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PATOLOGIE DEI PATOLOGIE DEI MITOCONDRIMITOCONDRI
MITOCONDRI: : fosforilazione ossidativa ossidativa
III
IIISpazio
intermembrana
Matrice NADHNAD
H+
succinatofumarato
H+
IVCoQ
Cytc
O2 2H2O
H+
V
ATP
H+
ADP+Pi
COMPLESSO I:NADH deidrogenasi39 polipeptidi 7 polipeptidi mitocondriali
COMPLESSO II:SUCCINATO DEIDROGENASI4 polipeptidi nucleari
COMPLESSO III: CITOCROMO C REDUTTASI10 polipeptidi 1 polipeptide mitocondriale (citocromo b)
COMPLESSO IV:CITOCROMO C OSSIDASI10 polipeptidi 3 polipeptidi mitocondriali
COMPLESSO V:ATP SINTASI14 polipeptidi 2 polipeptidi mitocondriali (ATPasi 6 - 8)
H+ H+ H+H+ H+H+
Caratteristiche mtDNA Singolo anello a doppia elica di 16.569 bp
2 - 10 copie mtDNA/mitocondrio 103 - 104 copie mtDNA/cellula
• 37 geni: 24 RNA per la sintesi proteica
• 22 tRNA• 2 rRNA (12S e 16S)
13 mRNA x polipeptidi, • subunità enzimatiche della
catena respiratoria• regolazione della
fosforilazione ossidativa
• Le polimerasi sono codificate dal DNA nucleare
Mappa del mtDNA
Replicazione bidirezionale ed asincrona
COMPLESSO III - citocromo C reduttasi (citocromo b)COMPLESSO IV - citocromo C ossidasiCOMPLESSO V - ATP sintasi
rRNA (12S e 16S)
37 geniPH
PL
ND1
ND2
ND3
ND4L
ND4
ND5
ND6
ATP6, ATP8
COI
COIII
D-Loop
OL
OH
COII
OH - origine di reolicazione strand H(senso orario)
OL - origine di replicazione strand L(senso anti orario)
D-Loop : regione di controllocontenente 2 promotori
COMPLESSO I - NADH deidrogenasi
Geni del mtDNA• Polipeptidi di NADH deidrogenasi (7)• Polipeptide di citocromo C reduttasi (1)• Polipeptidi di citocromo C ossidasi (3)• Polipeptidi dell’ATP sintasi (2)• rRNA dei ribosomi mitocondriali (2)• tRNA transfer-RNA mitocondriali (22)Mutazioni del mtDNA possono manifestarsi Mutazioni del mtDNA possono manifestarsi
in malattie correlate con la deficienza di in malattie correlate con la deficienza di ATP con sintomi relativi ai distretti ATP con sintomi relativi ai distretti
maggiormente colpitimaggiormente colpiti
Formazione di radicali liberi ed alterazioni mitocondriali
• Il trasporto mitocondriale di elettroni non è perfetto.
• Anche in condizioni ideali, alcuni elettroni vengono “persi” dalla catena respiratoria ed interagiscono con l’ossigeno per formare radicali superossido.
• In caso di alterazioni mitocondriali, questo fenomeno aumenta.
• La vicinanza del DNAmt al flusso di radicali superossido (o idrossilici) e la sua mancanza di protezioni e di meccanismi di riparazione, porta ad aumento dei fenomeni di mutazioni e delezioni.
“Invecchiamento” mitocondriale
• Il fenomeno di “invecchiamento” mitocondriale, con conseguente danno della funzione, è stato proposto come causa di:
• 1) stress da radicali liberi, • 2) malattie degenerative, • 3) malattie metaboliche (diabete
mellito),• 3) alterazioni legate alla vecchiaia.
Caratteristiche mtDNAEntrambi i filamenti del mtDNA sono trascritti e generano lunghi POLICISTRONI che sono processati per il rilascio di:
tRNArRNAmRNA
MUTAZIONI FREQUENTI > DNA NUCLEARE):- mancanza di ISTONI- mancanza di meccanismi di riparo- danno da radicali liberi
• Replicazione asincrona ed indipendente del mtDNA / DNA nucleare• Distribuzione non omogenea del numero delle molecole di mtDNA nelle cellule figlie• Mancanza di ricombinazione tra molecole di mtDNA• Nuovi alleli --> mutazioni spontanee
Genetica mitocondriale• Le proteine mitocondriali derivano per la maggior
parte da geni del DNA nucleare (nDNAnDNA) e solo in piccola parte dal DNA mitocondriale (mtDNAmtDNA)
• I mitocondri di un organismo derivano dalla cellula uovo: pertanto, il mtDNA è da considerarsi esclusivamente materno
• Al contrario delle proteine codificate dal nDNA, non seguono le regole della genetica mendeliana
• I mitocondri costituiscono una popolazione disomogenea che si può distribuire in maniera disomogenea nelle cellule figlie, dando luogo a mosaicismo mitocondrialemosaicismo mitocondriale.
Patologia genetica mitocondrialeALTERAZIONI --> ampio spettro di patologie molecolari mitocondriali
MUTAZIONI DEL mtDNA
A) RIARRANGIAMENTI
B) MUTAZIONI PUNTIFORMI
C) MUTAZIONI PUNTIFORMI dei popolipeptidi della OXPHOS
Mutazioni:Germinali (eredità materna)Somatiche (casi sporadici di malattia)
MUTAZIONI DEL nDNA (tratto mendeliano)
A) MUTAZIONI Missense / delezioni di geni dei complessi OXPHOSB) MUTAZIONI Missense / delezioni geni di altre proteine mtC) DESTABILIZZAZIONE DEL mt DNA
Delezioni Duplicazioni
tRNAdifetti sintesi proteica
rRNA
difetti sintesi proteica
• MonogenicheMonogeniche:– Neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON)– Sindrome di Leigh, sindrome NARP – MELAS: encefalopatia mitocondriale, acidosi lattica, episodi tipo-
ictus – MERRF: epilessia mioclonica e miopatia a fibre ragged-red – Cardiomiopatie e miopatie ereditarie per via materna– Oftalmoplegia isolata– Sordità indotta da aminoglicosidi – Resistenza al cloramfenicolo
• PoligenichePoligeniche:– Sindrome di Pearson – Sindrome di Kearns-Sayre – Diarrea cronica neonatale + atrofia dei villi
Malattie genetiche del mtDNA
• Esempi di funzioni molto sensibiliEsempi di funzioni molto sensibili (sono inibite al 50-60% del normale CE):– Contrazione muscolare intensa e continua– Conduzione nervosa– Contrazione cardiaca– Aggregazione piastrinica– Alcune secrezioni endocrine ed esocrine
• Esempi di funzioni poco sensibiliEsempi di funzioni poco sensibili (al 10-15% del normale CE non sono ancora inibite):
– Alcune forme di trasporto ionico (ATP-asi citosol: pompa Na/K, pompe del Ca++)
– Trasportatori ABC (es. canale per il cloro della fibrosi cistica)
Le funzioni cellulari sono variamente sensibili alla
diminuzione del carico energetico (CE)
Un numero critico di DNAmt mutato deve essere presente perché si manifestino disfunzioni tessutali e segni clinici apparenti.
La proporzione di DNAmt mutato necessaria perchè si manifesti un fenotipo patologico varia a seconda di individui, organi e tessuti.
Tessuti con elevata richiesta di energia, come muscoli e cervello hanno una soglia di sensibilità relativamente bassa e sono particolarmente vulnerabili alle mutazioni di DNAmt.
La maggior parte dei disordini dei mitocondri si presentano come encefalomiopatie che interessano principalmente i tessuti muscolari e nervosi.
EFFETTO SOGLIA
Malattie e sintomi a livello di organi e tessuti
dipendenti da alterazioni del mtDNA
• Cuore: cardiomiopatie e difetti di conduzione• Muscolo scheletrico: miopatia• Disordini neurologici e psichiatrici• Occhio: retinopatie, cataratta, neurite ottica• Sordità• Endocrine: diabete mellito, bassa statura,
ipoparatiroidismo • Rene: disfunzione nefrone prossimale,
glomerulopatia• Epatopatia, disfunzione pancreas esocrino• Pancitopenia• Aggregazione piastrinica
Manifestazioni sistemiche delle Malattie
mitocondriali (mtDNA)
• I disordini mitocondriali si possono presentare con una varietà di segni clinici e sintomi che riguardano multipli organi e sistemi.
• Quando si presenta una patologia che riguarda tre o più organi, è lecito pensare ad una malattia mitocondriale.
• Sintomi che possono associarsi comunemente sono: ictus, epilessia, marcata astenia, sordità, neuropatia periferica.
Sintomi delle Malattie mitocondriali (mtDNA)
• I disordini mitocondriali possono essere causati da una mutazione di DNA nucleare o DNA mitocondrale.
• Una classificazione su base molecolare è assai difficile, resa più complessa dalla scarsa correlazione tra genotipo e fenotipo.
• Ad es. individui con oflamoplegia esterna clinicamente comparabile possono avere una larga delezione o una mutazione puntiforme (es. A3243G) di DNAmt o una mutazione di DNA nucleare (es. di Ant 1) che causa secondarie anomalie di DNAmt.
• Inoltre la stessa mutazione genetica può causare sindromi cliniche diverse.
Cause delle Malattie mitocondriali (mtDNA)
Sindrome di Kearn-Sayre (KSS) e CPEO(Chronic progressive external ophthalmoplegia)
Oftalmoplegia cronica e progressivaPtosiMiopatia mitocondriale (RRF)
Retinite pigmentosaAcidosi latticaPerdita neurosensoriale dell’uditoAtassiaAttacchi epiletticiDemenzaCardiopatia ipertrofica e dilatativaDifetti di conduzione
CPEOdopo i 20 anni
Sindrome di Kearn-Sayre
prima dei 20 anni
Sindrome di Kearn-Sayre (KSS) e CPEO(Chronic progressive external ophthalmoplegia)
Patologie prevalentemente sporadiche
Sindrome di Kearn-Sayre (KSS) e CPEO(Chronic progressive external ophthalmoplegia)
• Oftalmoplegia: paralisi della muscolatura del bulbo oculare che impedisce i movimenti del bulbo stesso, compresi quelli involontari dell'accomodazione
• 83 % di KSS e 47% CPEO ---> riarrangiamenti del mtDNA
• Prevalentemente, ampie delezioni (con o senza duplicazioni)
• La maggior parte sono nuovi casi di mutazioni spontanee e sporadiche insorte in uno stadio precoce di sviluppo (oocita?)
• Costante la ETEROPLASMIA tra mtDNA normale e mtDNA mutato
•Delezioni / duplicazioni Variano da 2 - 8 Kb. Fiancheggiate da sequenze ripetitive•Gli ADULTI affetti presentano:• - mtDNA deleto prevalentemente nel muscolo e nel cervello • - sviluppo di oftalmoplegia esterna progressiva (PEO) o della • sindrome di KEARNS-SAYRE (forma più severa)•I BAMBINI affetti presentano:• - mtDNA deleto ha una distribuzione tissutale estesa• - gravi disordini multistemici (anemia, insufficienza • pancreatica esocrina, diabete mellito, nefropatia, • epatopatia, eczema, altri disordini endocrini)•Malattie associate con delezioni progrediscono con l’età perché aumenta il rapporto mtDNA mutato/ mtDNA normale
Riarrangiamenti del mtDNA
90%
10%
La delezione più frequente è 4997 bp tra due repeats di 13 basi
Delezioni: Delezioni comuni: 4977 paia di basi da 8488 a 13460; 13 paia di basi ripetute al punto di interruzione delle mutazioni La maggior parte delle delezioni preservano i Promotori della trascrizione dei filamenti pesante e leggero Geni dell'RNA ribosomale 12S e 16S
Delezione geni tRNA e proteine della OXPHOS
Riduzione sintesi proteica
Riduzione OXPHOS
Pochi casi di KSS/CPEO dipendono da mutazioni di tRNA mitocondriale
Sindrome di Kearn-Sayre (KSS) e CPEO
Sindrome di Pearson
Anemia, Neutropenia, ed Acidosi lattica Anemia, Neutropenia, ed Acidosi lattica
Patologia prevalentemente sporadica
Disordine multisistemico caratterizzato da:Pancitopenia (midollare)Fibrosi pancreatica ---> diabeteAtrofia splenicainsufficenza epatica e renale
-Colpisce nell’infanzia ed è spesso letale
-Gli individui che sopravvivono progrediscono ---> fenotipo KSS
Sindrome di Pearson
Cause molecolari: difettoso funzionamento dell OXPHOS dovuta a ridotta
attività del COMPLESSO IVarie delezioni: 2461 bp 1036 - 12828
fiancheggiata da sequenze GCCLa delezione/duplicazione del mtDNA è OMOPLASMICA nelle cellule del sangue ------> pancitopeniaDifetto nelle subunità ND3, ND4L, ND4, ND5 del complesso IDifetto nei tRNA (Arg His Ser Leu)
Sindrome di Pearson
MELAS (Mitochondrial encephalomyopathy
lactic acidosis stroke)Mutazioni puntiformi dei tRNA del mtDNA
Malattia neurodegenerativa progressiva caratterizzata da:Episodi ischemici cerebrali prima dei 40 anni (tra 5 e 15)
(da vasculopatia mitocondriale)miopatia mitocondrialeacidosi lattica e/o ragged red fibers
Sintomi associati:affaticabilitàdiabete mellitocardiomiopatiasordità bilateraleretinopatia pigmentosaatassia
Trasmissione materna ma anche forme sporadiche
MELAS (Mitochondrial encephalomyopathy lactic acidosis stroke)
Mutazioni puntiformi dei tRNA del mtDNA
Basi molecolari Mutazioni puntiformi dei tRNA del mtDNA: Mutazioni eteroplasmichetRNALeu(UUR) 3243A --> G loop di diidrouridina:
alterazioni della struttura terziariastabilità del tRNAcapacità di interazione con aa LEUcapacità di assemblaggio tRNA con i ribosomi
RIDUZIONE SINTESI PROTEICA MITOCONDRIALE > 85% mtDNA ---> MELAS 5 - 35% mtDNA ---> diabete mellito di tipo II ad eredità
materna e sorditàtRNALeu(UUR) 3271T --> C nucleotide terminale dell’anticodone: tRNALeu(UUR) 3251A --> G loop di diidrouridinaAltre mutazioni non caratterizzate del mtDNAMutazioni del DNA nucleare
MELAS (Mitochondrial encephalomyopathy lactic acidosis stroke)
MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fiber)
Mutazioni puntiformi dei tRNA del mtDNA:
Encefalomiopatia ad eredità materna• Epilessia mioclonica progressiva• Demenza lentamente progressiva• Miopatia mitocondriale - fibre rosse ruvide (Ragged red fibers)
Le fibre muscolari sono caratterizzate da accumulo di mitocondri sub-sarcolemmali (RRF).
La proliferazione mitocondriale rappresenta, probabilmente, una risposta compensatoria al difetto metabolico della cellula
MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fiber)
Mutazioni puntiformi dei tRNA del mtDNA:
-Sintomi frequentemente associati
- Perdita dell’udito - Atassia
•Comparsa della sintomatologia tra tarda infanzia ed età adulta•Si può verificare la riduzione del metabolismo del SNC attraverso la PET•Positività alla RMN del SNC, con degenerazione dei nuclei della base•Mutazione eteroplasmica: variabilità individuale
MERRF(Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fiber)
Mutazioni puntiformi dei tRNA del mtDNA:
tRNALys 8344A --> G nel Tloop: nucleotide molto conservatomut. 80-100% presente
funzionalmente recessiva, alterata interazione con il ribosoma sintesi proteica funzionalità dei complessi I e IV
tRNALys 8356T --> C stem Tloop: - nucleotide molto conservatomut. meno frequente
funzionalmente recessiva, sintesi proteica
8356
8344
MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fiber)
S. DI LEIGH:
Sindrome di LEIGH e NARPSindrome di LEIGH e NARP(Neurogenic muscle weakness, Ataxia, Retinite
Pigmentosa)
S. DI LEIGH: patologia prevalentemente ereditaria (mutazioni di nDNA e mtDNA)encefalomiopatia subacuta necrotizzante con esordio
intorno a 1,5 anni con exitus intorno ai 5 anni clinica: Miopatia neurogena
Atassia NARPRetinite Pigmentosa
atrofia otticaoftalmoplegiadifetti respiratorinistagmoipotoniaritardi di sviluppo
Il quadro clinico-metabolico è caratteristicamente precipitato dalle infezioni
necrosi dei gangli della base ed angiopatia
Sindrome di LEIGH e NARPSindrome di LEIGH e NARP(Neurogenic muscle weakness, Ataxia, Retinite
Pigmentosa)
Mutazioni puntiformi del mtDNA più frequenti:MTATP6*NARP - T8993---> Leu 156 ---> ArgMTATP6*FBSN - 9176 ---> Leu 217 ---> Pro
blocco traslocazione dei protoni - canale complesso V
Trasmissione materna con costante ETEROPLASMIA: correlazione tra i livelli di mtDNA mutato e severità dei sintomi
Alti livelli >95%: severa S. di Leigh con insorgenza infantileBassi livelli <75% NARP con insorgenza più tardiva
8933
Sindrome di LEIGH e NARP
8993
alterazione della ATP sintasi
• Neuropatia ottica di Leber Neuropatia ottica di Leber (LHON)(LHON)
• Patologia prevalentemente ereditaria (mutazioni puntiformi del mtDNA)• Neuropatia ottica ad esordio acuto con perdita progressiva, rapida e bilaterale della vista (cecità completa) tra adolescenza e età adulta (20-24 anni), per degenerazione del nervo ottico.• Vasculopatia retinica associata (microangiopatia e teleangectasia)• Frequenti le disritmie cardiache; assenza di miopatia• Trasmissione tipicamente materna • 80% degli individui affetti sono di sesso maschile.
• Nonostante l’OMOPLASMIA delle mutazioni sia evidenziabile nei PBL dei pazienti, la presentazione clinica è di solito confinata alla retinopatia con penetranza ed espressività delle mutazioni molto variabili ---> multifattorialità?
14% casi sporadici --> ETEROPLASMIA FAMILIARE % mtDNA mutato --> generazione successiva --> OMOPLASMIA
Neuropatia ottica di Leber Neuropatia ottica di Leber (LHON)(LHON)
Neuropatia ottica e cecità in età più precoce Distonia: insorgenza precoce di disordini
generalizzati del movimentoalterazioni della parolaritardo mentalebassa staturadegenerazione dei gangli della base (frequente)
LHON - DISTONIALHON - DISTONIA
Basi molecolari e Fisiopatologia
- 18 mutazioni puntiformi del mtDNA codificante per le proteine del COMPLESSO I (NADH deidrogenasi) (90% dei casi)
- Bassa efficienza di fosforilazione ossidativa (OXPHOS)
- Deficit di ATP per neuroni nervo ottico che giungono a morte
apertura canale mtPTP ---> apoptosi- inoltre ROS
inibizione rilascio di NO --> vasocostrizione e vasculopatia
- Sono state riscontrate anche nuove mutazioni “primarie” sul mtDNA del Complesso IV subunità III: citocromo C ossidasi- e MUTAZIONI SECONDARIE: associate alle mutazioni primarie:
azione sinergistica
Neuropatia ottica di Leber Neuropatia ottica di Leber (LHON)(LHON)
Neuropatia ottica di Leber (LHON)
• 1. MTND4*LHON - G11778A ---> Arg 340 ---> Hys (subunità ND4)• più frequente penetranza variabile e alcuni fenotipi normali• 2. MTND1*LHON - G3460A ---> Ala 52 --> Thr (subunità ND1)• seconda per patogenicità• 3. MTND6*LHON - A14484C ---> Met 64 --> Val • (dominio altamente conservato del gene ND6)• più benigna talvolta recupero della visione • 4. MTND6*LDYT- A14459G ---> Ala 72 --> Val (subunità ND6)• più frequentemente eteroplasmica più patogenetica, associata a distonia
11778
34601448414459
alterazione dellaNADH deidrogenasi
1.Maternally inherited diabetes mellitus and deafnessè una rara forma ereditaria
2. Circa il 6% di oftalmoplegia, ptosi e miopatia mitocondriale sono trasmesse con tratto autosomico dominante (AD-PEO)
I pazienti hanno molteplici riarrangiamenti del mtDNA la cui stabilità è evidentemente compromessa dall’alterazione di uno/più geni nucleari
Riarrangiamenti del mtDNA:FORME ALTERNATIVE
Altre malattie associate ad anomalie del DNA mitocondriale
Malattie neurodegenerative, diabete mellito, cardiomiopatie, sordità, demenza, AlzheimerCAUSE: predisposizione genetica, formazione di radicali liberi,Declino della OXPHOS legato all’etàMutazioni somatiche del mtDNA ---> tessuti postmitotici ad alta richiesta di
ATP (muscolo e cervello)
Es. Delezione 4977 (5 Kb) si accumula nei gangli basali e in varie regioni corticali del cervello dopo i 75
Dannoossidativo
Morbo di ParkinsonI mitocondri di questi pazienti spesso mostrano delle
alterazioni. La più caratterizzata consiste in un difetto di attività
della NADH deidrogenasi (complesso I) nel cervello, muscoli e piastrine.
Questa alterazione porta ad una diminuita produzione di ATP, aumentata “perdita” di elettroni ed aumentata produzione di radicali superossido (aumento dello stress ossidativo)
Altre molecole• Cardiolipina ed Acetil-L-carnitina
• Uno dei componenti mitocondriali implicato nell’invecchiamento dei mitocondri è la cardiolipina, un fosfolipide della membrana interna che fornisce un supporto strutturale alla catena di traporto degli elettroni.
• La carnitina è necessaria per trasportare acidi grassi che servono come combustibile e per la produzione della cardiolipina, all’interno dei mtocondri.
• I livelli di cardiolipina e l’efficienza mitocondriale diminuisconi con l’età, ma vengono ristimolati dalla somministrazione di Acetil-L-carnitina
Altre molecole
• Coenzima Q (ubiquinone)
• è una molecola probabilmente mobile critica per il trasporto di elettroni dal complesso I e II al III.
• La sua deficienza è associata a cardiomiopatia.
Altre molecole• Acido lipoico
• L’Acido lipoico è strettamente associato, come cofattore degli enzimi del ciclo dell’acido citrico che generano NADH, come anche la tiamina difosfato (derivato della vit B1) e FAD (derivato di riboflavina).
• Inoltre l’acido lipoico è un potente antiossidante che agisce come scavenger di radicali liberi, completando l’azione di altri antiossidanti come vit C ed E.
Threshold hypothesisOXPHOS Capacity vs. mtDNA DamageOXPHOS Capacity vs. mtDNA Damage
TumoriMutazioni somatiche del mtDNA identificate in
tumori- delezioni intragenetiche
missense- mutazioni puntiformi nonsense
frameshiftEffetti:
Queste mutazioni potrebbero contribuire alla trasformazione neoplastica modificando le capacità energetiche della cellula, aumentandone lo stress ossidativo mitocondriale e/o modulando l’apoptosi
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