实验十八

（ 1 ）农杆菌感染烟草叶片与共培养

一、原理 根癌土壤农杆菌（ Agrobacterium tumefaciens ）是天然的植物基因工程载体之一，能感染 93 科 331 个属 643 个种的双子叶植物，将 Ti 质粒上的 T-DNA 转移并整合到植物基因组，其基因表达引发冠瘿瘤病。

经过改造的 Ti 质粒，删除了致瘤基因，能将目的基因重组到具有 T-DNA 两端序列的质粒载体上，实现通过外源基因转移改良植物品种的目的。常用的载体系统是双元载体系统。

acs ：农杆菌素碱基因； agc ：农杆菌素碱分解代谢基因； arc ：精氨酸分解代谢基因； noc ：胭脂碱分解代谢基因； nos ：胭脂碱合成基因； tra ：质粒转移基因； ori ：复制起点； vir ：毒性区，包含多个致病基因

胭脂碱型

T-DNA 结构示意

双元载体系统

nptII

gus

二、材料

烟草，农杆菌 LBA4404 ，质粒 pBI121

三、方法

共培养方法

四、步骤

1 、农杆菌培养（ 1 ）取新鲜菌落（液）于 2ml YEB 培养基（含 50mg/L Rif、 30mg/L Str 和 50mg/L Kan）中， 28 ℃下， 180rpm 震荡培养过夜。

（ 2 ）将 2ml 菌液转入 20ml 培养基（含 50mg/L Rif、 30mg/L Str 和 50mg/L Kan）中，培养 5~6 小时左右。

（ 3 ）菌液达到 OD600 ＝ 0.2 ～ 0.5 时用于转化。

2 、感染（ 1 ）取烟草幼叶，表面消毒（方法同上次实验），剪切成 0.5~1.0cm-2 大小。

（ 2 ）将叶片放入菌液中，在 80r/min 摇床上旋转浸染 5 ～ 10 分钟。

3 、共培养（ 1 ）将叶片置于无菌滤纸上吸去多余的菌液。

（ 2 ）接种在 MS 培养基上（ 0.02mg ／ L NAA ＋ 0.2mg ／ L BA ），在 25~28℃黑暗条件下共培养 2~3 天。每组接种 20 瓶。

4 、筛选转化细胞和诱导器官发生

（ 1 ）将共培养后的叶片转移到 MS 筛选培养基上：

MS+0.2mg/L BA+0.02mg/L NAA+3% 蔗糖 +0.7% 琼脂，高压灭菌，用前融化后冷却到 60 ℃时加入 100mg/L 羧苄青霉素和 50mg/L 卡那霉素（抗生素贮存液 1000× ，过滤灭菌，在 -20 ℃下保存 ）。各组每次 200ml 。

（ 2 ）每 3 天更换一次培养基。培养条件同前。

下次实验准备（均高压灭菌）1 、 CPW 培养基 +0.4mol/L 甘露醇， pH 5.4 ，各组（ 4 人） 60ml ，分装成 10ml 、 10ml 和 20ml 、 20ml 。

2 、 20 ％ PEG600 ， 0.06mol/L CaCl2 ， 0.3mol/

L 甘露醇。各组（ 4 人） 20ml

3 、 1mol/L 甘氨酸 -NaOH ， pH10.0 。各组（ 4 人） 10ml 。

4 、 W5 稀释液： 125mmol/L CaCl2 ， 155mmol/

L NaCl ， 5mmol/L KCl ， 5mmol/L 葡萄糖， pH5.6 。各组（ 4 人） 50ml

5 、其他需要高压灭菌的用具同本实验。

其他需要高压灭菌的用具：

过滤器（ 2 ），注射筒（ 1 ），不锈钢网筛（ =54m ）（ 1 ），漏斗（ 1 ），三角瓶（ 5 ），滴管（ 10 支）， 10ml 刻度离心管（ 2 支）。国庆节期间进入实验室安排：

10月 1日， 10月 3日， 10月 5日上午 9 ： 00~11 ： 00李老师在实验室，其他时间来实验室找同学开门。

祝同学们：

节日快乐！