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Cap. 5 Espressione genica: la trascrizione pp.115-143
Sintesi 05
• La sintesi proteica avviene in due fasi, trascrizione e traduzione
• Il DNA viene trascritto in una molecola di RNAm• Il messaggero viene tradotto in un peptide• Per la traduzione sono indispensabili RNAr ed RNAt• Sequenze particolari segnalano i punti di inizio e termine di
trascrizione e traduzione• Esperimento di Chambon sull’ovoalbumina di pollo• Molti geni eucarioti sono interrotti da sequenze trascritte ma
non tradotte: introni. Le parti tradotte prendono il nome di esoni
• Negli Eucarioti il trascritto iniziale matura attraverso l’eliminazione degli introni e altre modifiche biochimiche.
Cellula pro- ed Eu-cariote
L’RNA è chimicamente simile al DNA, ma:
E’ a filamento singolo, non a doppia elicaContiene ribosio, non desossiribosioOltre ad adenina, citosina e guanina, contiene non timina, ma uracile
Perciò:•Vale il principio della complementarietà delle basi: la molecola di RNA viene sintetizzata sulla base di un tratto di DNA•Esistono geni che codificano per proteine; dalla loro trascrizione origina l’RNAm; esistono geni che codificano per RNAt e l’RNAr.
Schema della trascrizione
non
Schema della trascrizione
Nei procarioti, un’unica proteina complessa, l’RNA polimerasi o RNA P, catalizza la trascrizione
In E. coli, RNA P è costituita da 2 subunità , 2 subunità e una subunità . La subunità può dissociarsi, separandosi dal core o nucleo dell’enzima. Diversi fattori indirizzano la RNA P verso geni diversi.
Schematicamente, tre fasi:1. Inizio. I siti del DNA che contengono i segnali d’inizio della
trascrizione si chiamano promotori. La subunità riconosce una regione del promotore, a cui si attacca. La doppia elica si denatura e si stacca dal core della RNA P.
Schema della trascrizione
2. Allungamento. Il core della RNA P comincia a scorrere lungo l’elica “senso” del DNA; ribonucleotidi trifosfati vengono legati all’estremità 3’ libera della catena; l’energia di legame proviene dalla rottura dei legami fosforici.
3. Terminazione. Sequenze di terminazione, o terminatori, sono presenti alla fine di ogni messaggero. In certi casi una proteina, fattore , li riconosce, vi si lega e provoca il distacco dell’RNAm. In altri casi è la RNA P stessa che li riconosce e si stacca
Quindi, schematicamente, un gene comprende:
Elica stampo
Promotori in vari geni di E. coli: TATA box e regione –35 (sequenze consenso)
Come la replicazione, la trascrizione procede in direzione 5’-3’
Trascrizione in E. coli: inizio ed allungamento
Trascrizione in E. coli: terminazione
Inverted repeats
Le RNA polimerasi
• Nei procarioti, una sola RNA P si occupa della trascrizione di tutti i geni
• Negli Eucarioti, diverse RNA P catalizzano la sintesi di:
1. mRNA, che in seguito verrà tradotto in polipeptide (RNA P II)
2. rRNA, in segmenti di varie lunghezze che alla fine si aggregano a formare ribosomi (RNA P I)
3. tRNA, che riconoscono la sequenza dell’mRNA e allineano gli amminoacidi corrispondenti (RNA P III)
• Ridondanza genica per RNA P I e RNA P III.
Inizio trascrizione negli Eucarioti (RNA P
II, fattori d’inizio, enhancers)
Schema generale di mRNA al termine della trascrizione (Eu- e pro-carioti)
AUG UGA
Sequenza leader Sequenza codificante Sequenza terminale(non tradotta) (non tradotta)
5’ 3’
L’esperimento di Chambon
Scopo: isolare un geneProblema: avere tante copie dello stesso tratto di DNAMetodo: isolare un mRNA, copiarlo con una trascrittasi inversa: cDNA.
mRNA in una cellula Eucariotica specializzata e non specializzata
L’esperimento di Chambon
Profilo degli RNA in una cellula EucarioticaOvidutto di pollo, albumina
messaggeri
L’esperimento di Chambon: ibridazione mRNA-DNA
1. mRNA prelevato dal citoplasma2. cDNA3. Anse nell’ibrido mRNA-cDNA4. Il gene dell’ovalbumina è interrotto da introni
Il gene dell’ovalbumina e la maturazione (splicing) del suo messaggero
Maturazione dell’mRNA
• Aggiunta di un cappuccio (G e 2 gruppi metilici) in 5’ (“capping”)
• Rimozione enzimatica degli introni• Poliadenilazione in 3’ (aggiunta di poliA, 10-30 basi a
valle della sequenza-consenso AAUAAA.
Maturazione (splicing) del messaggero
Meccanismo della rimozione di un intronenei complessi di splicing
N=qualunque baseR=purinaY=pirimidina
Maturazione (splicing) del messaggero:in una fase transitoria,
un’Adenina forma tre legami fosfodiesterei
Splicing alternativi
Splicing alternativi: un gene fa tante proteine
Splicing alternativi: α-tropomiosina (ratto)
esoni costanti
Evoluzione degli introni: due ipotesiPrecoceGli introni erano una caratteristica essenziale dei primi organismi. La loro assenza nei batteri sarebbe dovuta ai tempi più brevi di divisione cellulare, e dunque al maggior numero di generazioni durante le quali il genoma batterico si è evoluto, perdendo (quasi) tutti gli introni ancestrali. TardivaGli introni non erano presenti nei primi organismi. Sarebbero arrivati di recente negli Eucarioti, nel corso dell’aumento di complessità che ha creato la necessità di sviluppare meccanismi di controllo coordinato dell’espressione genica.
Editing del messaggero
•Inserzione o delezione post-trascrizionale di nucleotidi, conversione chimica di una base in un’altra
•Risultato: Il messaggero maturo ha una sequenza di basi che non corrisponde esattamente a quella del DNA che la codifica
•Dove si osserva: in Tripanosoma; nei genomi mitocondriale e plastidiale di molte piante superiori; nei Mammiferi, in vari tessuti dove sono possibili splicing alternativi
Maturazione (splicing) nella
cellula Eucariote
Confronto fra pro- ed Eu-carioti
Trascrizione ai geni per l’RNA in E. coli:unità di trascrizione, ridondanza genica
Sette regioni rrnMaturazione!
Trascrizione ai geni per l’RNA in Eucarioti:unità di trascrizione, ridondanza genica
1250 serie di geniMaturazione
tRNA: basi modificate,
regioni funzionali
gradiente di saccarosio
tRNA: basi modificate, regioni funzionali
tRNA: maturazione
Riassunto 05• Il DNA viene trascritto in una molecola di RNAm• Il messaggero viene tradotto in un peptide• Nei procarioti una sola RNA P catalizza la trascrizione, negli
Eucarioti intervengono diverse RNA P specializzate in mRNA, rRNA e tRNA
• Sequenze particolari segnalano i punti di inizio e termine di trascrizione e traduzione
• Molti geni eucarioti sono interrotti da sequenze trascritte ma non tradotte: introni. Le parti tradotte prendono il nome di esoni
• Negli Eucarioti il trascritto iniziale matura attraverso l’eliminazione degli introni e altre modifiche biochimiche.
• Sia in Eucarioti che in procarioti, gli rRNA e tRNA subiscono un processo di maturazione
Farmacogenetica e farmacogenomica
Le discipline che studiano come individui con diverse caratteristiche genetiche rispondono ai farmaci
1. Farmacogenetica: individuazione di geni candidati, loro caratterizzazione molecolare2. Farmacogenomica: tipizzazione di centinaia o migliaia di geni e 2.1. Studio funzionale o 2.2. Studio associazione fenotipo/variante allelica
sull’RNA sul DNA
• Quali varianti alleliche sono associate ai diversi fenotipi (risposta e non-risposta al farmaco)?
Stessa diagnosi
Scopo della Farmacogenetica:individuare la componente genetica delle
diverse risposte ai farmaci e comprenderne il
funzionamento
Prevista risposta al farmaco :
scarsa o nulla
Previsto rischio
di tossicità del farmaco
diminuire la dose o usare un farmaco
differente
usare un farmaco differente
Prevista risposta al farmaco : buona
geni target
geni DME (Drug-Metabolising Enzymes)
geni per le proteine di trasporto
Tre classi di geni
trascrizione mRNA traduzione
P450 CYP2D6 (debrisochina idrossilasi)
Substrati del P450 Cyp2D6
•β-bloccanti•Antiaritmici•Antidepressivi triciclici•Antipsicotici•Analgesici•Antistaminici•… •MPTP (Parkinson inducing neurotoxin)
Attività enzimatica
RH+O2+NADPH + H+
ROH + H2O + NADP+
• 3 geni altamente omologhi- CYP2D8P pseudogene (~ 5.1 Kb)- CYP2D7P pseudogene (~ 4.2 Kb)- CYP2D6 gene funzionale (~ 4.3 Kb)
• similarita’ fra 2D6 e 2D7 : 97% circa• similarita’ fra 2D6 e 2D8 : 92% circa
~ 31 Kb
2D8 2D7 2D6tel cen
I II III IV V VI VII VIII IX
2D8 2D7
12Kb del
2D8 2D7 2D6
2D62D8 2D7 2D6
12Kb dup
macroriarrangiamenti
*5 = delezione genica
*?xN = duplicazione genica
Diversità globale al gene CYP2D6
(Sistonen et al. 2006)
Frequenze genotipiche al locus CYP2D6 in Asiatici ed Europei (Shimizu et al. 2003)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
I/I I/N I/D I/0 N/N N/D N/0 D/D D/0 0/0
Genotypes
Gen
oty
pe
freq
uen
cies
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