geçirir.
X + h X*
Düşük enerji düzeyi (ground: G ile de gösterilir)
Yüksek enerji düzeyi (uyarılmış durum: S1 ile de gösterilir)
Tanecik eski haline dönerken bu enerji geri verilir:
X* X + ısı
Uyarılmış madde bir ışın yayabilir: EMİSYON
X* X + h
SPEKTROSKOPİK YÖNTEMLERİN TEMELİNDE
ABSORPSİYON VE EMİSYON YATMAKTADIR. Bu olaylar enerji düzeyinde değişim yaratır.
OPTİK ANALİZ YÖNTEMLERİ
Spektroskopik Yöntemler
TEMELİ: Enerji düzeyleri arasındaki geçişler sonucu ortaya çıkan SPEKTRUM ölçülür.
Spektroskopik Olmayan Yöntemler
TEMELİ: Işının YÖNÜNDEKİ veya FİZİKSEL ÖZELLİKLERİNDEKİ DEĞİŞİM ölçülür. Enerji düzeyleri arasında geçişler olmasını gerektirmez.
Spektroskopik Yöntemler
•Spektrofotometri (UV-Visible, IR, X ışını)
•Kolorimetri
•Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi
•NMR Spektroskopisi
•ESR (Elektron Spin Rezonans) Spektroskopisi
•(Kütle Spektrometrisi)
•Emisyon Spektroskopisi
•Atomik Emisyon Spektroskopisi
•Fluoresan Spektroskopisi
•Radyokimyasal Yöntemler
IŞININ ABSORPLANMASI
IŞININ YAYILMASI (EMİSYON)
ÖLÇÜLEN ÖZELLİK
Spektroskopik Olmayan Yöntemler
•Türbidimetri
•Nefelometri
•Raman Spektroskopisi
•Refraktometri
•İnterferometri
•X ışını Difraksiyonu
•Elektron Difraksiyonu
•Polarimetri
IŞININ SAÇILMASI
IŞININ KIRILMASI
IŞININ KIRINIMA UĞRAMASI
IŞININ KUTUPLANMA ÖZELLİKLERİNİN DEĞİŞİMİ
ÖLÇÜLEN ÖZELLİK
YÖNTEMİN ADI: SPEKTROFOTOMETRİ
ALETİN ADI: SPEKTROFOTOMETRE
Döteryum (D2) lamba: UV ışık için
Tungsten (W) lamba: görünür ışık için kullanılır.
Monokromatör: tek bir dalga boyundaki ışının seçilmesi için kullanılır
Spektrofotometrenin çalışma prensibi:
Lamba tarafından yayılan ışın demeti monokromatör (prizma) yardımıyla tek bir dalga boyundaki ışına (monokromatik ışına) dönüştürülür.
Bu ışın örneğin içinde bulunduğu odaya girer. Ölçümü
yapılacak örnek, KÜVET içine konulur. Görünür alanda çalışılıyorsa CAM (optik) KÜVET; UV’de çalışılıyorsa KUVARTZ (silika) KÜVET kullanılır. Örnekten geçen ışığın şiddeti detektör tarafından
algılanır ve kaydedici ya da yazıcıya elektrik sinyali şeklinde gönderilir.
Double-beam (Çift ışınlı spektrofotometrelerde ışın hem örnekten hem de kör örnekten (referans) geçirilir.
UV-Visible Spektroskopisi ve
Lambert-Beer Yasası:
Moleküler Biyolojide UV ve görünür ışınlar kullanılarak :
•Molekülün yapısı hakkında bilgi edinilebilir. (özellikle UV alandaki absorpsiyon önemlidir.)
•Konsantrasyon (derişim) belirlenebilir
•Kimyasal reaksiyonun gidişi izlenebilir.
•Enzim aktivitesi ölçülebilir.
Tabakaya gelen ışık
Şiddeti: I0
Tabakadan çıkan ışık
Şiddeti: I
Homojen bir absorplayıcı
ortam
Lambert yasası:
Homojen bir absorplayıcı ortamdan geçen ışının şiddeti tabaka kalınlığının artması ile üssel olarak azalır:
I = I0 x e-kd I = geçen ışının şiddeti
I0= gelen ışının şiddeti
k = absorpsiyon katsayısı
d = tabakanın kalınlığı
Beer yasası:
Işının şiddeti içerisinden geçtiği maddenin konsantrasyonuna bağlıdır.
I = I0 x e-kc I = geçen ışının şiddeti
I0= gelen ışının şiddeti
k = absorpsiyon katsayısı
c = konsantrasyon
Bu iki yasanın birleştirilmesiyle :
I = I0 x e-kcd I = geçen ışının şiddeti
I0= gelen ışının şiddeti k = absorpsiyon katsayısı c = konsantrasyon d = ışık yolu (sıvının içinde bulunduğu küvetin genişliği)
I/I0 = e-kcd
ln I/I0 = -k x c x d ln I0/I = k x c x d k x c x d
log I0/I = k/2.303= (epsilon)
2.303
log I0/I = x c x d = A (Absorbans) veya E (Ekstinksiyon)
Işık yolu (cm)
Maddenin konsantrasyonu
Absorpsiyon (veya Ekstinksiyon) katsayısı
Konsantrasyonun (c) birimi g/l olursa, S, spesifik absorpsiyon katsayısı;
Konsantrasyonun (c) birimi mol/l olursa, M, molar absorpsiyon katsayısı
adını alır.
Işık yolu (d) 1 cm olduğunda A yerine OPTİK DANSİTE (O.D.)
terimi kullanılır.
Lambert-Beer yasasından sapmalar:
NEDENİ:
YÜKSEK KONSANTRASYON YANLIŞ DALGA BOYU SEÇİMİ
uygunluk
Negatif sapma
Pozitif sapma
Optik d
ansi
te
Konsantrasyon
Spektrofotometrik ölçümler iki farklı şekilde yapılabilir:
Belli bir dalga boyunda absorbans ölçülür. Konsantrasyon veya absorbsiyon katsayısının belirlenmesine yarar.
Belli bir dalga boyu aralığında absorbans taraması yapılır. Böylece ABSORPSİYON SPEKTURUMU elde edilir. Maddenin kimyasal karakteri hakkında bilgi sağlar.
PROTEİNLERİN KONSANTRASYONUNU
BELİRLEMEK İÇİN KULLANILAN UV-VISIBLE YÖNTEMLER:
ÖLÇÜM
Protein çözeltisinin UV absorbsiyonunun ölçülmesi
Protein çözeltisinin bir belirteçle reaksiyona sokulup oluşan renkli bileşiğin (kromofor) görünür alanda ölçülmesi
A280/A260 Oranı (Warburg – Christian Yöntemi
Tirozindeki fenolik gruplar ve triptofandaki indolik gruplar nedeniyle birçok protein 280 nm’de maksimum absorbsiyon gösterir. Bu özellikten yararlanılarak örnekteki protein miktarının yaklaşık olarak bulunması için hızlı bir yöntem geliştirilmiştir. Çok duyarlı
olmamakla beraber (duyarlılık: 0.05-2.0 mg/ml), kolaylığı ve hızlı sonuç
vermesi nedeniyle çok kullanılan bir tekniktir. Ancak, 260 nm’de maksimum absorbsiyon gösteren nükleik asitlerin 280 nm’de de absorbsiyon yetekleri olduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle nükleik asit artıkları ile kontamine durumdaki ilk kaba ekstrelerle çalışıldığında hatalı sonuçlar elde edilebilir. Bunun önüne geçmek için, Warburg ve Christian (1941) tarafından geliştirilmiş bir seri hata düzeltme faktörü (Tablo 2 ) genel olarak tüm proteinler için kullanılmakta ve bu yöntemde ortaya çıkabilecek hata payı daha aza indirgenebilmektedir.
Tablo 2. A280/A260 oranına bağlı olarak, örnekteki nükleik asit % si ve düzeltme faktörlerinin yaklaşık değerleri.
(1 cm ışık yolu için geçerli)
A280/A260 oranı % Nükleik asit Faktör
1.75 0.00 1.116
1.63 0.25 1.081
1.52 0.50 1.054
1.40 0.75 1.023
1.36 1.00 0.994
1.30 1.25 0.970
1.25 1.50 0.944
1.16 2.00 0.899
1.09 2.50 0.852
1.03 3.00 0.814
0.979 3.50 0.776
0.939 4.00 0.743
0.874 5.00 0.682
0.846 5.50 0.656
0.822 6.00 0.632
0.804 6.50 0.607
0.784 7.00 0.585
0.767 7.50 0.565
0.753 8.00 0.545
0.730 9.00 0.508
0.705 10.00 0.478
0.671 12.00 0.422
0.644 14.00 0.377
0.615 17.00 0.322
0.595 20.00 0.278
Protein konsantrasyonu (mg/ml) = 1.5 x A280 0.75 x A260
Protein konsantrasyonu (mg/ml) = Faktör x A280
veya
Biüre Yöntemi
Duyarlılığı düşük (1-10 mg/ml) olmakla beraber, pratikliği nedeniyle geniş çapta kullanılan bir yöntemdir. Reaksiyonun esası Cu atomunun peptid azotlarına bağlanması sonucu alkali çözeltide 540 - 560 nm’de maksimum absorbsiyon gösteren renkli bir kompleks oluşumuna dayanır. Bakır atomlarının ana zincire bağlanması nedeniyle amino asit içeriğinin ölçümler üzerinde herhangi bir önemli etkisi yoktur.
Boya-Bağlama (Bradford Yöntemi)
Bu yöntem, “Coomassie Brilliant Blue G-250” boyasının farklı
konsantrasyonlardaki proteinlere bağlanarak, farklı renk
şiddetinde (koyulukta) çözeltiler ortaya koymasından
yararlanılarak geliştirilmiştir. Boyanın özellikle arjinin gibi bazik
amino asitlere ve bazı aromatik amino asitlere bağlanma
eğiliminde olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla bu yöntemde
proteinin primer yapısının önemi vardır. Duyarlılık sınırları, total
reaksiyon karışımında (5.1 ml) 20 - 140 g olan bu yöntemde (ki
bu da örnek konsantrasyonunun 0.2 - 1.4 mg/ml arasında
olması demektir) asidik boya proteine bağlanır ve 495-595 nm
arasında maksimum absorbsiyon değerleri elde edilir.
Lowry Yöntemi
Bu yöntem, fosfomolibdotungstik asit (Folin-Ciocalteau Belirteci) çözeltisinin tirozin bakiyeleri ile reaksiyona girerek mavi bir renk oluşturması esasına dayanır. Reaksiyon, bakır ile protein arasında kompleks oluşumu ile başlar, alkali çözeltide, oda temperatüründe 5-10 dakika içinde tamamlanır. Bakırın varlığı yöntemin duyarlılığını 3-15 kat artırmaktadır, çünkü Cu ile yapılan kompleks, Folin belirtecindeki Mo ve WO4 (wolframid) ile birleşerek yeni bir kompleks ortaya koyar. Ancak analiz edilen örnekteki fenolik maddeler hatalara yol açabilir. Duyarlılık: 20-400 g/ml
Recommended