Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet

Biotecnología para hacer frente al cambio climático: la búsqueda

de variedades tolerantes a sequía, frío y salinidad,

Barcelona 16-11-2011José Miguel Mulet

¿Que es el estrés para una planta?

•• Es Es difdifíícilcil de de definirdefinir a a nivelnivel general, general, puestopuesto queque lo lo queque puedepuede resultarresultar estrestrééss parapara unauna plantaplanta parapara otraotra puedepuede queque no lo sea.no lo sea.

•• UnaUna definicidefinicióónn parapara salirsalir del del pasopaso de de estrestrééss biolbiolóógicogico serserííaa: : ““factor o factor o condicicondicióónn adversaadversa queque inhibeinhibe el el funcionamientofuncionamiento normal de un normal de un sistemasistema biolbiolóógicogico ((plantaplanta))””

¿Por qué nos estresa que las plantas se estresen?

• La población mundial es de 7.000 millones y creciendo.• El estrés abiótico es el mayor factor limitante para la

productividad agrícola.• El estrés abiótico produce pérdidas de cientos de

millones de euros cada año debido a bajadas de producción o pérdida de cosechas.

• El crecimiento de la población ha acentuado los factores de estrés existentes (básicamente metales pesados y salinidad… quizás cambio climático).

¿Por que nos estresa que las plantas se estresen?

Históricamente la sequía ha sido más definitivo para el fin de una civilización que las guerras o las

epidemias

Existen más casos documentados como la civilización Maya, los indios pueblo,la mesopotamia primitiva o la antigua camboya.

Imágenes tomadas en Tempe (Arizona, USA), que muestran el efecto de vaias décadas de irrigación (Gentileza del Dr. Roberto Gaxiola)

La sequía y la salinidad son problemas actuales tanto en países desarrollados como en países en desarrollo

La Mejora Clásica se ha demostrado muy buena para el aumento de la productividad, pero limitada en tolerancia a condiciones ambientales adversas

Trigo tradicional:Bajo radio grano/paja

Trigo de la revolución verde:Alto radio grano/pajaNorman Borlaug (2009)Premio Nobel de la Paz

La cuestión es: ¿Qué gen elegir para hacer plantas tolerantes?

O dicho de otra manera: ¿Por qué no hay todavía plantas

tolerantes a estrés abiótico en el mercado?

Para aplicar ingeniería genética es preciso conocer el efecto a nivel celular… y elegir

un gen

Estrategias basadas en conocimiento previo

•• GeneticaGenetica reversareversa: : –– PartiendoPartiendo de de datosdatos obtenidosobtenidos del del genomagenoma clonarclonar genes con genes con unauna

funcifuncióónn determinadadeterminada y/oy/o construirconstruir lineaslineas modificandomodificando la la expresiexpresióónn del gen del gen queque nosnos interesainteresa..

•• GenGenóómicamica funcionalfuncional: : –– EstudiarEstudiar queque genes se genes se expresanexpresan o se o se reprimenreprimen en en determinadasdeterminadas

condicionescondiciones de de estrestrééss y a y a partirpartir de de estosestos datosdatos modificarmodificar la la expresiexpresióónn de genes de de genes de relevanciarelevancia..

•• IngenierIngenierííaa GenGenééticatica::–– TransformarTransformar unauna plantaplanta con un gen de con un gen de otrootro organismoorganismo de de

probadaprobada funcionalidadfuncionalidad en en determinadodeterminado estrestrééss..

Así es como representamos una ruta de respuesta

Tolerancia a estrés

Factores negativos

Factorespositivos

Cuello de botella

Unico gen que dará tolerancia por sobrexpresión

Pérdida de Función

redundancia

Pero realmente se parece a esto

Un ejemplo: Optimizar la síntesis de osmolitos para tolerancia a sequía

• La síntesis de osmolitos es una estrategia generalizada para retener el potencial osmótico dentro de la célula.

• El problema es que no es una respuesta conservada, y cada organismo parece que ha encontrado su solución particular… lo que dificulta el diseño de estrategias…

• Las diferentes estrategias han fracasado (incluso después de haber funcionado bien en el laboratorio).

El Yield Penalty, un indeseado efecto secundario

Theor Appl Genet. 2007 Jun;115(1):35-46. Epub 2007 Apr 11.Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions.Xiao B, Huang Y, Tang N, Xiong L.

Un gen puede dar tolerancia por sobreexpresión por:

• Mejorar la respuesta a estrés (señalización).

• Mejorar la respuesta a estrés (defensa).• Ser una diana molecular del estrés.• Regular negativamente un factor negativo.• Ser un factor negativo (la mutación daría

tolerancia).

¿Por qué no cambiamos la estrategia?

•• El El trucotruco eses cambiarcambiar la la afirmaciafirmacióónn: : ““esteeste gen gen queque conozcoconozco funcionarfuncionaráá”” porpor : : ””voyvoy a a buscarbuscar genes genes queque funcionenfuncionen, , aunqueaunque no no los los conozcaconozca””, ergo: , ergo: hacerhacer un un screening.screening.

•• El El problemaproblema eses: : ¿¿CCóómomo??

La levadura como instrumento para buscar genes

Overexpression libraries

Yeast genomic fragments+

Yeast multicopy plasmid

Saccharomyces cerevisiae

Selection for salt toleranceNaCl orLiCl medium

setting energization

ATPADP + Pi

H+

Pma1

K+

Trk1

+++---

Li+, Na+Polyaminesn+

Aminoglycosidesn+

??

?

ΔΨ

K+ starvationNa+ stress

Osmotic stress

Hal4,5 Hal1CN

Acid stress

Alkalinestress

Ppz1.Hal3Glucose metabolism

YCK1,2Ptk2

Plasma membrane

Este sistema nos permitió descifrar la homeostasis de iones en levadura

35S::HAL1 control

10 days with150 mM NaCl

20 days with150 mM NaCl

THE YEAST HAL1 GENE IMPROVES SALT TOLERANCE IN TOMATO(cultivar P73; Gisbert et al., Plant Physiol. 123 (2000) 393- 402; collaboration with the groupof Vicente Moreno)

… and in water melon(Ellul et al., 2003,Theor. Appl. Genet.107: 462-469)

Y también alguna aplicación en plantas

Ya que la levadura funciona muy bien para encontrar genes de

levadura…•• ……PorPor queque no no buscarbuscar genes de genes de plantasplantas??

•• VentajasVentajas::•• Es un Es un procesoproceso rráápidopido y y baratobarato..•• En En pocopoco tiempotiempo se se puedepuede hacerhacer un un escrutinioescrutinio exhaustivoexhaustivo..

•• InconvenientesInconvenientes::•• No No todostodos los los cDNAcDNA se se expresanexpresan bienbien en los en los sistemassistemas

heterheteróólogoslogos ((problemasproblemas con el con el codoncodon usage).usage).•• MuchasMuchas rutasrutas no no estestáánn conservadasconservadas..•• SueleSuele salirsalir un un sesgosesgo haciahacia moleculasmoleculas efectorasefectoras, , pocaspocas

seseññalizadorasalizadoras, y , y poqupoquíísimassimas proteproteíínasnas de de membranamembrana..

La levadura como instrumento para buscar genes

Overexpression libraries

Plant cDNAs+

Yeast multicopy plasmidwith strong promoter

Saccharomyces cerevisiae

Selection for salt toleranceNaCl orLiCl medium

Genes de halotolerancia de la planta modelo Arabidopsis thaliana encontrados por sobreexpresión en levadura(Forment et al., 2002, Plant J. 30:511-519; collaboration with the group of Oscar Vicente )

Name Times isolated Mechanism of action

RCY1 3 K/T-type cyclin fused to an RS-domaintypical of splicing proteins

SRL1 3 RS-domain typical of splicing proteins

AtU1A 1 U1A protein of the spliceosomal U1-snRNP

TECHNICAL DATAYeast strain G19 (ena1-4::HIS3)Library of F. Lacroute (Plant J. 1992, 2: 417-422): Arabidopsis seedlings grown in vitroMinimal medium with 25 mM LiCl and 0.4 mM methionine750.000 transformants tested

OVEREXPRESSION OF SRL1 CONFERSSALT TOLERANCE TO TRANSGENIC ARABIDOPSIS PLANTS

In vitro germination

3-weeks old plantstreated for 20 d with200 mM NaCl

aborted siliques

normal siliques

AAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAA

AAAAAAAAAA

mRNA

Beta vulgaris cv. DITA

Xho I

Eco RIEco RI

Eco RI

Xho IXho I

cDNA

Yeast/E. coli plasmidpYPGE15

cDNA

S. cerevisiae (ena1-4 nha1)

Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a salinidad. (Col. Con Roc Ros, U. de Valencia)

Genes de remolacha obtenidos en el escrutinio de tolerancia a salinidad

Clone Number of Predicted function Motifstimes isolated

BvSATO1 6 RNA binding protein RGG and RE/D BvSATO2 1 Homologous to BvSATO1BvSATO3 1 RNA binding protein P-rich and Zn-fingerBvSATO4 1 RNA binding protein RBDBvSATO5 1 RNA binding protein BvSATO6 1 RNA binding protein RBDBvU2AFsnRNP 3 RNA binding protein RBD and Zn-fingerBvSATO7 1 No homologiesBvCK2a 1 Protein kinase CK2BvURA4 2 Dihydroorotase (uracil biosynthesis)BveIF-1A 3 Translation initiation factor

35S::BvSATO1 control

35 days growth withwithout stress

35 days growth with50 mM NaCl

PATENT TITLE: Protection against environmental toxicity through manipulation of the processing of messenger RNA precursors

Inventors : O. Vicente-Meana, M. Roldan-Medina, R. Serrano-Salom, J. J. Forment,M. A. Naranjo-Olivero, R. Ros Palau, R. Khanonou

Priority date: 19 April 2000Filing date : 19 April 2001PCT publication date: 01 November 2001(transferred to Crop Design, now part of BASF)

AN EXAMPLE OF A PATENT TOO SPECIFIC

Because 8 years later an RNA binding protein provided drought tolerance in corn:News release, Monsanto (St. Louis, USA) and BASF (Ludwigshafen, Germany), June 9, 2009Monsanto, BASF scientists disclose discovery of gene conferring droughttolerance in corn plants: bacterial cspB gene encoding an RNA binding protein

Gene provides yield stabiltyduring periods of inadequatewater supply

Control plants

AAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAA

AAAAAAAAAA

mRNA

Beta vulgaris cv. DITA

Xho I

Eco RIEco RI

Eco RI

Xho IXho I

cDNA

Yeast/E. coli plasmidpYPGE15

cDNA

S. cerevisiae (gpd1)

Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a sequía.

Resultados del escrutinio en sequía

cDNAs identificados en 1.7 M de Sorbitol

YPD XERO1 Serine O-Acetyltransferase

XERO2 Type II Plant Haemoglobin

SD XERO3 Ascorbate Peroxidase 3

No incluidos en la patenteIncluidos en la patente

HomoserineHomoserineAcetil-CoA

O-acetylhomoserineO-acetylhomoserine

HomocysteineHomocysteine

cystathioninecystathionine

CysteineCysteine

[MET2]

[STR4]

[STR1/CYS3]

CoA

S2-

Serine

[MET15]

SerineSerine

CysteineCysteine

O-acetylserineO-acetylserine

S2-

XERO1Acetil-CoA

CoA

¿Por que da tolerancia un gen que no está conservado?

Recientemente se ha demostrado que este gen puede ser clave para el desarrollo de estrategias de fitorremediación(Freeman et al… Plant Cell, 2004; BMC 2007)

Actualmente tenemos arroz que sobreexpresa este gen

Y hemos empezado una colaboración con Carmina Gisbert (COMAV, Valencia) para sobreexpresar XERO1-3 en tomate y berengena

AAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAA

AAAAAAAAAA

mRNA

Beta vulgaris cv. DITA

Xho I

Eco RIEco RI

Eco RI

Xho IXho I

cDNA

Yeast/E. coli plasmidpYPGE15

cDNA

S. cerevisiae (wt)

Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a frío.

Resultados del escrutinio en frío

cDNAs identificados a 10 ºCYPD CRIO1 (8) ScDID1 / AtSNF7 / CHMP4 / VPS32

CRIO2 (2) Homólogo de CRIO1

CRIO3 (4) ScDID2 / AtVPS46/CHMP1

CRIO4 (1) PDR16 / SEC14SD CRIO5 (1) Proteína “Ring Finger”

CRIO6 (1) Proteína intrínseca de tonoplasto

SDCOLD1 (2) Cadena corta de la rubisco

SDCOLD5 (1) Proteína de unión a clorofila

CRIO1,2 localizan en el MVB en células vegetales

N. Of branches/plant

0

1

2

3

4

wt L3 L8 L9

Crecimiento de las plantas RD29A::CRIO2 a 10 ºC

0% 25% 50% 75% 100%

wt

Line 3

Line 8

Line 9

VegetativeBoltingInflorescence Floral

N. Of Flowers/plant

0

2

4

6

wt L3 L8 L9

hypocotyl length

0

2,5

5

7,5

10

wt L3 L8 L9

La levadura funciona bien

Pero no es una planta

Buscar genes de plantas en plantas

•• VentajasVentajas::•• TrabajanTrabajan ““In situIn situ””, , porpor lo lo queque evitasevitas el el sesgosesgo de los de los

sistemassistemas heterheteróólogoslogos contra contra laslas proteproteíínasnas de de membranamembrana o o laslas proteproteíínasnas reguladorasreguladoras..

•• Las Las variedadesvariedades obtenidasobtenidas puedenpueden ser de ser de utilidadutilidad immediataimmediata. .

•• DesventajasDesventajas::•• SistemaSistema carocaro y lento. y lento. RequiereRequiere unauna infraestructurainfraestructura

complicadacomplicada..

Primera aproximación: Colecciones de mutantes no marcadas (ganancia o pérdida de función)

Sodium transportersSOS1 (extrussion in roots)HKT1 (phloem loading in shoots

and xylem retrieving in roots)Regulators

SOS2-SOS3 (Ca-PK)SAL1 (PAP and inositol polyphosphatase)ABA (ABA2, ABA3, ABI4)

AntioxidantsCatalase

General metabolismSOS4 (pyridoxal kinase)SOS5 (arabinogalactan protein)

Calcium signalingABA signaling

H2 O2 detoxification

Defects in fundamental processescompromise adaptation to diffferent stresses

Problemas: No identifica factores limitantes, Proyectos muy largos y caros

Las colecciones marcadas: Una especie de solución para encontrar genes de tolerancia

Activador Transcripcional

T-DNA

RB LB

• Activation tagging: Activation tagging: ConstrucciConstruccióónn con con cuatrocuatro copiascopias en tandem del en tandem del promotorpromotor del 35S. En del 35S. En funcifuncióónn del del sitiositio de de inserciinsercióónn puedepuede ocasionarocasionar la la sobreexpresisobreexpresióónn de un gen.de un gen.

•• El El problemaproblema eses queque a a vecesveces se se consigueconsigue la la sobreexpresisobreexpresióónn de de unauna copiacopia truncadatruncada o la o la sobrexpresisobrexpresióónn de un de un antisentidoantisentido..

A dominant mutation conferring pleiotropic tolerance to toxic cations

Alejandro et al. (2007) EMBO J. 26: 3203-3215(tesis doctoral de Santiago Alejandro; colaboración con los grupos dePedro L. Rodriguez y José A. Fernández)

Y ahora que?

• Los genes SATO, CRIO1-5 y XERO2 han sido introducidos en maíz, colza, soja y algodón y están actualmente en evaluación en campo.

• …Quizás algún día tengamos plantas tolerantes con genes que encontramos en el laboratorio de Valencia

¡¡¡Gracias por la vuestra atención!!!• Si teneis ganas de más: ( @jmmulet)

• www.losproductosnaturales.com