2009 Convegno Malattie Rare Parodi [23 01]

La sierologia delle malattie La sierologia delle malattie bollose autoimmunibollose autoimmuni

Aurora Parodi, Emanuele Cozzani, Massimo Drosera

Di.S.E.M. Sezione di DermatologiaUniversità di Genova

Le malattie bollose autoimmuni hanno in comune il meccanismo patogenetico, il legame, cioè,

degli auto-anticorpi a specifiche degli auto-anticorpi a specifiche molecole di adesione tra

cheratinocita e cheratinocita e tra l’epidermide e il derma

Strutture di adesione intercellulari e Strutture di adesione intercellulari e della giunzione dermodella giunzione dermo--epidermicaepidermica

J.Cell.Mol.Med 2007

DIAGNOSI:DIAGNOSI:

�Clinica (eterogenea)

�Istologia (livello del distacco)�Istologia (livello del distacco)

�Immunopatologia (diretta ed indiretta)

DIAGNOSI: 4 GruppiDIAGNOSI: 4 Gruppi

�Pemfigo�Pemfigoidi�Pemfigoidi�Epidermolisi bollosa acquisita�Dermatite erpetiforme di Duhring

METODICHE SIEROLOGICHE:METODICHE SIEROLOGICHE:

�IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA

�ELISA

�IMMUNOBLOTTING �IMMUNOBLOTTING

�IMMUNOPRECIPITAZIONE

�IMMUNOMICROSCOPIA ELETTRONICA

L’IMMUNOFLUORESCENZA L’IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTAINDIRETTA

Utilizza come substrato la cute umana normale, l’esofago di scimmia, normale, l’esofago di scimmia,

e, meno frequentemente, l’esofago di cavia e la vescica di ratto

L’IMMUNOFLUORESCENZA L’IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTAINDIRETTA

Per le malattie della giunzione si può utilizzare la metodica della cute

“split”, con la quale si può avere non solo un aumento della sensibilità in solo un aumento della sensibilità in

quanto i siti antigenici sono più esposti, ma anche si può avere idea su quale

versante della giunzione dermo-epidermica si legano gli

anticorpi

ELISA, IMMUNOBLOTTING, ELISA, IMMUNOBLOTTING, IMMUNOPRECIPITAZIONEIMMUNOPRECIPITAZIONE

Con l’IFI non si ha l’identificazione degli antigeni target degli

autoanticorpi che invece è necessaria per la diagnosi corretta, e allora, la per la diagnosi corretta, e allora, la caratterizzazione della specificità

molecolare dei targets antigenici si ha con l’utilizzo di metodiche quali

l’ELISA, l’Immunoblotting e l’Immunoprecipitazione

ELISA: vantaggi

• molto sensibile

• rapida e di facile esecuzione

• misura il titolo anticorpale in maniera più precisa dell’ IFI e capace di monitorare la malattiadell’ IFI e capace di monitorare la malattia

Svantaggi:

• restrittiva in quanto non permette la valutazione di altre possibili reattività

Immunoblotting: vantaggi

• metodica estremamente specifica

• elevata sensibilità per la Dsg3 (75-90%)

• rompendo completamente le interazioni proteiche permette l’identificazione del singolo antigene proteiche permette l’identificazione del singolo antigene

• identificando l’antigene target permette una diagnosi di precisione

• metodica complementare all’IFI aumentando la percentuale diagnostica

Immunoblotting: svantaggi

• metodica non indicata per lo studio di complessi proteici a conformazione tridimensionale come la desmogleina 1

• metodica di esecuzione complessa da considerasi di secondo livello non sempre considerasi di secondo livello non sempre realizzabile in tutti i laboratori

• non permette il monitoraggio della malattia non essendoci una relazione tra gravità della malattia, titolo anticorpale in IFI e intensità della banda

• elevata sensibilità ma non in tutti i casi

Immunoprecipitazione: vantaggi

• metodica che preserva la conformazione tridimensionale dell’antigene

•particolarmente adatta per lo studio delle desmogleine e delle desmocollinedesmogleine e delle desmocolline

•elevata specificità e sensibilità

•attualmente è la metodica di riferimento per la diagnosi del PPN

Immunoprecipitazione: svantaggi

• ridotta solubilità delle interazioni proteina-proteina per cui a volte viene riconosciuto il complesso proteico e non il singolo antigene (subunità αβγαβγαβγαβγ laminina 5)(subunità αβγαβγαβγαβγ laminina 5)

• poco adatta allo studio delle IgA, rimane limitata alle malattie IgG mediate

• metodica complessa e costosa

• contatto con isotopi radiattivi

PEMFIGOPEMFIGO

PEMFIGOPEMFIGO

P. volgareP. superficialeP. erpetiformeP. erpetiforme

P. farmaco indottoP. paraneoplastico

P. a IgA

Strutture di adesione intercellulari e Strutture di adesione intercellulari e della giunzione dermodella giunzione dermo--epidermicaepidermica

IFI su tessuti epiteliali pluristratificati

(esofago di scimmia)

P. volgareP. superficiale

• anticorpi della classe IgG diretti verso la membrana cheratinocitaria

P. superficialeP. farmaco indottoP. erpetiformeP. paraneoplastico

IFI su tessuti epiteliali di transizione (vescica di ratto):

• anticorpi della classe IgG diretti verso la membrana cheratinocitaria

• Pemfigo paraneoplastico

Deposito alla membrana cheratinocitariaDeposito alla membrana cheratinocitaria

Desmogleina 3 : P. volgare mucoso puro

Desmogleina 1 e 3: P. volgare muco-cutaneo,P. erpetiforme

Desmogleina 1: P. superficiale

Desmocollina I/II: P. IgADesmocollina I/II: P. IgA

Envoplachina

Periplachina P. paraneoplastico

Desmoplachina I/II

Immunoblotting con estratto di cheratinociti

160

130

160

ELISA:

per la diagnosi indiretta del pemfigo: disponibili 2 ELISA per la Dsg1 e 3

Immunoprecipitazione:

utile soprattutto per confermare le reattività multiple in immunoblotting nella diagnosi del pemfigo paraneoplastico

Desmoplachina I

BPAgIBPAgI

Desmoplachina II

Periplachina

Envoplachina

PEMFIGOIDEPEMFIGOIDE

PEMFIGOIDEPEMFIGOIDE

P. bolloso di LeverP. della gravidanzaP. della gravidanzaP. delle mucoseP. anti p-200

Dermatite a IgA lineari

Strutture di adesione Strutture di adesione della giunzione dermodella giunzione dermo--epidermicaepidermica

IFI su tessuti epiteliali pluristratificati (cute umana normale, esofago di scimmia)

• anticorpi della classe IgG diretti verso la membrana basale

Pemfigoide

Pemfigoide delle mucose

Deposito alla membrana basale

Pemfigoide delle mucose

Epidermolisi bollosa acquisita

IFI su cute separata in NaCl (split):

Immunofluorescenza indiretta su cute “ split “:

• sensibilità del 50-80%

Deposito lineare alla giunzione dermo epidermica al tetto della bolla

• Antigene di 230 kDa:

Pemfigoide bolloso

(Pemfigo paraneoplastico)

• Antigene di 180 kDa:

Pemfigoide bolloso, delle mucose e della gravidanza

con le IgA: dermatite IgA lineari

Deposito lineare alla giunzione dermo-epidermica, al pavimento della bolla

Antigene di 290 kDa: EBA

Antigene 200-165 kDa (αααα3 lamina 5) : PM

Antigene 140 kDa (ββββ2 laminina 5): PM

Antigene 150 kDa (γγγγ2 laminina 5): PM

Antigene 200 kDa: PB

Deposito lineare alla giunzione dermo-epidermica

al tetto e al pavimento della bolla

• Antigene di 180 kDa:

Pemfigoide delle mucose

ELISA:

per la diagnosi indiretta del pemfigoide: disponibili 2 ELISA per l’antigene di 180 e 230 kDa

Immunoblotting con estratto epidermico

EPIDERMOLISI BOLLOSA EPIDERMOLISI BOLLOSA ACQUISITAACQUISITA

Deposito lineare alla giunzione dermo-epidermica,

al pavimento della bolla

Antigene di 290 kDa: EBA

Immunoblotting con estratto di derma:

• anticorpi classe IgG diretti verso l’antigene di 290 kDa (collagene VII)

• EBA

DERMATITE ERPETIFORME DERMATITE ERPETIFORME DI DUHRINGDI DUHRING

DERMATITE ERPETIFORME DERMATITE ERPETIFORME DI DUHRINGDI DUHRING

DERMATITE ERPETIFORME DERMATITE ERPETIFORME DI DUHRINGDI DUHRING

ELISA: anticorpi anti-transglutaminasi

Immunomicroscopia elettronica indiretta:

• utile soprattutto per valutare la sede degli immunodepositi

• metodica poco utilizzata nella pratica clinica

Percorso diagnostico

Anamnesi/Clinica

Istologia/Immunofluorescenza direttaIstologia/Immunofluorescenza diretta

Immunofluorescenza indiretta

ELISA/Immunoblotting

Immunoprecipitazione