TCC aula 3

Questões de revisão da aula anterior

1. Descreva sucintamente a evolução da classificação dos seres

vivos.

2. Refira as principais diferenças na parede e membrana celulares

entre o Domínio Bacteria e Domínio Archea.

3. Escolha 3 características para distinguir células que pertençam ao

reino Fungi e ao reino Protista.

4. No filo Ascomicota encontram-se fungos com reprodução

assexuada por esporulação e por gemulação. Explique as

diferenças e dê exemplos.

5. Os fungos têm um papel muito importante no desenvolvimento

sustentável de processos biotecnológicos. Comente, justifique e dê

exemplos.

6. Selecione uma espécie de fungo e descreva-o: filogenia,

morfologia, reprodução, nutrição, interesse, etc.

Condições de cultura

Requisitos nutricionais

Meios de Cultura

Temperatura

Necessidades gasosas

pH

Pressão osmótica

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Requisitos nutricionais

Os microrganismos necessitam de assegurar

as suas funções vitais: Produção de energia

Síntese de biomassa

NUTRIENTES

3

Principais requisitos nutricionais

Água: 80-90% peso

Macronutrientes:

C, O, H, N, P, S,…

Micronutrientes:

Elementos mínimos

Mg, Co, Cu, Zn,…

Cofactores - enzimas

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Exigências suplementares

Factores de crescimento

Nutrientes acessórios, não podem ser

sintetizados na célula Aminoácidos, purinas, vitaminas

Necessários a microrganismos auxotróficos

(ex. Mutantes)

Microrganismos prototróficos - não requerem

factores de crescimento (maioria dos fungos)

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Fontes de Carbono

Heterotróficos

Carbono orgânico, principal fonte

Compostos utilizáveis depende do tipo de microrganismo

Autotróficos

CO2 – principal e exclusiva fonte de C

Conversão de CO2 em compostos orgânicos, processo reductor que requer energia.

Autotróficos facultativos

Ex. bactérias

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Classificação dos microrganismos de acordo com as

fontes de carbono e energia

Fonte de Carbono

CO2 Carbono orgânico

Fonte de Energia

LUZ

Composto inorgânico

Composto orgânico

FotoautotróficoAlgas, bactérias fotossintéticas

QuimiolitoautotróficoBactérias nitrificantes e

oxidantes de enxofre

QuimioorganoautotróficoBactérias metilotróficas autotróficas

FotoheterotróficoBactérias fotossintéticas,

Archea halófilas

QuimiolitoheterotróficoArchea metanotróficas

QuimiorganoheterotróficoFungos, protozoários,

Maioria das bactérias

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Meios de cultura

Permitem promover o crescimento das células,

in vitro

Incluem nutrientes indispensáveis sob forma

assimilável

Nutrientes presentes em quantidades não

tóxicas e não limitantes

O meio de cultura deve simular o mais possível

o meio de onde o microrganismo foi isolado

satisfazendo todos os requisitos nutricionais

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Meios de cultura Constituídos por uma base mineral suplementados por uma fonte de:

Carbono

Energia

Azoto

Factores de crescimento

Autotróficos

Heterotróficos Heterotróficos

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Tipos de Meios

Estado Físico

Líquido

Sólido

Semi-sólido

Composição química

Quimicamente definidos

Quimicamente complexos

Funcionalidade

Simples

Selectivos

Diferenciais

Enriquecidos

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Meios sólidos

Adição de agar – agente solidificante.

Polissacárido complexo, extraído de algas.

Soluções a 1-1.5 % fundem a 100 ºC e solidificam quando T<42 ºC.

Não é biodegradável, não perde poder solidificante.

Permitem um meio firme ao crescimento de colónias.

Relativa clareza permite visualização das colónias.

Muito útil para isolamento de microrganismos.

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Técnicas de isolamento em agar

12

Técnicas de isolamento em agar

Para microrganismos

anaeróbios

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Meios semi-sólidos

Consistência pouco firme

Agente solificante 0.3 a 0.5 % (agar)

Permite motilidade

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Composição química

Quimicamente definido

Composição química rigorosamente conhecida

Utiliza-se para microrganismos cujas exigências

nutricionais são claramente conhecidas

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Meios complexos

Não se conhece a composição exacta

Nutrientes complexos Extracto de carne

Extracto de levedura

Peptona

Leite

Extracto de solo

Substâncias complexas contendo:

Açucares, aminoácidos, vitaminas, sais,...

Aplica-se a uma gama alargada de microrganismos Factores de crescimento não conhecidos

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Tipos de Meios Exemplo: O meio LB (Luria-Bertani

broth) é utilizado para crescimento e

manutenção de bactérias.

Composição:

Triptona 10 g/L;

Extracto de levedura 5 g/L;

Cloreto de sódio 10 g/L.

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Constituintes dos meios complexos

Extractos: Tecidos eucariotas (levedura, bife, fígado, coração, plantas,

etc) são extraídos por fervura e depois concentrados e secos até à consistência de pasta ou pó. São fonte de amino ácidos, vitaminas, coenzimas...

Peptonas: Misturas complexas de componentes orgânicos e inorgânicos

obtidos por digestão de tecidos que contêm proteínas de animais, tais como musculo de bife, gelatina, caseína, cerais, etc... São productos comercializados em pó. As peptonas contêm principalmente peptidos e amino ácidos.

Ex: Triptona: resulta da digestão da caseína

Ex: Fitona: resulta da digestão de soja

Ex: Peptona: Resulta da digestão de musculo de bife. Peptona numa concentração de 0.1% é também usado como

diluente.

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Meios selectivos

Suprimem o crescimento de microrganismos

indesejáveis

Permitem isolamento de culturas puras ou

axénicas a partir de culturas mistas

Ex: sais biliares inibem crescimento de bactérias

Gram+

Outros agentes:

Antibióticos, ácidos, oxigénio, pH,...

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Exemplo: Sabouraud Dextrose Agar (SDA) inibe o crescimento de muitas

bactérias, é selectivo para leveduras e fungos

Meios selectivos

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Meios diferenciais

Meios que não inibem o crescimento mas

permitem distinguir tipos de microrganismos

Diferenciação:

Cor e tamanho das colónias, cor do meio, etc

Ex: agar MacConkey usa-se para isolar

enterobactérias patogénicas; permite também

distinguir entre microrganismos que fermentam a

lactose.

Meio selectivo-diferencial

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Meios diferenciais

Staphylococcus (growth, yellow colonies) vs.

Streptococcus (growth, white colonies)

Exemplo: CNA (agar com sangue) permite diferenciar

Estafilococos de Estreptococos

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Meios diferenciais e selectivos

MSA: crescimento/fermentação

Exemplo: MSA permite

seleccionar o género

Estafilococos e diferenciar

entre fermentativos e não

fermentativos

Exemplo: MAC selectivo

para gram negativas e

diferencia entre

fermentativos e não

fermentativos

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Meios enriquecidos

Permitem o crescimento de uma espécie em

detrimento de outras

São muito nutritivos

Favorecem crescimento de microrganismos de

crescimento fastidioso

Ex: Strepcoccus pyogenes; Haemophillus influenza

Ex: meios de agar/sangue; agar/chocolate,...

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Exemplo: Agar Sangue Exemplo Agar chocolate

Meios enriquecidos

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Temperatura

O microrganismo apresenta a sua temperatura

óptima, mas também sobrevive a temperaturas

mais altas ou mais baixas. De acordo com a

temperatura, os microrganismos podem ser

classificadas em:

- psicrófilos: cresce abaixo de 15 ° C (latente);

- mesófilos: entre 20 - 40 ° C;

- termófilos: entre 45 - 55 ° C;

- estenotermófilos: entre 65 - 80 ° C.

Fungos: mesófilos (filamentosos (20 a 25oC) < leveduras (25 a 30 0C)

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Necessidades gasosas

De acordo com o a necessidade de oxigénio:

- aeróbios: crescem na presença de O2; Aeróbios estritos – dependem totalmente da respiração aeróbia

- anaeróbios: crescem na ausência de O2; Anaeróbios estritos- O2 é letal

Anaeróbios aerotolerantes- metabolismo exclusivamente anaeróbio, mas O2 não é letal

- anaeróbios facultativos: crescem tanto com ou sem O2;

- microaerófilos: crescem em concentração de O2 menor do que a do ar atmosférico (5% O2).

Fungos são em geral aeróbios e alguns são anaeróbios facultativos

Podem suportar altas concentrações de CO2 e baixas de O2

Exemplo: Penicillium roqueforti suporta dentro de queijo 80 % CO2 e 4% O2

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Necessidades gasosa

Anaerobiose ou microaerofilia

Jarro de anaerobiose

Catalisador: paládio

Indicator de anaerobiose

Pacote

gerador de

gás

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pH Microrganismos acidófilos – pH entre 1.0 e 5.5

Microrganismos alcalófilos – pH entre 8.5 e 11.5

Microrganismos neutrófilos – pH entre 5.5 e 8.0 Fungos preferem meios ácidos, pH 5-6 mas toleram uma ampla

gama de pH: 2,5 a 9,5

Bactérias preferem meios neutros

Substâncias tampão Adicionadas ao meio para manter o pH dentro da gama óptima de pH de

crescimento do microrganismo. Ex: fosfatos de potássio e sódio, e carbonato de cálcio. Impedem variações bruscas de pH resultantes da produção metabólica de ácidos e bases. Nota: Peptona – poder tamponante.

Indicadores de pH São adicionados ao meio para detectar alterações na concentração de H+

durante o crescimento de um microrganismo, como por exemplo para avaliar a fermentação de hidratos de carbono. Muito utilizados em meios diferenciais. Ex: Púrpura bromo-cresol, azul de bromo-tiomol e vermelho de fenol

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Pressão osmótica

Usam-se substâncias para manter o equilíbrio do meio, impedem que a célula se rompa (NaCl 0.5 % ou sacarose 0.1 %) .

Atividade da água, 0<aw<1 Em geral >0.98

Fungos são em geral xerófilos (amigo do seco); Conseguem

crescer em condições de aw< 0,84

Fungos filamentosos<leveduras<bactérias

Microrganismos halófilos Adaptados a concentrações de sal elevadas >0.2 M

5.5 M NaCl → aw = 0.75 → Archaebacteria

Microrganismos osmofílicos Adaptados a concentrações de açúcar elevadas ou elevado

índice de desidratação

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Meios de culturaFungos filamentosos

Meios de cultura ricos e complexos

Meio de agar com batata e dextrose – PDA (rico em açucar)

Meios ricos em açúcar favorecem crescimento vegetativo

Meios menos ricos em açúcar favorecem esporulação

Exemplo PCA- batata, cenoura e agar.

Agar de Extrato de Malte (MEA)

Agar de Czapek (CZ)

Meio CZ apenas permite crescimento de espécies

capazes de utilizar o nitrato como fonte de azoto

Cultura de Fungos filamentosos

Crescimento em meio liquido

Inoculação

Suspensão de espóros

Suspensão de micélio

Agitação

Quebra das hifas

Micélio mais disperso e homogéneo

Fungos filamentosos- Prática (MB)

Crescimento em meio sólido – PDA

Inoculação do agar em caixa

Solução de espóros em Tween 80 (0.05%)

Porção de micélio

Incubação

Medir crescimento (diâmetro)

Meios de culturaLeveduras

Meios de cultura ricos e complexos

Meio YPD – Extrato de levedura, peptona, dextrose

Meio de Sabourough – Meio rico em carbohidratos, favorece o

crescimento de fungos e leveduras em detrimento das bactérias

Adicionando cloranfenicol e cicloheximida permite isolar dermatófitos

Meio YNB- Yeast Nitrogen Base

sem/com aminoácidos; sem/com sulfato de amónio

Utiliza-se para estudar a utilização de fontes de carbono

Peptona – 20 g/L

Extracto de levedura – 10 g/L

Glucose – 20 g/L

YPDA- adiciona-se 20 g/L de agar

Cultura de leveduras

Colónias bem definidas em meio sólido

Turvação do meio líquido indicando

crescimento celular – suspensão

homógenea

Técnicas de Preservação de microrganismos

Técnicas de esterilização e desinfecção

Tecnologia de cultura de

células microbianas

Módulo II

Engenharia Clínica

Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica

Introdução à Bioengenharia I

Mestrado em Biotecnologia

2014-2015Isabel Belo/DEB

Preservação

Objectivo

Conservar material biológico garantindo:

ausência de contaminação

perdas de viabilidade

ausência de alterações genéticas

Culturas stock Industria:

manter as estirpes de produção

Laboratórios académicos:

manter estirpes que desempenham determinadas reações

Laboratórios médicos:

estirpes referência para testes de patologia

Taxonomistas:

grande nº de culturas para fins comparativos

Investigação:

Culturas puras com características inalteráveis

Métodos de preservação

Aspectos a ter em conta Manutenção da viabilidade

Alteração da população

Alteração genética

Pureza

Custo

Nº de culturas

Valor da culturas

Fornecimento e transporte

Frequência de uso das culturas

Armazenamento no frio (Sub-cultura)

Inoculação de meio fresco em tubo ou frasco

Incubação a T adequado

Armazenamento (ex. 5 ºC) Reduzir entrada de ar – parafina liquida

Baixo custo de equipamento

Elevado trabalho manual (repicagens frequentes)

Tempo de armazenagem < 1 semana

Métodos de preservação

Armazenamento no frio (Sub-cultura)

Inoculação de meio fresco sólido Caixa de agar ou agar em tubo inclinado

Armazenamento (ex. 5 ºC)

Baixo custo de equipamento

Elevado trabalho manual (repicagens frequentes)

Risco de desidratação e contanimação

Risco de alteração da população aumenta com o nº de sub-culturas

Tempo de armazenagem 1 a 3 meses

Métodos de preservação

Secagem

Desidratação

Remoção de água e prevenção da rehidratação

Aplicável a fungos e algumas bactérias

Ex. secagem em sílica gel (5 anos)

Secagem em papel, armazenamento em caixas

herméticas

Em suportes pré-secos de amido, dextrano, …,

Em discos de gelatina

Liofilização (Freeze drying)

A água é removida por sublimação de uma

amostra congelada

Liofilização

A água é removida por sublimação de uma

amostra congelada Os organismos são suspensos num meio adequado,

congelados e expostos a vácuo.

Após liofilização as células são guardadas em vácuo ou num

gás inerte em ampolas individuais.

Liofilização Armazenagem do produto liofilizado à

temperatura ambiente ou 4ºC – 8ºC

Humidade residual 1 a 3%

Facilidade de transporte e

armazenamento

Durabilidade alta

Vários anos

Pode ocorrer perda de

viabilidade celular

(mantem até ~30 %)

Desvantagens: equipamento caro

Reativação das células

Abrir as ampolas em

ambiente asséptico

Usar uma pequena

quantidade de meio para

hidratar as células

Inocular meios sólidos

e líquidos

Avaliar a viabilidade

celular

Criopreservação

A água torna-se inacessível por congelação

Pode ocorrer danos celulares no processo de

congelamento/descongelamento

Adição de crioprotectores

Ex: glicerol (10% v/v) e DMSO (5% v/v)

Congelação

De -20 ºC a -196ºC

-80 ºC (arcas) vials com esferas e glicerol

-140 ºC (Nitrogénio em fase vapor)

-196ºC (Nitrogénio em fase líquida)

Criopreservação

Em tubos específicos

Com esferas para adesão celular

Com crioprotetores

Equipamento caro

Elevada manutenção da viabilidade celular

Grande durabilidade da estabilidade das

culturas

Tubos criogénicos

Colecções

Coleções de culturas de microrganismos

instruções específicas para aquisição, manutenção e distribuição

técnicas de preservação utilizadas devem garantir a manutenção do potencial do microrganismo

material biológico microbiano certificado – garantia de qualidade e autenticidade

Colecções de culturas de microrganismos

Funções

Coleccionar e catalogar

Manter

Fornecer

Desenvolvimento de bases de dados

Regulamentação dos depositários e clientes

Regulamentação do transporte

Requisitos

Definição da natureza do material biológico e do

grupo de risco

Equipa qualificada e treinada

competência para trabalhar com os microrganismos da coleção

conhecimento dos procedimentos de higiene e biossegurança -

evitar contaminação de amostras e riscos de infecção

Dependências físicas adequadas ao manuseio de

microrganismos do grupo de risco definido pela

coleção

ECCO European Culture Collections Organization

Colecções CélulasDSM – Deutsche sammlung

vom mikroornismen

Alemanha

Bactérias, plasmídeos, fungos, leveduras, células de

plantas e animais

CBS- centraalbureau voor

schimmelcultures

Holanda

Fungos e leveduras

http://www.cbs.knaw.nl/

MUM- Micoteca da

Universidade do Minho

Fungos

http://www.micoteca.deb.uminho.pt/

Colecções de culturas de microrganismos

Exemplos das maiores do mundo

ATCC – American Type Culture Collection, EUA https://www.atcc.org

JCM – Japan Collection of Microorganisms, Japão http://www.jcm.riken.go.jp/JCM/catalogue.shtml

WFCC – World Federation for Culture Collectionshttp://wdcm.nig.ac.jp/wfcc/index.html

Técnicas de esterilização e

desinfecção

Esterilização e desinfecção

Métodos Físicos

Calor

Filtração

Métodos químicos

Agentes antimicrobianos

Esterilização e desinfecção

Permitem o controlo do desenvolvimento dos

microrganismos

Métodos essenciais

Tratamento e prevenção de infecções

Prevenção de contaminações de culturas puras

Controlo de microrganismos

Esterilização

Completa destruição ou remoção de todas as

formas de vida, patogénicas ou não.

Desinfecção

Eliminação ou remoção de microrganismos

causadores de doenças

Sanitização

Redução da carga bacteriana a níveis seguros

para a saúde pública.

Métodos físicos-CalorMétodo Temperatura Eficiência

Incineração >500 ºC Vaporiza o material orgânico em superficies não

inflamáveis.

Água à ebulição 100 ºC 30 min de fervura mata formas vegetativas.

Não destroi endósporos nem toxinas.

Fervura intermitente 100 ºC 3 ciclos de 30min

Destrói endósporos bacterianos.

Autoclave

(vapor sobre pressão)

121 ºC

15 min.

Mata todas as formas de vida, incluindo endósporos

bacterianos.

Material cirúrgico, roupas, meios de cultura, materiais

carbonizáveis, etc.

Calor seco

(ar seco em estufa)

160 ºC

2 h

Oxidação dos constituintes da célula

Material que deve ser mantido seco.

Ex: Vidro e metal

Calor seco

(ar seco em estufa)

170 ºC

1 h

idem. Notar que o aumento de temperatura de 10 ºC

diminui 50 % o tempo de esterilização.

Pasteurização

(metódo batch)

63-66 ºC

30 min

Mata a maioria da células vegetativas de

microrganismos patogénicos.

Industria alimentar. Evita alterações pela temperatura.

Pasteurização

(metódo flash)

72 ºC

15 s

Idêntico ao batch. Para o leite, os efeitos indesejáveis

na qualidade e sabor são menores.

Métodos físicos-Calor

autoclave Bico de bunsen

Esterilização T> 100ºC Incineração (anças, agulhas)

Ambiente assético

Susceptibilidade microbiana a temperaturas

elevadas

Ponto térmico letal

Temperatura mínima que mata todos os

microrganismos ao fim de 10 min

Tempo térmico letal

Tempo mínimo necessário para matar todos os

microrganismos, a uma dada temperatura

Tempo de redução decimal, D

Tempo necessário para reduzir 90% a população

microbiana, a uma dada temperatura

Susceptibilidade microbiana a temperaturas

elevadas

N/No = e (-K t)

Sabendo que o

tempo de redução

decimal de

tratamento térmico

a 110 oC é 20 min

determine a

constante cinética

de inativação

térmica.99.9% de inativação

Redução 3 log

Métodos Físicos - Filtração

Remoção de microrganismos de fluidos

Gases e líquidos termo-lábeis

Soro, plasma, vitaminas, antibióticos, etc

Discos ou membranas de celulose ou policarbonato com

poros de 0,05 μm a 0,8 μm

Métodos Físicos - Filtração

Atmosferas isentas de microrganismos

Câmaras de fluxo laminar

Filtros de elevada eficiência

Remoção de partículas e microrganismos do ar

Métodos Físicos

Radiações

Acção directa sobre os constituintes da célula, ex DNA

Radiações ionizantes Raios g, raios X

Termo-lábeis, ex. Injectáveis

Radiações não ionizantes

Ultravioleta (240 a 280 nm)

Impede ou altera a replicação de DNA

Agente microbiocida ou mutante

Existe em câmaras de fluxo, laboratórios, blocos

operatórios

Agentes químicos

Diversos agentes químicos matam ou inibem o crescimento de microrganismos

Agentes antimicrobianos

Eficácia depende de: Dimensão da população microbiana

Composição da população microbiana

Concentração do agente antimicrobiano

Duração da exposição

Temperatura

Envolvente local (biofilme, matéria orgânica).

Agentes antimicrobianos

Agentes antimicrobianos

Resistência a agentes químicos

Escala crescente

Formas vegetativas de bactérias

Formas vegetativas de fungos e esporos fúngicos

Vírus

Micobactérias

Esporos bacterianos

Priões

Testes de sensibilidade

Avalia a capacidade de um microrganismo de

se multiplicar in vitro na presença do agente

antimicrobiano.

Métodos de diluição:

Meios de cultura líquidos ou sólidos com crescentes

concentrações do agente, com a mesma concentração

de inóculo.

Permite determinar concentração mínima inibitória

a mais fraca concentração de antibiótico capaz de inibir

completamente “in vitro” o crescimento visível de um

microrganismo.

Determinação da CMI e da CMB de um antibiótico

em meio liquido

Concentração Mínima Bactericida (CMB)

A mais fraca concentração de antibiótico que, após 18 horas de contacto,

elimina 99,9% de uma população bacteriana.

Normas NCCLS - Clinical and Laboratory Standards Institute

Outros métodos de controlo anti-microbiano

Homogeneização por alta pressão

Utiliza sistemas de compressão de fluidos a

pressões superiores a 100 MPa (1000 bar)

Leva à rutura celular, aplica-se a produtos

alimentares

Fototerapia dinâmica

Agente fotossensibilizador (FS)

Irradiação: comprimento de onda de luz específico

Ativação do FS na presença de oxigénio gera

espécies reativas de oxigénio

Morte celular