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Universidade  Estadual  do  Ceará  Faculdade  de  Veterinária  Programa  de  Pós-­‐Graduação  em  Ciências  Veterinárias  Biotécnicas  Aplicadas  à  Reprodução  de  Fêmeas  Caprinas  e  Ovinas  

Transgênese  

Vicente  José  de  F.  Freitas  Laboratório  de  Fisiologia  e  Controle  da  Reprodução  www.uece.br/lfcr  

Plano  de  Aula  

• Apresentar  conceitos.  

• A  transgênese  em  pequenos  ruminantes:  •  Princípios.  •  Métodos.  

• Discu;r  os  principais  entraves.  

• Considerações  finais.  

Ø Animais  ou  plantas  

•  Adição,  troca  ou  ina;vação  de  um  determinado  gene.  

•  Maioria  das  vezes:  OGMs  são  organismos  transgênicos.  

Ø  Transgênese  animal  

Ø  Possibilidades  sem  precedentes  

Ø  Limitações  é;cas  e  legais  

•  Legalização  junto  aos  orgãos  competentes  

•  Brasil  ⇒  CTNBio    

•  CQB  (Cer;ficado  de  Qualidade  em  Biossegurança)  

Transgênese  

Aplicações  da  transgênese  

Salmão  (Salmo  salar)  transgênico  para  GH:  Precoce  para  abate  Aqua  Bounty  Technologies  

Ø Peixes  transgênicos  com  fins  comerciais  

GloFish  com  fluorescência  vermelha:    PET  nos  EUA  

Aplicações  da  transgênese  

Camundongo  transgênico  para  estudo  de  hipertrofia  cardíaca    (Dr.  João  Bosco  Pesquero  -­‐  UNIFESP).  

Ø Camundongos   transgênicos   como   modelo   de   estudo   de  funções  gênicas  e  doenças  humanas  

Aplicações  da  transgênese  

Ø Suínos   transgênicos   para   produção   de   órgãos  “humanizados”  para  uso  em  xenotransplantes.  

Aplicações  da  transgênese  Ø Caprinos   transgênicos   para   produção   de   proteínas  recombinantes  no  leite.  

Lizosima  humana    (Dr.  James  Murray  -­‐  EUA).  

Proteína  da  teia  de  aranha  (Nexia  Biotechnologies  -­‐  Canadá)  (Universidade  de  Wyoming  -­‐  EUA).  

Aplicações  da  transgênese  

•  1º   medicamento   aprovado   para   uso   humano   a   par;r   do   leite   de  animais  transgênicos.  

•  Prevenção  de  eventos   trombo-­‐embólicos  em  cirurgias  e  no  periparto  de  pacientes  com  deficiência  hereditária  de  an;-­‐trombina.      

An;-­‐trombina  III  humana    GTC  Biotechnologies  è  rEVO  

Por  que  a  produção  em  animais?  

Houdebine,  2008  

Aspectos   Bactéria   Levedura   Cél.  de  inseto  +  baculovirus  

Cél.  CHO  

Plantas  transgênicas  

Animais  transgênicos  

Nível  de  Produção  

++(+)   ++(+)   +   +   ++   ++++  

Custo  de  Produção  

+++++   +++++   ++   ++   +++++   ++++  

Scaling  up   +++++   +++++   ++   +   +++++   ++++  

Processamento    pós-­‐traducional  

+   ++   +++   ++++   +++   ++++  

Glicosilação   +   ++   +++   ++++   ++   ++++  

Propriedade  Intelectual  

++++   +++   +++   ++   +++   +++  

Produtos  no  mercado  

++++   +++   +++   +++++   +   +++  

Por  que  a  produção  em  animais?  

Houdebine,  2008  

Fucose  

Galactose  

Ác.  Siálico  

Glic-­‐Nac  

Manose  

Xilose  

Bactérias

Insetos

Plantas Mamíferos

Proteína  

Qual  espécie  escolher?  •  1  L  de  leite/lactação  

•   5  a  8  lactações/ano  

•   1ª  lactação:  6  meses  

•  8.000  L  de  leite/lactação  

•   1  lactação/ano  

•   1ª  lactação:  2,5  anos  

•  800  L  de  leite/lactação  

•   1  lactação/ano  

•   1ª  lactação:  1  ano  

Transgênese  na  espécie  caprina  

Ø Principais  caracterís;cas:  

•  Boa  ap;dão  leiteira  

•  Gestação:  5  meses  

•  #  prolificidade  (cabritos/parto)  

•  $  custo  de  manutenção  

•  #  eficiência  na  microinjeção  de  DNA  (x  bovinos)    

Métodos  para  obtenção  

•  Métodos clássicos: •  Microinjeção pronuclear

•  Produção de zigotos (in vivo ou in vitro)

•  Transferência nuclear de células somáticas (TNCS)

•  Métodos alternativos: •  Transferência de genes mediada por espermatozoides.

Microinjeção  pronuclear  

Microinjeção  da  construção  de  DNA  

Purificação  

Fundadores  

Leite  

Rebanho  transgênico  

Medicamento  

Transferência  para    receptoras  

Doadora  de  embrião  pronuclear  

Microinjeção  de  embriões  prónucleares  colhidos  de  cabras  Canindé  (a)  ou  Saanen  (b).  

Doadora  de  embrião  pronuclear  

Efeito  da  raça  da  doadora  sobre  a  qualidade  da  microinjeção.  

Doadora  de  embrião  pronuclear  

Diagnós;co   de   prenhez,   sobrevivência   embrionária   e   parto   em   receptoras   de  embriões  colhidos  de  cabras  Canindé  e  Saanen.  

Estudos  nos  fundadores  e  geração  F1  

Estudos  nos  fundadores  e  geração  F1  

Dia  -­‐20   Dia  0  

Dinâmica  do  hG-­‐CSF  no  leite  de  cabra  transgênica  durante  a  lactação  induzida.      

Mean    690  μg/ml  

Estudos  nos  fundadores  e  geração  F1  

Teste   de   formação   de   colônia   de   granulócitos.   Controle   nega;vo   (leite   de   cabra   não  transgênica),  o  leite  de  cabra  transgênica  (contendo  50,  100  e  200  ng/ml  de  hG-­‐CSF)  e  o  controle  posi;vo  (hG-­‐CSF  recombinante;  Filgras;m,  50  ng  ml).  

Estudos  nos  fundadores  e  geração  F1  

Prenhezes   Descendentes   Descendentes  por  sexo  (%)a  

Taxa  de  transgênicos  (%)b  

Total  

M   F   M   F  

10M   7   11   6  (54,5)   5  (45,5)   3  (50,0)   3  (50,0)   6  (54,4)  

12F   5   8   4  (50,0)   4  (50,0)   2  (66,7)   1  (33,3)   3  (37,5)  

Total   12   19   10  (52,6)   9  (47,4)   5  (55,6)   4  (44,4)   9  (47,4)  

Transmissão  do  transgene    à  descendencia  das  duas  linhagens  de  caprinos  transgênicos.    

Considerações  •  A   produção   de   proteínas   recombinantes   no   leite   de  pequenos   ruminantes   transgênicos   está   aos   poucos  tornando-­‐se  uma  realidade  industrial.  

•  A   dificuldade   técnica   e   o   custo   da   transgênese   em  animais   domés;cos   são   as   principais   causas   de   sua  len;dão  de  aplicação  prá;ca.  

•  É   necessário   o   desenvolvimento   de   métodos   mais  eficientes  para  melhorar  o  sucesso  da  técnica.