RSV CP 与植物和昆虫互作的研究

RSV CPRSV CP 与植物和昆虫互作的研与植物和昆虫互作的研究究

赵淑玲

2008. 12. 6

研究背景

研究内容

研究方法

特色及创新处

研究计划及预期成果

RSV 引起的病症

病症：水稻条纹病毒 (Rice stripe virus, RSV) 是水稻条纹叶枯病的致病原，该病毒靠灰飞虱传播。

症状：感病水稻发病初期叶片沿叶脉呈现断续的黄绿色或黄白色短条斑，以后常连成褪绿大片。早期发病植株枯死，发病迟的只在剑叶或叶鞘上有褪色斑，但抽穗不良或穗畸形不实，病株分蘖一般减少。

水稻条纹叶枯病最早于 1897 年在日本发现 ,在我国自 1963 年在苏南地区始发后 ,已经扩散到 18个省市 ,特别是自 2001 年来在江苏和河南连续暴发 ,造成了水稻生产上的巨大损失。因此如何防止病害发生和控制病害流行成为研究者迫切希望解决的问题。

RSV 的危害

RSV 基因组结构和功能

RNA1

RdRp

RNA2

RNA3

NS2 NSvc2

NS3 CP

RNA4SP MP

RdRp: RNA 聚合酶

NSvc2: 推测为糖蛋白

NS3 ： RNA 沉默抑制子

CP： 外壳蛋白

SP： 症状相关蛋白

MP: 移动蛋白

3506 nts

2472 nts

2137 nts

8970 nts

RSV 研究情况 初步研究的方面

基因组序列、某些基因功能

转基因的抗病毒植物

还需研究的方面 基因功能

病毒的致病机理

病毒的传播机制

深入研究难点

RSV 的侵染性克隆难以建立 灰飞虱细胞系还未建立

立项依据及研究意义

RSV 与宿主互作研究的重要性

研究的创新性

结合实验条件

研究内容 CP 与水稻的互作

构建水稻 cDNA 文库

筛选 cDNA 文库中与 CP 互作的蛋白

蛋白功能分析

cDNA 文库：生物某发育时期所转录的全部 mRNA经反转录形成的 cDNA 片段集合。

测序、序列比对，分析基因功能。

方法：酵母双杂交系统

NSvc2 蛋白是否为病毒传播必需

CP 、 NSvc2 蛋白是否存在相互作用

NSvc2 蛋白是否具有膜融合功能

酵母双杂交系统验证蛋白间的互作

利用杆状病毒表达系统使目的蛋白展示在细胞膜上，然后研究膜融合功能

CP 、 NSvc2 蛋白与昆虫细胞的互作

水稻 cDNA 文库构建

研究方法

总 RNAmRNA 的分离

AAAATT TT

mRNAcDNA

cDNA 第一链合成

AAAATT TT

cDNA 第二链合成

AAAA5’

AAAA

TT TT

加接头，连接载体

构建 cDNA文库

Oligo(dT)纤维柱分离

逆转录

RNaseH

DNA polymerase

DNA ligase

重组载体感染宿主菌

酵母双杂交系统

酵母激活因子 GAL4 由 N端的 DNA 结合域 (BD) 和 C端的转录激活域 (AD) 组成。 GAL4 分子的 DNA 结合域可以和上游激活序列结合，而转录激活域则能激活下游的基因进行转录。只有 BD和 AD 共同存在形成复合体时才能激活下游基因转录。

在酵母双杂交系统中，编码这两个结构域的 DNA 片段分别被构建在两个独立的表达载体上，一个表达载体含有 BD基因片段与已知蛋白形成的融合基因，另一载体含 AD 基因片段与未知 cDNA 形成的融合基因。若两种蛋白间互作便会形成复合体，启动报告基因的表达

BD X COOHGal4

NH2

+

cDNA library

COOHcDNAAD

Gal4

NH2

共转化

AD

Gal4

?

BD X

Promoter LacZ Reporter

Promoter LacZ Reporter

BD

X

?AD

酵母双杂交系统原理

酵母双杂交基本过

程

蛋白细胞膜表面表达载体构建

NSvc2 蛋白前端连接 gp64 的信号肽序列，后端连接 VSV G 蛋白的跨膜结构域， 这样 NSvc2 蛋白表达后便成功展现在了昆虫细胞膜上

gp64 sp cp/NSvc2 VSV G tm

目的蛋白

信号肽

跨膜域

杆状病毒表达系统表达蛋白

细胞膜融合功能的研究

目的蛋白在细胞膜表面的表达检测

抗体标记 TRITC ， TRITC 是一种荧光素，用激光共聚焦显微镜观察则细胞的表面出现橙红色荧光。

目的蛋白膜融合功能检测细胞低 pH条件下诱导，然后观察细胞融合 的。

pH shift time 0 +4h +7h

本研究创新点

RSV 与宿主相互作用的研究还未有报道

首开了 RSV 侵染介体昆虫机理的研究

利用杆状病毒表达系统，使目的蛋白呈现在膜上，便于研究蛋白的膜融合功能

年度研究计划

2009.1-2009.12 ： RSV CP 与水稻的互作

2010.1-2010.6 ：互作蛋白的功能分析

2010.7-2011.6 ： RSV侵染昆虫细胞机制研究

预期研究成果

构建水稻 cDNA 文库

探明 RSV CP 功能及在病毒致病过程中所起作

用

RSV NSvc2 蛋白的膜融合功能

初步阐明 RSV 侵染介体昆虫的机理

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