Recuperação de produtos de Bioprocessos. Recuperação de produtos Operações down-stream...

Recuperação de produtos de Bioprocessos

Recuperação de produtos

Operações down-stream

Finalidade de uso: alimentos? medicamentos? diagnóstico?

catálises industriais? detergentes?

Localização: (intra x extracelular)??diversidade química e abundância de

moléculas

Custos

Recuperação de produtos

Operações unitáriasOperações unitárias

-clarificação-rompimento de células-concentração e/ou purificação de baixa resolução-purificação de alta resolução-tratamentos finais

-acondicionamento

Recuperação de produtos

Recuperação de produtos

CLARIFICAÇÃO Separação das células do meio de

cultura Interesse no extrato ou no pellet de

células?

ClarificaçãoClarificação

ClarificaçãoClarificação

1. Filtração• Usado para grandes volumes de extratos diluídos• Obtenção do filtrado e do retido (“torta de células”)• Ausência de esterilidade*• -microfiltração: 0,22 ou 0,45 μm• Filtros convencionais: 100 μm• Problemas com “fouling”• Uso de pressão (vácuo).

Materiais dos filtros: materiais celulósicos, terra diatomácea, materiais sintéticos

“Torta de Células”

ClarificaçãoClarificação

2. Centrifugação• Aceleração do processo de sedimentação

por ação de um campo centrífugo Esterilidade

• Pellet mais úmido que na filtração• Possibilidade de refrigeração

Descontínuo ou contínuo

Tendo definido o processo, torna-se possível selecionar o tipo especifico de centrifuga.

De um modo geral, as centrifugas podem ser divididas em

centrifugas de filtração de sedimentação

Centrifuga de Discos

Centrifuga Decantadora de Vaso Horizontal

Centrifuga TubularCentrifuga Tubular

Centrifuga de CestaCentrifuga de Cesta

Filtração TangencialFiltração Tangencial

Filtração TangencialFiltração Tangencial

Diminui tensão de cisalhamento da célula

Diminuição da formação do fouling Processo usado em

concentrações/purificações do produto

Diferentes “cut off”. Materiais poliméricos

Filtração TangencialFiltração Tangencial

ROMPIMENTO CÉLULAR

Para produtos intracelulares Romper ou permeabilizar? Cuidados com calor e proteases Diferentes composições de parede

celular

ROMPIMENTO CÉLULAR

ROMPIMENTO CÉLULARMétodos:

Enzimáticos

Usados para biomoléculas sensíveis a tensão de cisalhamento

Necessidade de danos parciais Utilização de combinações de enzimas:Leveduras: glicanases, proteases e mananasesBactérias: glicosidadese proteases.

Vantagens: fácil controle de pH e temperatura, alta especificidade.

Desvantagens: custos, variação em função do estado fisiológico do micro-organismo.

ROMPIMENTO CÉLULAR

2. Mecânicos: Mais usados industrialmente. Equipamentos: homogeneizadores de

alta pressão (Prensa Francesa) e moinho de coloidal, vortex*

Mais baratos. Aumento de temperatura.

ROMPIMENTO CÉLULAR

Moinho Coloidal Moinho de bola

ROMPIMENTO CÉLULAR

3. Não mecânicos:

Choque osmótico, Congelamento/descongelamento, Ultra som

ROMPIMENTO CÉLULAR

4. Químicos:

Detergentes, ácidos, bases

Qual método usar dos 4?

Rendimento, especificidade, controle de temperatura, custos.

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

Natureza protéica dos produtos: enzimas, antibacterianos, anticorpos, etc.

1. Precipitação com sais:

Método tradicional e simples Boa capacidade de separação de proteínas Fatores que determinam a estrutura e a

solubilidade de uma proteína Princípio de ppt: perda da estrutura tridimensional Uso de altas concentrações de sal: salting out. -salting in!

Adição de sais reduz a disponibilidade de água, devido à hidratação dos íons do sal, reduzindo a disponibilidade de água (o que torna o meio mais hidrofóbico). Proteínas exibem diferentes graus de hidrofobicidade!!

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

Faixas de saturação utilizadas Controle da temperatura durante adição do sal Controle do pH Centrifugação Suspensão em tampão Volume?? Recuperação de atividade Operação pós-suspensão Necessidade de eliminar o sal por diálise ou gel

filtração?

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

Sais para ppt:• alta solubilidade• pouco viscosidade em altas concentrações• o ânion é mais importante na escolha• -série de Hoffmeister (em ordem crescente de

eficiência):• nitratos < brometos< cloretos< acetato<

sulfato< fosfato prefere-se cátions monovalentes: Na < K

< NH4

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

Sulfato de Amônio (NH4)2SO4 100% de saturação: 4 M (> 700 g/L) solubilidade elevada em amplas faixas de

temperatura produz baixa viscosidade efeito anti-proteolítico e antibacteriano baixo custo concentração de proteínas Precipitação -60 g de sal em 100 mL de extrato (85% de

saturação)

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS Precipitação isoelétrica Alterar o pH até o ponto isoelétrico (PI)

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

Precipitação por solventes orgânicos: -etanol ou acetona: reduzem a Aw,

diminuem a constante dielétrica do meio, aumentando a interação entre cargas opostas de AA expostos

Vantagens: redução da densidade do meio, favorecendo a sedimentação natural.

Desvantagem: inativação da enzima, efeito de diluição, aquecimento

Precipitação por solventes orgânicos

Ultrafiltração

Transporte de soluções através de membranas com poros de diâmetros entre 0,001 e 0,1 μm sob pressão.

• Usado para macromoléculas como proteínas e polissacarídeos.

• água e pequenas moléculas passam pela membrana, enquanto que as maiores, com diâmetro nominal (cut-off) maior, ficam retidas.

• cut-offs devem ser 20% menores que a molécula alvo.

• Vantagens: retira sais, concentração do produto, aplicável em grandes escalas.

PROBLEMAS: “fouling”, custos, furos na membrana, formação de agregados, baixa resolução, EFICIÊNCIA!

Cromatografia

Princípio: solutos de um meio líquido (enzimas, anticorpos, etc) são adsorvidos/retidos em um leito poroso. A posterior remoção gradual do soluto por ação deu uma fase móvel (eluente) resulta na separação das diferentes moléculas.

Cromatografia

Configuração geral: -coluna-fase estacionária (matriz), que pode interagir química/eletricamente ou não apresentar interação com o produto,-fase móvel: tampão

Cromatografia

3.1. Troca Iônica• uma das mais utilizadas• processo baseado na afinidade que os

componentes de uma amostra têm pelos sítios iônicos de uma matriz.

a fase estacionária, eletricamente carregada, tem a capacidade de reter solutos que estão na fase móvel e apresentam cargas opostas

Troca Iônica

Para ocorrer adsorção, controlam-se fatores como pH e força iônica.

Trocadores: catiônicos (carregados -) ou aniônicos (carregados +)

Troca Iônica Eluição reversibilidade da ligação- as proteínas exibem

diferentes números de sítios carregados na molécula, por isso seus graus de ligação à resina são variáveis.

Formas de eluir: 1. Alteração de pH - diminuir pH em trocas aniônicas - aumentar o

pH em trocas catiônicas. Problema: resinas tem boa capacidade

tamponante.

Troca Iônica

2. Alteração da força iônica mais usado o “desligamento” da proteína da resina

ocorre pelo deslocamento com outros íons (Na+ou Cl-, por exemplo), com a mesma carga adsorvida, porém com mais força de interação com a fase estacionária.

Eluente mais usado: NaCl utiliza-se um gradiente crescente de NaCl

Troca Iônica

Troca Iônica

Vantagens da troca iônica -reprodutibilidade -alta resolução -concentração da amostra -rapidez Escalonamento -aumenta-se o volume da coluna -relação altura/diâmetro

Gel filtração

gel permeação, cromatografia de exclusão molecular

muito usada para purificação de enzimas, a separação ocorre baseada no tamanho

(peso molecular) da enzima são usadas resinas inertes fabricadas em

polímeros naturas (dextranas) ou sintéticos.

Gel filtração

Gel filtração

Medidas das colunas -colunas largas e curtas: separação

rápida, pouca turbulência e pouco resolução

-colunas estreitas e compridas: separação lenta, maior resolução

COLUNA IDEAL: a altura deve ter de 20–40 x o diâmetro.

Cromatografia de Afinidade

Ligação específica do ligante (na resina) com a molécula alvo

Extremamente seletiva

Cromatografia de Afinidade Tipos de interação específica:

-antígeno/anticorpo -enzima/substrato -enzima/cofator -“cauda de histidina” proteínas recombinantes IMAC (Cromatografia de Afinidade por Metal Ionizado)

Eluição:

-detergentes, -mudanças na concentração de sal -aplicação de uma molécula com mais afinidade (eletrólitos)

Cromatografia de Afinidade

Eletroforese Usada para acompanhar as etapas de

purificação• Separação de proteínas pela ação de um

campo elétrico que força o movimento de proteínas eletricamente carregadas através de um gel.

• As proteínas movimentam-se em função da quantidade total de cargas elétricas negativas (que é proporcional ao peso molecular),

Após a “corrida”as proteínas são coradas com Comassie Blue ou com prata,

Eletroforese

Aspectos práticos-Carregar a proteína negativamente (SDS)

-eliminar pontes de dissulfeto (mercaptoetanol)

Tratamentos finais

Qual o grau de pureza? • acondicionamento• liofilização, secagem• inibidores de atividades indesejáveis

Veículos de estocagem:

glicerol, sorbitol, sacarose