protein veriminin belirlenmesi

saflık kontrolu

deneylerin optimizasyonu

spesifik aktivite tayini ve saflaştırma

derecesinin belirlenmesi (enzimler için)

Total protein miktarının bilinmesi

şarttır:

KULLANILAN YÖNTEMLER

Kjeldahl yöntemi (azot miktarının tayinine dayanır)

Kızıl ötesi spektrometri Türbidimetri Fluorimetri Refraktometri Polarografi Amino asit analizine dayanarak (asit hidrolizden sonra

yapılır. Trp, Cys asit hidrolize duyarlı; Gln, Asn, asit forma dönüşür. Bunlar da hatalar yol açar)

ZOR ,

duyarlılığı düşük,

hata payı yüksek

yöntemler

UV ve GÖRÜNÜR ALANDA ABSORBSİYONA DAYANAN

SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER

Son yıllarda en çok kullanılan yöntemler:

OPTİK ANALİZ YÖNTEMLERİ HAKKINDA KISA BİLGİ:

ELEKTROMANYETİK IŞINLAR ile MADDE arasındaki etkileşimden yararlanan yöntemlerdir.

ELEKTROMANYETİK IŞIN NE DEMEKTİR?

Elektromanyetik Işın: Uzayda büyük bir hızla ilerleyen bir enerji

İki önemli karakteri var:

1) Dalga karakteri: Uzayda sinüzoidal (dalga hareketiyle) yayılan elektrik ve manyetik vektörlere sahiptir. Madde ile etkileşiminde elektrik vektörü rol oynar.

(lambda)= c/(nü)

= Dalga boyu

c= Işık hızı (3x1010 cm/sn)

= frekans (birim zamanda belli bir noktadan geçen dalga sayısı)

2) Tanecik karakteri: Bir ışın demeti çok sayıda tanecikten oluşur. Enerjili bu taneciklere FOTON denir.

E = h x h= Planck sabiti (6.626 x 10-34 j.sn)

MADDE-IŞIN ETKİLEŞİMİ

Işının elektrik alanı ile maddenin bağ elektronları arasında gerçekleşir

Maddenin yapısına göre değişir.

Madde ortamına giren ışın değişime uğrar:

Doğrultusu değişir

YANSIMA (REFLECTION)

KIRILMA (REFRACTION)

Başka demetlere ayrılır:

KIRINIMA UĞRAR

(DIFFRACTION)

ÇİFTE KIRILMAYA UĞRAR

(DOUBLE REFRACTION)

SAÇILIMA UĞRAR

(SCATTERING)

Kutuplaşma düzlemi değişir:

OPTİK ÇEVİRME

Kutuplaşma derecesi azalır: DEPOLARİZASYON

Bu fiziksel değişimler maddenin enerji

düzeylerinde herhangi bir değişime yol açmaz.

Işının belli dalga boyları madde tarafından ABSORBLANIR (SOĞURULUR, EMİLİR): ABSORBSİYON

Bu enerji maddeyi (yani onu oluşturan atom veya molekülleri) UYARILMIŞ (EKSİTE) hale geçirir.

X + h X*

Düşük enerji düzeyi (ground: G ile de gösterilir)

Yüksek enerji düzeyi (uyarılmış durum: S1 ile de gösterilir)

Tanecik eski haline dönerken bu enerji geri verilir:

X* X + ısı

Uyarılmış madde bir ışın yayabilir: EMİSYON

X* X + h

SPEKTROSKOPİK YÖNTEMLERİN TEMELİNDE

ABSORPSİYON VE EMİSYON YATMAKTADIR. Bu olaylar enerji düzeyinde değişim yaratır.

OPTİK ANALİZ YÖNTEMLERİ

Spektroskopik Yöntemler

TEMELİ: Enerji düzeyleri arasındaki geçişler sonucu ortaya çıkan SPEKTRUM ölçülür.

Spektroskopik Olmayan Yöntemler

TEMELİ: Işının YÖNÜNDEKİ veya FİZİKSEL ÖZELLİKLERİNDEKİ DEĞİŞİM ölçülür. Enerji düzeyleri arasında geçişler olmasını gerektirmez.

Spektroskopik Yöntemler

•Spektrofotometri (UV-Visible, IR, X ışını)

•Kolorimetri

•Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi

•NMR Spektroskopisi

•ESR (Elektron Spin Rezonans) Spektroskopisi

•(Kütle Spektrometrisi)

•Emisyon Spektroskopisi

•Atomik Emisyon Spektroskopisi

•Fluoresan Spektroskopisi

•Radyokimyasal Yöntemler

IŞININ ABSORPLANMASI

IŞININ YAYILMASI (EMİSYON)

ÖLÇÜLEN ÖZELLİK

Spektroskopik Olmayan Yöntemler

•Türbidimetri

•Nefelometri

•Raman Spektroskopisi

•Refraktometri

•İnterferometri

•X ışını Difraksiyonu

•Elektron Difraksiyonu

•Polarimetri

IŞININ SAÇILMASI

IŞININ KIRILMASI

IŞININ KIRINIMA UĞRAMASI

IŞININ KUTUPLANMA ÖZELLİKLERİNİN DEĞİŞİMİ

ÖLÇÜLEN ÖZELLİK

YÖNTEMİN ADI: SPEKTROFOTOMETRİ

ALETİN ADI: SPEKTROFOTOMETRE

Döteryum (D2) lamba: UV ışık için

Tungsten (W) lamba: görünür ışık için kullanılır.

Monokromatör: tek bir dalga boyundaki ışının seçilmesi için kullanılır

Spektrofotometrenin çalışma prensibi:

Lamba tarafından yayılan ışın demeti monokromatör (prizma) yardımıyla tek bir dalga boyundaki ışına (monokromatik ışına) dönüştürülür.

Bu ışın örneğin içinde bulunduğu odaya girer. Ölçümü

yapılacak örnek, KÜVET içine konulur. Görünür alanda çalışılıyorsa CAM (optik) KÜVET; UV’de çalışılıyorsa KUVARTZ (silika) KÜVET kullanılır. Örnekten geçen ışığın şiddeti detektör tarafından

algılanır ve kaydedici ya da yazıcıya elektrik sinyali şeklinde gönderilir.

Double-beam (Çift ışınlı spektrofotometrelerde ışın hem örnekten hem de kör örnekten (referans) geçirilir.

UV-Visible Spektroskopisi ve

Lambert-Beer Yasası:

Moleküler Biyolojide UV ve görünür ışınlar kullanılarak :

•Molekülün yapısı hakkında bilgi edinilebilir. (özellikle UV alandaki absorpsiyon önemlidir.)

•Konsantrasyon (derişim) belirlenebilir

•Kimyasal reaksiyonun gidişi izlenebilir.

•Enzim aktivitesi ölçülebilir.

Tabakaya gelen ışık

Şiddeti: I0

Tabakadan çıkan ışık

Şiddeti: I

Homojen bir absorplayıcı

ortam

Lambert yasası:

Homojen bir absorplayıcı ortamdan geçen ışının şiddeti tabaka kalınlığının artması ile üssel olarak azalır:

I = I0 x e-kd I = geçen ışının şiddeti

I0= gelen ışının şiddeti

k = absorpsiyon katsayısı

d = tabakanın kalınlığı

Beer yasası:

Işının şiddeti içerisinden geçtiği maddenin konsantrasyonuna bağlıdır.

I = I0 x e-kc I = geçen ışının şiddeti

I0= gelen ışının şiddeti

k = absorpsiyon katsayısı

c = konsantrasyon

Bu iki yasanın birleştirilmesiyle :

I = I0 x e-kcd I = geçen ışının şiddeti

I0= gelen ışının şiddeti k = absorpsiyon katsayısı c = konsantrasyon d = ışık yolu (sıvının içinde bulunduğu küvetin genişliği)

I/I0 = e-kcd

ln I/I0 = -k x c x d ln I0/I = k x c x d k x c x d

log I0/I = k/2.303= (epsilon)

2.303

log I0/I = x c x d = A (Absorbans) veya E (Ekstinksiyon)

Işık yolu (cm)

Maddenin konsantrasyonu

Absorpsiyon (veya Ekstinksiyon) katsayısı

Konsantrasyonun (c) birimi g/l olursa, S, spesifik absorpsiyon katsayısı;

Konsantrasyonun (c) birimi mol/l olursa, M, molar absorpsiyon katsayısı

adını alır.

Işık yolu (d) 1 cm olduğunda A yerine OPTİK DANSİTE (O.D.)

terimi kullanılır.

Lambert-Beer yasasından sapmalar:

NEDENİ:

YÜKSEK KONSANTRASYON YANLIŞ DALGA BOYU SEÇİMİ

uygunluk

Negatif sapma

Pozitif sapma

Optik d

ansi

te

Konsantrasyon

Spektrofotometrik ölçümler iki farklı şekilde yapılabilir:

Belli bir dalga boyunda absorbans ölçülür. Konsantrasyon veya absorbsiyon katsayısının belirlenmesine yarar.

Belli bir dalga boyu aralığında absorbans taraması yapılır. Böylece ABSORPSİYON SPEKTURUMU elde edilir. Maddenin kimyasal karakteri hakkında bilgi sağlar.

PROTEİNLERİN KONSANTRASYONUNU

BELİRLEMEK İÇİN KULLANILAN UV-VISIBLE YÖNTEMLER:

ÖLÇÜM

Protein çözeltisinin UV absorbsiyonunun ölçülmesi

Protein çözeltisinin bir belirteçle reaksiyona sokulup oluşan renkli bileşiğin (kromofor) görünür alanda ölçülmesi

A280/A260 Oranı (Warburg – Christian Yöntemi

Tirozindeki fenolik gruplar ve triptofandaki indolik gruplar nedeniyle birçok protein 280 nm’de maksimum absorbsiyon gösterir. Bu özellikten yararlanılarak örnekteki protein miktarının yaklaşık olarak bulunması için hızlı bir yöntem geliştirilmiştir. Çok duyarlı

olmamakla beraber (duyarlılık: 0.05-2.0 mg/ml), kolaylığı ve hızlı sonuç

vermesi nedeniyle çok kullanılan bir tekniktir. Ancak, 260 nm’de maksimum absorbsiyon gösteren nükleik asitlerin 280 nm’de de absorbsiyon yetekleri olduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle nükleik asit artıkları ile kontamine durumdaki ilk kaba ekstrelerle çalışıldığında hatalı sonuçlar elde edilebilir. Bunun önüne geçmek için, Warburg ve Christian (1941) tarafından geliştirilmiş bir seri hata düzeltme faktörü (Tablo 2 ) genel olarak tüm proteinler için kullanılmakta ve bu yöntemde ortaya çıkabilecek hata payı daha aza indirgenebilmektedir.

Tablo 2. A280/A260 oranına bağlı olarak, örnekteki nükleik asit % si ve düzeltme faktörlerinin yaklaşık değerleri.

(1 cm ışık yolu için geçerli)

A280/A260 oranı % Nükleik asit Faktör

1.75 0.00 1.116

1.63 0.25 1.081

1.52 0.50 1.054

1.40 0.75 1.023

1.36 1.00 0.994

1.30 1.25 0.970

1.25 1.50 0.944

1.16 2.00 0.899

1.09 2.50 0.852

1.03 3.00 0.814

0.979 3.50 0.776

0.939 4.00 0.743

0.874 5.00 0.682

0.846 5.50 0.656

0.822 6.00 0.632

0.804 6.50 0.607

0.784 7.00 0.585

0.767 7.50 0.565

0.753 8.00 0.545

0.730 9.00 0.508

0.705 10.00 0.478

0.671 12.00 0.422

0.644 14.00 0.377

0.615 17.00 0.322

0.595 20.00 0.278

Protein konsantrasyonu (mg/ml) = 1.5 x A280 0.75 x A260

Protein konsantrasyonu (mg/ml) = Faktör x A280

veya

Biüre Yöntemi

Duyarlılığı düşük (1-10 mg/ml) olmakla beraber, pratikliği nedeniyle geniş çapta kullanılan bir yöntemdir. Reaksiyonun esası Cu atomunun peptid azotlarına bağlanması sonucu alkali çözeltide 540 - 560 nm’de maksimum absorbsiyon gösteren renkli bir kompleks oluşumuna dayanır. Bakır atomlarının ana zincire bağlanması nedeniyle amino asit içeriğinin ölçümler üzerinde herhangi bir önemli etkisi yoktur.

Boya-Bağlama (Bradford Yöntemi)

Bu yöntem, “Coomassie Brilliant Blue G-250” boyasının farklı

konsantrasyonlardaki proteinlere bağlanarak, farklı renk

şiddetinde (koyulukta) çözeltiler ortaya koymasından

yararlanılarak geliştirilmiştir. Boyanın özellikle arjinin gibi bazik

amino asitlere ve bazı aromatik amino asitlere bağlanma

eğiliminde olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla bu yöntemde

proteinin primer yapısının önemi vardır. Duyarlılık sınırları, total

reaksiyon karışımında (5.1 ml) 20 - 140 g olan bu yöntemde (ki

bu da örnek konsantrasyonunun 0.2 - 1.4 mg/ml arasında

olması demektir) asidik boya proteine bağlanır ve 495-595 nm

arasında maksimum absorbsiyon değerleri elde edilir.

Lowry Yöntemi

Bu yöntem, fosfomolibdotungstik asit (Folin-Ciocalteau Belirteci) çözeltisinin tirozin bakiyeleri ile reaksiyona girerek mavi bir renk oluşturması esasına dayanır. Reaksiyon, bakır ile protein arasında kompleks oluşumu ile başlar, alkali çözeltide, oda temperatüründe 5-10 dakika içinde tamamlanır. Bakırın varlığı yöntemin duyarlılığını 3-15 kat artırmaktadır, çünkü Cu ile yapılan kompleks, Folin belirtecindeki Mo ve WO4 (wolframid) ile birleşerek yeni bir kompleks ortaya koyar. Ancak analiz edilen örnekteki fenolik maddeler hatalara yol açabilir. Duyarlılık: 20-400 g/ml