Геном за 1000 рублейЗнать последовательность своей ДНК

не менее важно, чем иметь автомобиль.Джеймс Уотсон

Пущино 6 марта 2011 г.

Всего за 3 года (с мая 2007 г. по май 2010 г.) стоимость секвенирования индивидуального генома человека упала примерно в 100 раз (с 1 млн. до 10 тыс. $), но по ряду причин дальнейшее падение может замедлиться:

• потенциал совершенствования большинства технологий секвенирования второго поколения (NGS) уже почти исчерпан;

• возможность успешного завершения разработки технологий следующего поколения (NNGS), нацеленных на мономолекулярное секвенирование, вызывает большие сомнения;

• почти монопольное положение тройки лидеров геномных гонок (Illumina, LifeTech и Roche) недостаточно стимулирует снижение ими цен на секвенаторы и расходные реагенты;

• снижению стоимости геномных секвенаторов препятствуют высокие затраты на их разработку;

• быстрое моральное старение дорогостоящих приборов увеличивает амортизационные отчисления, которые также необходимо учитывать при определении «цены генома».

Рубеж в 1000$ может стать барьером, в преодолении которого не заинтересованы нынешние участники геномных гонок. Приблизиться вплотную к этому барьеру, по-видимому, удастся через 2…3 года, но для продолжения гонок потребуется новая цель, и такой целью может стать «Геном за 1000 рублей». Правда, возможны и другие варианты. Например, в прошлом году компания GnuBio (США) пообещала разработать «микрофлюидную» технологию, позволяющую уменьшить стоимость секвенирования генома человека до 30 $, но все продаваемые в России секвенаторы и их расходные реагенты стоят в 2…3 раза дороже, чем в США. Соответственно, для отечественных потребителей тридцатидолларовой технологии эта цена возрастёт до 1800…2700 руб. (60…90 $).

Отсюда следует необходимость разработки российского секвенатора, который на пути к российским же потребителям не будет проходить через цепочку посредников и пересекать государственную границу. При прочих равных условиях секвенирование на произведённом в России приборе для отечественных учёных будет дешевле, чем на американском, в 2…3 раза. Менее очевидные возможности уменьшения стоимости секвенирования геномов желательно рассмотреть более подробно.

Выбор NGS-технологииВ современных технологиях параллельного секвенирования, обозначаемых обычно

аббревиатурой NGS (Next Generation Sequencing), используются иммобилизованные на микросферных носителях или на плоской поверхности мультимолекулярные клоны, получаемые при помощи твердофазной амплификации коротких фрагментов ДНК. Секвенаторы следующего поколения (NNGS – Next-Next Generation Sequencing), возможно, станут мономолекулярными, но многочисленные попытки создать конкурентоспособную технологию подобного рода пока оканчиваются провалом.

Первый мономолекулярный секвенатор Heliscop™, появившийся в продаже в начале 2008 года, оказался неконкурентоспособным, и в середине 2010 года компания Helicos BioSciences прекратила попытки улучшить его ценовые показатели и рабочие характеристики. Прибор получился слишком дорогим (около миллиона долларов), расход реагентов слишком высоким, а длина и точность чтения нуклеотидных последовательностей слишком низкой.

Следующую попытку вывести на рынок мономолекулярный секвенатор предприняла компания Pacific Biosciences, вложившая в эту разработку около 400 млн. $. Секвенаторы PacBio RS должны поступить в продажу во втором квартале 2011 года, но их конкурентоспособность уже сейчас вызывает большие сомнения. Имеющиеся у этого прибора преимущества (экспрессная

пробоподготовка и высокая скорость секвенирования) явно не смогут компенсировать его недостатки - низкую производительность, высокий фон ошибок, а также чрезмерную стоимость прибора (695 тыс. $) и расходных материалов (~ 300 тыс. $ в год).

Рынок приборов и реагентов для NGS в 2010 году достиг 1,3 млрд. $, и продолжает быстро расти. Лидирует на нём компания Illumina с секвенаторами HiSeq 1000 (производительность - 100 млрд.п.о. за рабочий цикл, стоимость – 550…600 тыс. $) и HiSeq 2000 (200 млрд.п.о., 690 тыс. $). Основными расходными реагентами для них являются ДНК-полимераза и флуоресцентно меченые субстраты полимеразного синтеза (дНТФ). На втором месте обосновалась компания Life Technologies с моделями 5500 (90 млрд.п.о., 349 тыс. $) и 5500xl (180 млрд.п.о., 595 тыс. $), расходующими ДНК-лигазу и флуоресцентно меченые олигонуклеотиды. При одинаковой (недельной) продолжительности рабочего цикла секвенаторы обеих компаний демонстрируют примерно равную производительность. Правда, HiSeq 2000 при увеличении рабочего цикла до двух недель сможет читать до 600 млрд.п.о., но реагентов он будет расходовать больше, а точность чтения понизится.

Расход реагентов на секвенирование генома человека при общепринятом сейчас 30…40-кратном чтении ДНК для HiSeq 2000 (Illumina) составляет примерно 5 тыс. $., а для 5500xl (LifeTech) – 3 тыс. $, причём определяется это не столько сложностью их синтеза, сколько маркетинговой политикой компаний.

Стоимость приборов такого класса вряд ли опустится ниже 150 тыс. $, а снижение стоимости реагентов при приближении к 1000$ за геном может прекратиться уже по объективным причинам. Тем не менее, потенциал этих технологий ещё не исчерпан. Значительную экономию реагентов может обеспечить, например, многократное использование расходных реагентов. Но даже при удешевлении флуоресцентных секвенаторов до 150 тыс. $ их широкое применение в российских лабораториях, для которых они буду стоить по 300…450 тыс. $, вызывает большие сомнения.

Отдельный сектор рынка NGS занимают менее производительные, но более скоростные биолюминесцентные секвенаторы компании Roche (FLX Titanium и GS Junior). Первый прибор такого типа (GS 20) появился в продаже ещё в 2005 году. Сейчас потенциал совершенствования используемой в них биолюминесцентной технологии секвенирования в основном исчерпан. Продажи последней модели (GS Junior, 125 тыс. $) начались в середине 2010 года, но уже к концу года она морально устарела, поскольку компания Ion Torrent выпустила первый полупроводниковый секвенатор PGM (Рис. 1).

Personal Genome Machine (PGM) компании Ion Torrent

Рис. 1

2

По производительности (10…15 млн.п.о. за 2 часа) первая модель PGM близка к GS Junior (35 млн.п.о. за 10 часов), но прибор и «расходники» стоят в 2…4 раза меньше (~50 000 $/125 000 $ и 500 $/2000 $).

В октябре 2010 г. компания Ion Torrent перешла в собственность Life Technologies (цена сделки – 725 млн. $). Данная сделка способна пошатнуть лидерство компании Illumina, ответным шагом которой стало заявление от 12.01.2011 г. о скором завершении разработки упрощённой и предельно удешевлённой модели флуоресцентного секвенатора MiSeq (120 млн.п.о., 125 тыс. $). Но в продаже он появится только через пол года, а производительность PGM уже через 1…2 месяца должна превысить 100 млн.п.о..

Со стороны Roche ответным ходом стало заключение партнёрского соглашения с компанией DNA Electronics, обладающей ключевым патентом на полупроводниковую технологию секвенирования ДНК. Лицензионное соглашение между DNA Electronics и Ion Torrent было подписано в августе прошлого года.

Таким образом, наиболее перспективной на сегодняшний день является полупроводниковая технология секвенирования, разработанная компанией Ion Torrent. Для полногеномного анализа она пока непригодна, но через 2…3 года ситуация может измениться.

Полупроводниковая NGS-технологияВ секвенаторе PGM регистрируются изменения pH, происходящие при выделении всего

одного протона на каждый встраиваемый в ДНК нуклеотид. Побочным продуктом этой же реакции является молекула пирофосфата. Её расщепление пирофосфатазой до двух фосфатов способно утроить суммарный выход протонов и заметно увеличить смещение pH, но можно регистрировать и не pH. При изменении характера ион-селективного покрытия микросенсоров встраивание нуклеотидов в ДНК можно регистрировать по выделению пирофосфата, появлению фосфатных анионов, а в простейшем виде и по изменению суммарного заряда иммобилизованной на поверхности сенсора ДНК.

Рассматривать и разрабатывать альтернативные варианты секвенирования имеет смысл только в случае невозможности договориться с обладателями патента на самый прямолинейный и уже проверенный компанией Ion Torrent вариант полупроводниковой NGS-технологии. Пожалуй, единственным исключением из этого правила является ДНК-лигазное секвенирование, сочетание которого с ДНК-полимеразным способно заметно улучшить качество полупроводниковой «оцифровки» ДНК. Но этот вариант может быть не более чем вспомогательным.

Сравнительная дешевизна полупроводникового секвенатора обусловлена отсутствием прецизионных оптических и механических частей. «Сердцем» такого прибора является небольшой полупроводниковый чип, на поверхности которого располагаются более миллиона pH-чувствительных микросенсоров. Включение нуклеотидов в ДНК вызывает небольшое снижение pH в прилегающих к микросенсорам лунках, что позволяет читать нуклеотидные последовательности по наличию или отсутствию изменения pH при пропускании через проточную ячейку индивидуальных субстратов ДНК-полимеразы (дезоксинуклеозидтрифосфатов дАТФ, дГТФ, дТТФ и дСТФ).

Примерно такое же «сердце» имеется у всех цифровых фотоаппаратов, веб-камер и т.п., считывающих информацию с сенсоров изображения. Это позволяет оценить ориентировочную стоимость электронных компонентов, необходимых для сканирования pH-сенсорного чипа и первичной обработки сигналов (< 1000$).

Наиболее дорогой частью полупроводникового секвенатора является программируемая система подачи субстратных реагентов и промывочных растворов в сенсорную проточную ячейку. Информация об этой системе у PGM очень ограничена, но её отечественным аналогом может служить синтезатор олигонуклеотидов ASM-800 (~27 тыс. $).

3

Синтезатор ASM-800(ООО «Биоссет», Новосибирск)

Рис.2

Основным отличием является количество обслуживаемых системой проточных ячеек (или микроколонок). ASM-800 прокачивает строго дозированные микрообъёмы реагентов через 8 микроколонок, а PGM имеет дело всего с одной проточной ячейкой. Таким образом, использование готовой восьмиканальной системы подачи реагентов способно почти на порядок повысить производительность полупроводникового секвенатора без увеличения его стоимости. Вероятно, при уменьшении количества каналов цена секвенатора может уменьшиться в 2…3 раза (до 10…15 тыс.$). В таком случае амортизационные отчисления станут незначительными, и стоимость секвенирования ДНК будет определяться в основном стоимость пробоподготовки, расходных реагентов и pH-сенсорных чипов.

pH-сенсорные чипыpH-сенсорный чип секвенатора PGM (“314x”, 250 $) содержит 1,55 Mp (миллионов

сенсорных пикселов). В первом полугодии компания Ion Torrent планирует заменить его более производительным чипом (“Ion 316”, 7Mp, 500 $) и одновременно оптимизировать технологию секвенирования, что позволит увеличить производительность секвенатора почти на порядок (до 100 млн.п.о.). Испытания следующей модификации чипа (“318”, 11 Mp) начнутся в сентябре. В продаже он появится до конца этого года, а в 2012 году должен появиться чип “320”, который позволит увеличить производительность секенатора до 10 млрд.п.о. за рабочий цикл.

Аналогичную структуру полупроводникового чипа имеют получаемые по CMOS-технологии BSI-сенсоры изображения (Back Side Illuminated), которые благодаря высокой светочувствительности, компактности и дешевизне широко используются в цифровой фототехнике, сотовых телефонах и коммуникаторах последнего поколения. Их разрешение (количество фотосенсорных пикселов) обычно составляет 5, 8 или 12 Mp. Уже появились BSI-сенсоры на 14 и 16 Mp, и это далеко не предел. В астрономии используются даже гигапиксельные сенсоры изображения.

Полупроводниковый секвенатор, работающий на гигапиксельных pH-сенсорах, сможет конкурировать с флуоресцентными приборами типа HiSeq 2000 и 5500xl, но появится он ещё не скоро. Что касается ближайшего будущего (2011…2012 г.г.), то ориентироваться лучше на дешёвые сенсорные чипы с разрешением 12…14 Mp. Стоимость подобных чипов, производимых на заказ компанией TSMC (Taiwan Semiconductor Manufacturing Company), составляет менее 1 $. У заказчиков (fabless-компаний) их цена увеличивается в 5…10 раз (до 5…10 $).

Одноразовый чип “314x” от Ion Torrent сейчас стоит 250$, но после появления на рынке первого же конкурента цена может понизиться более чем на порядок. В данной конкурентной борьбе способны принять участие многие компании, разрабатывающие BSI CMOS-сенсоры (OmniVision Technologies, Sony, Toshiba, Samsung, Fujifilm, TSMC, InVisage и др.).

4

Значительно удешевить полупроводниковое секвенирование позволяет многократное использование pH-сенсорных чипов. pH-чувствительным покрытием у них служит тонкая плёнка диэлектрика - нитрида кремния, которая сохраняет свои защитные и сенсорные свойства в нейтральных водных растворах до 7 дней. Пропускаемые через проточную ячейку реагенты не отличаются особой агрессивностью, поэтому 10-кратное или даже 100-кратное использование чипов представляется вполне реальным.

Таким образом, благодаря многократному использованию сенсорных чипов и снижению их стоимости данная статья расходов на полупроводниковое секвенирование в ближайшем будущем может уменьшиться примерно в 1000 раз (с 250 $ до 10 рублей). При этом возрастёт доля затрат на прокачиваемые через проточную ячейку расходные реагенты – растворы особо чистых дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), содержащие ДНК-полимеразу.

Расходные реагентыВ полупроводниковом секвенировании используются растворы дезоксинуклеозид-

трифосфатов с минимальными концентрациями, сравнимыми с характерными для ДНК-полимераз константами Михаэлиса (20…50 мкм). Следовательно, из 1 мМ дНТФ (~ 1000 руб. по каталогу ООО «Медиген») можно приготовить 20…50 мл реагентных растворов (по 5…12,5 мл каждого из четырёх дНТФ). Это примерно соответствует расходу данных реагентов на один цикл работы полупроводникового секвенатора (1…2 часа). В то же время расход дНТФ в самой полимеразной реакции, обеспечивающей секвенирование ДНК, не превышает 1013…1014 молекул на одну проточную ячейку, что составляет менее 0,00001% от их общего количества (1 мМ = 6х1020

молекул). Отсюда следует необходимость повторного использования данных растворов. Проблема в том, что часть дНТФ может гидролизоваться спонтанно. Кроме того, при

прохождении индивидуальных растворов через насосы, трубки и проточные ячейки возможно их перекрёстное загрязнение. Следовательно, кроме системы подачи реагентов секвенатор должен быть оснащён ещё и системой их сбора, исключающей смешивание разных дНТФ на выходе, а после каждого цикла секвенирования дезоксинуклеозидтрифосфаты должны проходить повторный цикл очистки. Накапливающиеся в результате гидролиза дНТФ моно- и дифосфаты нуклеозидов желательно регенерировать до трифосфатов.

Разумеется, это создаёт дополнительные проблемы, но все они вполне разрешимы. Одним из решений может стать разработка секвенатора с замкнутой системой циркуляции реагентов, обеспечивающей их очистку в самом рабочем цикле.

Ещё одной проблемой являются очень высокие требования, предъявляемые к чистоте индивидуальных дНТФ. Стоимость особо чистых реагентов, предназначенных для секвенирования ДНК, может оказаться на порядок выше общедоступных дНТФ, применяемых для проведения ПЦР. Разработка внутрилабораторного метода многократной повторной очистки использованных дНТФ позволит решить заодно и проблему чистоты исходных реагентов.

Многократно должна использоваться и содержащаяся в расходных реагентах ДНК-полимераза. При стоимости ~1 руб./ед. и рабочей концентрации ~1 ед./10 мкл для приготовления 20…50 мл рабочего раствора потребуется 2…5 тыс. ед. фермента (2…5 тыс. руб.). Самостоятельная очистка ДНК-полимеразы, её регенерация и повторное использование способны уменьшить эти расходы в 100…1000 раз.

Отсюда следует, что при разработке системы подачи реагентов в проточную ячейку полупроводникового секвенатора необходимо предусмотреть возможность сбора отработанных реагентов, а в комплект поставки прибора должна входить система их повторной очистки и регенерации. Это позволит уменьшить стоимость наиболее дорогих расходных реагентов (дНТФ и ДНК-полимеразы) до 10…100 руб. на рабочий цикл.

ПробоподготовкаПодготовка ДНК к секвенированию заслуживают отдельного рассмотрения, поскольку без

уменьшения расходов на пробоподготовку удешевление самого секвенирования может оказаться бессмысленным. Обычно такая подготовка включает следующие стадии:

очистка ДНК;фрагментация;

5

«полировка» двунитевых концов;пришивка адапторов;предварительная амплификация;выделение ампликонов заданной длины;определение концентрации ДНК;получение клонов отдельных молекул ДНК на микросферных носителях при помощи

эмульсионной ПЦР (или твердофазный синтез кластерных колоний ДНК);фракционирование микросфер (для кластеров не требуется);иммобилизация микросфер на сканируемой поверхности проточной ячейки (для кластеров

не требуется);перевод двунитевой ДНК в однонитевую форму.

Заметно упрощает пробоподготовку прямое получение клонов ДНК на сканируемой поверхности проточной ячейки секвенатора, используемое в кластерной SBS-технологии (Sequencing By Synthesis) компании Illumina. Что касается технологии SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) компании Life Technologies и технологии 454-секвенирования (пиросеквенирования) компании Roche, то их существенным недостатком является необходимость получения микросферных носителей ДНК при помощи эмульсионной ПЦР. Данный недостаток унаследовала и полупроводниковая технология секвенирования, разработанная компанией Ion Torrent.

Этапов пробоподготовки может быть и больше. Например, для секвенирования РНК необходимо проведение обратной транскрипции. Для секвенирования транскриптомов нужна нормализация получаемой библиотеки кДНК или ампликонов. Дополнительные стадии подготовки ДНК требуются для проведения парноконцевого или сцепленноконцевого секвенирования, а также для избирательного секвенирования участков генома, экзомов, микроРНК и т.п..

Для подготовки ДНК к секвенированию используется целые комплекты дополнительного дорогостоящего оборудования (системы очистки ДНК, ультразвуковые дезинтеграторы, небулизаторы, автоматизированные системы амплификации ДНК и т.п.). Появляются и системы экспрессной пробоподготовки, не требующие дополнительного приборного оснащения. Одна из первых – Nextera, в которой вместо фрагментации ДНК и пришивки адапторов используется одноэтапное транспозонное встраивание в ДНК синтетических олигонуклеотидов, занимающее около двух часов (http://www.epibio.com/nextera/nextera_tech_overview.asp). Намного проще использовать для этих же целей ПЦР-фрагментацию, предложенную ещё в прошлом веке отечественными учёными (PCR-фрагментация ДНК / Л.А.Железная и др. // Биохимия. – 1999. – Т.64, вып.4. - с.447-453). ПЦР-фрагментация занимает менее часа и приводит к образованию молекул ДНК, пригодных для дальнейшей амплификации (получения молекулярных клонов) и секвенирования.

Сейчас в полупроводниковом секвенировании используется эмульсионная ПЦР. Носителями моноклонов ДНК служат микросферы диаметром ~3 мкм, распределяемые по лункам pH-сенсорного чипа. Для упрощения пробоподготовки желательно моноклоны (микроколонии) молекул ДНК получать твердофазной амплификацией на пористом носителе. Такими носителями могут служить, например, ядерные (трековые) фильтры с вертикальными порами диаметром 0,1…0,5 мкм. Преимущества данного подхода требуют отдельного обсуждения. Пока очевидно только то, что необходима тщательная экспериментальная проработка упрощённых и улучшенных вариантов пробоподготовки. Без проведения такой работы получить геном за 1000 руб. не удастся.

Рост производительности NGS-технологийВ 1965 году, через 6 лет после появления первых интегральных микросхем, один из

основателей компании Intel Гордон Мур высказал предположение, что число транзисторов на кристалле будет удваиваться каждые 24 месяца. Данная закономерность, определяющая рост производительности вычислительной техники, наблюдается уже более 50 лет, и называется законом Мура. Аналогичный закон можно предложить и для NGS-технологий, но с существенной поправкой. Каждые 2 года их производительность увеличивается не в 2, а в 10 раз. При этом

6

стоимость секвенирования генома человека каждые два года уменьшается примерно на порядок (Рис. 3).

«Закон Мура» для геномного секвенирования

Рис. 3

Если такая тенденция сохранится, то стоимость секвенирования генома человека через два года должна уменьшиться до 1000$, а вскоре после зимней Олимпиады-2014 она может опуститься до 100$. Вероятно, оцифровать индивидуальный геном за 1000 рублей можно будет в 2015 году, но «традиционные» NGS-технологии на это уже неспособны.

Первая из таких технологий (454-секвенирование) появилась в 2005 году, и именно она позволила в середине 2007 года преодолеть рубеж в 1 млн.$. К концу 2009 года стоимость пиросеквенирования геномов уменьшилась на порядок, до 100 тыс.$, но конкуренты (Illimina и Applied Biosystems) преодолели этот рубеж раньше - в конце 2008 года. Производительность последней модели пиросеквенатора FLX сейчас достигла 1 млрд.п.о. за рабочий цикл (1/3 генома человека). Ещё недавно это было бы прекрасным показателем, но при сравнении с характеристиками флуоресцентных секвенаторов нынешние параметры пиросеквенаторов выглядят весьма скромно.

Рост производительности флуоресцентных секвенаторов компании Illumina, появившихся в начале 2008 года, был более стремительным (Рис. 4).

Прогнозы роста производительности секвенатора GA IIx на 2009 год

Рис. 4

В начале 2010 года появился секвенатор нового поколения (HiSeq 2000), производительность которого была увеличена до 200 млрд.п.о. за рабочий цикл. Его разработчики недавно объявили, что в I квартале 2011 года производительность этого прибора возрастёт до 600 млрд.п.о., причём уже сейчас в тестовых прогонах им удаётся считывать более 1 «терабайта» генетической информации. Правда, стоимость расходных реагентов в пересчёте на 30…40-кратное

7

чтение генома человека при этом не снижается и равна примерно 5 тыс.$. Похоже, что дальнейшее увеличение производительности флуоресцентных секвенаторов уже не будет сопровождаться заметным уменьшением стоимости расходных реагентов.

Не менее быстро росла и производительность разработанных компанией Applied Biosystems ДНК-лигазных секвенаторов серии SOLiD. Первый прибор появился в конце 2007 года, но имел ряд недоработок. Работоспособной оказалась только вторая модель, поставки которой начались в начале 2008 года. Сейчас компания полностью обновила модельный ряд секвенаторов и приступила к производству приборов 5500 и 5500xl. По производительности эти приборы несколько уступают секвенаторам HiSeq 1000 и HiSeq 2000 компании Illumina, но точность чтения у них немного выше, а стоимость расходных реагентов заметно ниже (3 тыс.$ на геном).

Первый полупроводниковый секвенатор стартовал на рынке NGS всего пару месяцев назад с начальной производительностью 10…15 млн.п.о., но уже через 1…2 месяца она должна возрасти до 100 млн.п.о.. Разработчикам данного прибора уже сейчас удаётся читать по 300 млн. п.о. за один рабочий цикл (~2 часа).

Производительность полупроводникового секвенирования зависит от ряда параметров:• длины читаемых нуклеотидных последовательностей (у PGM - 100 п.о.);• разрешения чипа (у PGM – 1,55 Mp);• эффективности использования pH-сенсорных пикселов;• количества pH-сенсорных чипов (у PGM только 1 чип).

Через 1…2 месяца длина читаемых секвенатором PGM последовательностей должна увеличиться со ста до двухсот пар оснований и, судя по всему, это далеко не предел. У пиросеквенаторов FLX и GS Junior средняя длина чтения ДНК составляет примерно 400 п.о., причём в ближайшие месяцы ожидается её увеличение до 1000 п.о.. По-видимому, PGM после оптимизации технологии сможет продемонстрировать такие же показатели.

Не менее быстро может расти разрешение pH-сенсорных чипов. Через пару месяцев на смену “314x” (1,55 Mp) должен прийти “Ion 316” (7 Mp). Дальнейшие планы компании Ion Torrent пока неизвестны, но, судя по появлению дешёвых BSI-сенсоров изображения с разрешением 14 и 16 Mp, появления аналогичных pH-сенсорных чипов ждать придётся недолго.

Ожидается прогресс и в повышении эффективности использования pH-сенсоров. Значительная часть лунок на чипе остаётся незаполненной микросферами, а часть этих микросфер или не содержит ДНК, или несёт на себе не моноклоны молекул, а смесь двух и более их видов. Такая же проблема характерна и для пиросеквенаторов, у которых эффективность использования лунок проточной ячейки удалось довести до 50%. У PGM из имеющихся на чипе 1,55 Mp сенсорных пикселов 0,25 Mp остаются за пределами проточной ячейки (Рис. 5), а эффективность использования остальных 1,3 Mp, судя по нынешней производительности прибора, составляет примерно 10%. Следовательно, увеличить производительность полупроводникового секвенатора примерно в 5 раз можно только за счёт улучшения конфигурации проточной ячейки и повышения эффективности использования сенсорных пикселов.

Проточная ячейка секвенатора PGM с чипом “314x”

Рис. 5

8

Ещё одним пока неиспользованным резервом наращивания производительности полупроводниковых секвенаторов является увеличение количества проточных ячеек с одной (у PGM) до 6 (как у 5500), 8 (HiSeq 1000), 12 (5500xl), 16 (HiSeq 2000), или даже до 96 (ASM-2000).

К концу текущего года производительность PGM может преодолеть рубеж в 1 млрд.п.о. и продемонстрировать рекордные темпы роста – в 100 раз всего за один год. Предыдущий рекорд принадлежит секвенаторам Illumina, производительность которых увеличилась за 4 года почти в 1000 раз - с 1 миллиарда п.о. в начале 2007 года до 1 триллиона в начале 2011 г. (при продолжительности рабочего цикла 10…14 суток).

По-видимому, темпы роста производительности полупроводниковых секвенаторов через 2…3 года побьют этот рекорд и обеспечат 3…4-кратное секвенирование генома человека на одном чипе за один рабочий цикл (при продолжительности рабочего цикла 10…14 часов). Затем фаза взрывного роста замедлится, и в дальнейшем производительность секвенирования будет расти в соответствии с законом Мура, т.е. будет удваиваться каждые 2 года.

Dream MachineСеквенатор PGM (Personal Genome Machine) ещё несовершенен, но рассмотрение его

недостатков позволяет понять, к чему следует стремиться, и какие рабочие характеристики должны быть у идеального прибора - у Dream Machine (DM). Данное название было предложено одним из участников форума seqanswers.com (http :// seqanswers . com / forums / showthread . php ? t =8692 ). По-видимому, именно так можно назвать прибор, позволяющий секвенировать индивидуальные геномы за 1000 рублей.

Наглядно сопоставить характеристики PGM и возможных моделей DM позволяет приведённая ниже таблица.

Сравнение Personal Genome Machine и Dream Machine

Параметры PGM DM

Стоимость прибора 50 тыс.$ 1 млн. руб. (35 тыс.$)Стоимость расходных материалов:а) на один рабочий циклб) на геном человека

500 $~500 тыс.$

100 руб. (3,5 $)1 тыс. руб. (35 $)

Длина чтения 100…200 п.о. 400…800 п.о.Продолжительность рабочего цикла 2 часа 2…10 часов Разрешение чипа 1,55 Mp 12…16 MpСтоимость чипа 250 $ 250 руб. (<10$)Эффективность использования pH-сенсоров 10% 50%Многократное использование чипа - +Многократное использование реагентов - +Количество проточных ячеек 1 8, 16 или 96Производительность рабочего цикла 10…100 млн.п.о. 10…100 млрд.п.о.

Особенности национального секвенированияВ мире сейчас насчитывается около трёх тысяч геномных секвенаторов. В России на

сегодняшний день имеется 19 приборов такого типа (4 FLX, 2 GS Junior; 6 SOLiD 2…4; 6 GA IIx, 1 HiSeq 2000), которые, как правило, простаивают из-за отсутствия дорогих реагентов.

В конце октября прошлого года в мире было оцифровано 2700 индивидуальных геномов человека. В конце 2009 года с большой помпой было объявлено о выдающемся достижении отечественных учёных – о секвенировании первого генома, принадлежащего «русскому мужчине». Других новостей с тех пор не слышно.

Таким образом, доля российских секвенаторов на мировом рынке NGS не превышает 0,7%. Из них только HiSeq 2000 вполне современен. Остальные можно отнести к морально устаревшим.

9

Интересно, что этот единственный российский HiSeq 2000 был приобретён на деньги спонсора (http://grostok.ru/i/press/?id=8). При действующей медлительной системе госзакупок приобрести самую последнюю модель геномного секвенатора практически невозможно, поскольку смена их поколений происходит ежегодно.

Можно ли изменить эту ситуацию? Не можно, а нужно.

Что для этого нужно сделать?Изыскать финансирование и найти специалистов, которые смогут разработать секвенатор

DM, технологии получения и очистки реагентов, системы пробоподготовки, биоинформационное обеспечение и т.п..

Кто будет этим заниматься?Думайте сами. Извините, но мне одному это не потянуть.

*******************************************************************************************************************************

Мнения специалистов

Vadim Volkov vadim.s.volkov(at)googlemail.com

Геном за 1000 рублей никому не нужен. И не будет нужен. Есть разумный предел удешевления технологии, дальше уже никто не будет работать.

Про секвенирование - создание с 0 отечественных приборов – можно забыть. Это и не нужно. Есть международное разделение труда. И у РФ есть свои области, где она вполне конкурировать может. Если наладить нормальную доставку реактивов и убрать наценки - то все будет легко и просто. Убрать паразита просто нужно. И заставить его работать.

Chemeris AV chemeris(at)anrb.ruЯ все ж таки думаю, что будущее за мономолекулярными методами. Сомнительно

выглядит возможность очистки в самом приборе отработанных реагентов. Слишком уж они разные - полимераза и трифосфаты и пр. И от чего собственно очищать?!

comp3v http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=450189&st=0&p=1170155#… не очень понравилась идея в начале текста - дескать, свой секвенатор надо делать потому, что у нас посредники много берут за импорт. Наши грёбаные таможенные барьеры и так создают кучу проблем всем учёным, поэтому я не приветствую тезисы, которые могут быть восприняты как оправдание оных.

Dima11 http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=450189&st=0&p=1170155#… разработка российского секвенатора для набора российской статистики нецелесообразна по причине сроков. К моменту запуска прототипа количестве геномов секвенированных на «вражеских» секвенаторах перевалит глубоко за 10000.Эпитафия: «хороша ложка к обеду».

michail-k http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=450189&st=0#

Хорошо, что со временем определение генома станет более дешевым. Почему-то очень мало секвенаторов в стране, думал их больше. Странное отставание от всего мира.

10