Ultraestructura a la Vista: Indicaciones de la Microscopía

Ultraestructura a la Vista:

Indicaciones de la Microscopía

Electrónica

Josep Lloreta Trull

Hospital del Mar

Universidad Pompeu Fabra

Curso de Primavera, Mayo 2010

S.E.A.P.

Microscopía Electrónica:

¿Cómo, Cuándo y Porqué?

Max Knoll Ernst Ruska

MICROSCOPIO

ELECTRONICO

• Electrones

• Campos magnéticos

• Sistema de vacío

M. ELECTRONICO

TRANSMISION

M. ELECTRONICO

SCANNINGM. OPTICO

PODER DE RESOLUCIÓN

• Capacidad de discriminar dos

puntos muy próximos como

puntos diferentes

• Se expresa como la distancia

entre estos dos puntos

PODER DE RESOLUCIÓN

PODER DE RESOLUCIÓN

M. OPTICO = 0,2 m M. ELECTRONICO = 0,2 nm

M. ELECTRONICO = M. OPTICO x 1.000

MICROSCOPIA ELECTRONICA

• Identificar fenotipos celulares

• Identificar elementos extracelulares

• Relacionar la morfología y la función

• Entender procesos biológicos

normales y patológicos

La microscopía electrónica es

la continuación morfológica natural

de la microscopía óptica

Microscopía Electrónica:

¿Cómo?

M. OPTICA vs. ELECTRONICA

Fijación importante

Formaldehido

Parafina

Cuchilla de metal

Cortes de 3 m

Portaobjetos

Colorantes

Fijación crítica

Glutaraldehido - Osmio

Resinas (polímeros)

Cuchilla de diamante

Cortes de 80 nm

Rejillas de 3 mm

Metales pesados

OBTENCIÓN DE MUESTRAS

PARA M. ELECTRONICA (I)

• Tejido fresco: Fijación INMEDIATA en glutaraldehido

• Tejido en formol: Inmersión en tampón cacodilato

• Bloque de parafina: Obtención en el laboratorio de M.E. (Marcar zona de interés en preparación histológica)

• Muestras congeladas: No sirven para M.E.

OBTENCIÓN DE MUESTRAS

EN FRESCO PARA M. E. (II)

• Antes de hacer nada más, tomar una lámina fina (1mm de grosor máximo) y sumergirla en glutaraldehido fresco– Utilizar hoja de bisturí nueva

– Tomar la muestra de • Zona recientemente cortada, no desecada, no

pintada ni lavada con agua u otros líquidos

• Si hace falta, “refrescar” la superficie

• Evitar áreas de necrosis, hemorragia o fibrosis

• Tomar muestras separadas de áreas macroscópicas diferentes

• Evitar desecación y compresión del tejido

OBTENCIÓN DE MUESTRAS

EN FRESCO PARA M. E.(III)

• Al acabar el procesado macroscópico de la pieza, cortar la lámina de tejido en cubos de <1mm

• Usar hoja de bisturí nueva

• No comprimir ni desecar la muestra (mantenerla sumergida en glutaraldehido durante el tallado)

• Poner fragmentos en recipiente con glutaraldehido fresco y guardar en nevera

FIJACIÓN EN

GLUTARALDEHIDO

• Proteínas

–Filamentosas

–Globulares

–Cristalinas

• Hidratos de carbono

• Acidos nucleicos

• Casi no fija los lípidos

FIJACION (Y TINCION) EN

TETROXIDO DE OSMIO

• Lípidos insaturados

–Polares

• Membrana plasmática

• Membranas mitocondriales

• Vesículas y gránulos

• RER i REL

• Mielina y cuerpos mielínicos

–Vacuolas lipídicas

TINCIÓN PARA M.E.

Medios de Contraste

• Citrato de Plomo

y

• Acetato de Uranilo

Microscopía Electrónica:

¿Cuándo?

EL TRIANGULO

ULTRAESTRUCTURAL

Formación

InvestigaciónDiagnóstico

Time

Expectations

Time

Expectations

1960-80 1980-2000 2001-10

M.E. en la Sala de Tallado

Muestras Dirigidas a M.E.

• Enfermedades ciliares

• Biopsia de piel

• Enfermedades de depósito

• Hematología

M.E. en la Sala de Tallado

¿Cuándo tomar muestras?

• Biopsias de músculo y nervio

• Biopsia renal y nefrectomía (tumoral y no tumoral)

• Tumores pleurales y mediastínicos

• T. cerebrales

• T. endocrinos-neuroendocrinos

• T. de partes blandas

• T. pediátricos y/o de cél. pequeñas

• Metástasis

MICROSCOPIA ELECTRONICA

COSTOS

• Muestra en stock 6€

• Estudio completo 120€

Microscopía Electrónica:

¿Porqué?

¿Para qué?

INDICACIONES GENERALES

• Complemento con la MO, la IHQ y otras

técnicas

• Interés pronóstico, terapéutico o

científico

• Control de calidad (estudio de casos

aparentmente resueltos sin dudas)

INDICACIONES M.E.

Patología no tumoral

• Enfermedades ciliares

• Biopsia renal

• Músculo y nervio

• Bacterias, virus, protozoos

• Biopsia de piel

• Enfermedades de depósito

• Hematología

INDICACIONES M.E.

Patología no tumoral

• Discinesia ciliar

–Síndrome de Kartagener (“cilio inmóvil”,

esterilidad, dextrocardia)

–Alteraciones primarias de la motilidad

ciliar

DEFECTO PARCIAL BRAZOS DE DINEINA

INDICACIONES M.E.

Patología no tumoral

• Biopsia renal: M.E. Imprescindible

–Nefropatía de cambios mínimos

–Enfermedades de la membrana basal

–Glomerulopatía del trasplante

–GMN con depósitos densos (MC tipo II)

–Acúmulos incipientes

(amiloide, fibrilar, IgA, cadenas ligeras)

INDICACIONES M.E.

Patología no tumoral

• Biopsia renal: M.E. Aconsejable

–Casos sin glomérulos en IF

–Confirmación glomerulonefritis

–Estadificación nefropatía lúpica

–Patología del trasplante

NEFROPATIA DE CAMBIOS MÍNIMOS

ALPORT HEMATURIA FAMILIAR

GLOMERULOPATIA DEL TRASPLANTE

GLOMERULONEFRITIS CON DEPÓSITOS DENSOS

INDICACIONES M.E.

Patología no tumoral

• Biopsia de piel

–Enfermedades ampollosas

–Enfermedades de la colágena

– Ictiosis

–CADASIL

EPIDERMOLISIS BULLOSA SIMPLEX

EPIDERMOLISIS BULLOSA ATRÓFICA

EPIDERMOLISIS BULLOSA DISTRÓFICA

EPIDERMOLISIS BULLOSA DISTRÓFICA

INDICACIONES M.E.

Patología no tumoral

• Enfermedades de depósito:

alteraciones lisosomales

–Lipoidosis y lipoproteinosis

–Mucopolisacaridosis

–Glucogenosis

ENFERMEDAD DE FABRY

Biopsia Muscular

INDICACIONES M.E.

Patología no tumoral

DISTROFIA MUSCULAR OCULOFARINGEA

DISTROFIA MUSCULAR OCULOFARINGEA

MIOSITIS CON CUERPOS DE INCLUSION

MIOPATIA MITOCONDRIAL

MIOPATIA MITOCONDRIAL

MIOPATIA MITOCONDRIAL

0º 40º

INDICACIONES M.E.

Patología no tumoral

• INFECCIONES

–Protozoos: Toxoplasma

Criptosporidio

Leishmania

–Bacterias: Angiomatosis bacilar

Enf. de Whipple

Espiroquetosis intestinal

–Virus: CMV, Herpes, HIV, LMP, PES

ABSCESO CEREBRAL

TOXOPLASMA GONDII

CRIPTOSPORIDIO

ANGIOMATOSIS BACILAR

VIRUS HERPES

INCLUSION TUBULAR: CA. BRONQUIOLOALVEOLAR

INDICACIONES M.E.

Patología tumoral I

• Carcinoma/ melanoma/ sarcoma

• Adenocarcinoma/ mesotelioma

• Tumores de células pequeñas

• Tumores de tejidos blandos

• Tumores de mediastino anterior

INDICACIONES M.E.

Patología tumoral II

• Sistema nervioso y meninges

• Tumores endocrinos

• Tumores renales

• Metástasis de origen desconocido

• Lesiones raras

LIMITACIONES DE LA M.E.

• No reconoce tumor

• No distingue benigno de maligno

• Puede identificar rasgos muy

escasos dispersos en el tumor

ADENOCARCINOMA

MESOTELIOMA

CA. LOBULILLAR DE MAMA

DIFERENCIACION ENDOTELIAL

DESMOSOMAS

CARCINOMA RENAL CROMÓFOBO

ZIMÓGENO

NORADRENALINA

Melan A

MELANOSOMA

MELANOSOMA

T. CÉLULAS PEQUEÑAS

T. CÉL. PEQUEÑAS: NEUROBLASTOMA

T. CÉL. PEQUEÑAS: RABDOMIOSARCOMA

Muchas gracias