Всероссийский научно-

исследовательский институт

экспериментальной ветеринарии

имени Я.Р.Коваленко

Россельхозакадемии

ЛАБОРАТОРИЯ ИММУНОЛОГИИ

115 лет

Государственному научному учреждению

«Всероссийский научно-

исследовательский институт

экспериментальной ветеринарии

имени Я.Р.Коваленко

Россельхозакадемии»

Москва - 2013

Директор ГНУ ВИЭВ

Россельхозакадемии,

доктор ветеринарных наук, профессор,

Заслуженный деятель науки РФ,

академик Российской академии

сельскохозяйственных наук

Михаил Иванович Гулюкин

Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) – первое научно-исследовательское учреждение России, заложившее фундамент ветеринарной науки. ВИЭВ разрабатывает теоретические и фундаментальные основы профилактики, диагностики и терапии инфекционных болезней различных видов животных. В настоящее время институт проводит исследования в области микробиологии, вирусологии, протозоологии, микологии, иммунологии и эпизоотологии 35-ти нозологических единиц, среди которых сибирская язва, бешенство, туберкулез, паратуберкулез, бруцеллез, сальмонеллез, пастереллез, трихофития, трипаносомоз, лейкоз, инфекционная анемия лошадей, губкообразная энцефалопатия и др.

С 1930 г. прошлого века и по настоящее время институт осуществляет подготовку научных кадров через аспирантуру. За это время на Диссертационном совете ВИЭВ было защищено 185 докторских и 1203 кандидатских диссертаций. В институте с 1996 г. функционируют референтные лаборатории МЭБ по случной болезни и ринопневмонии лошадей.

ВИЭВ располагает высококвалифицированными научными кадрами, среди которых 22 доктора ветеринарных и биологических наук, в том числе один академик РАСХН, 12 профессоров, 6 заслуженных деятелей науки России, 52 кандидата наук, 4 лауреата Государственной премии, 11 лауреатов премии Совета Министров СССР и Премии Правительства РФ в области науки и техники, 4 заслуженных ветеринарных врача РФ.

ЛАБОРАТОРИЯ

ИММУНОЛОГИИ

(создана в 1967 г. академиком

ВАСХНИЛ Я.Р.Коваленко)

Зав. лабораторией И.Ю.Ездакова

Иммунология как наука возникла из практической необходимости защиты человека и животных от инфекционных болезней. Первые

прививки путем инокуляции содержимого оспенных пустул здоровым людям проводили за тысячу лет до нашей эры. В конце XVIII века английским врачом Э.Дженнером был разработан метод вакцинации (от

лат. vacca – корова). Но появление иммунологии как науки связано с именем выдающегося французского ученого Луи Пастера. В 1880 г.

Л.Пастер сформулировал принцип создания вакцин, а именно снижение вирулентности антигена при сохранении его иммуногенности.

Проблема борьбы с инфекционными заболеваниями, снижение уровня их распространения стала основной задачей научно-исследовательских институтов, таких как, Институт экспериментальной

ветеринарии. Изучение различных аспектов иммунитета позволило разработать новые методы лечения и профилактики ряда бактериальных

и вирусных заболеваний животных, таких как чума и рожа свиней, бруцеллез, туберкулез и др. В результате научных исследований был внедрен целый ряд ценных диагностических методов и средств

специфических профилактики. Огромный вклад в ветеринарную иммунологию внес академик

ВАСХНИЛ Яков Романович Коваленко, создавший в 1967 г. лабораторию иммунитета (впоследствии лаб. иммунологии). Уже в те годы стало очевидно, что для обеспечения эпизоотического благополучия в

условиях высокой концентрации животных необходим постоянный мониторинг за состоянием иммунной системы с учетом таких факторов

как кормление, условия содержания, физиологическое состояние, а также изменение вирулентности микроорганизмов.

Академик ВАСХНИЛ Я.Р.Коваленко

Впервые в России, под руководством академика Я.Р.Коваленко, были проведены исследования по разработке методов диагностики и

борьбы с африканской чумой свиней (Б.Г.Иванов, А.Г.Бахтин, Е.П.Исаенко, М.А.Сидоров, Л.Г.Бурба, В.К.Кретинин и др.), изучению и серологической характеристике микоплазм с целью разработки методов

дифференциации (М.А.Сидоров, И.А.Яблонская, Э.А.Шегидевич и др.). По результатам этих исследований были изданы монографии

«Африканская чума свиней» (1965,1972гг.) и «Микоплазмозы животных» (1976 г.).

Под руководством профессора Я.Р.Коваленко были проведены

первые опыты по изучению формирования вакцинального иммунитета у молодняка, полученного от иммунных матерей (И.А.Яблонская). В

результате проведенных экспериментов было установлено, что ɣ-глобулины в сыворотке крови поросят от иммунных и неиммунных свиноматок до приема ими молозива отсутствуют. В реакции

агглютинации с паратифозными антигенами с сывороткой крови телят, также как и поросят, ɣ-глобулинов не было обнаружено до

приема молозива. Через сутки после рождения и приема молозива от иммунных к паратифу коров у телят титр агглютининов сыворотки крови

был наиболее высок, а к 30-дневному возрасту титр агглютининов становился незначительным. Таким образом, экспериментально было доказано, что у коров и свиней отсутствует трансплацентарная передача

антител. При активной иммунизации телят и поросят, выращенных под

иммунными против паратифа матерями, колостральный иммунитет задерживает у них образование специфических антител, а напряженность приобретенного вакцинального иммунитета зависит от

состояния у них пассивного колострального иммунитета. Научные сотрудники лаборатории иммунологии под руководством

Я.Р.Коваленко в 60-е, 70-е годы ХХ века проводили исследования, направленные на изучение влияния различных факторов на

поствакцинальный иммуногенез сельскохозяйственных животных. Экспериментальные исследования М.А.Сидорова, Н.Т.Татаринцева, И.А.Яблонской, И.Д.Фесенко, Ю.Н.Федорова, В.И.Варганова,

В.З.Бондаренко позволили определить оптимальные сроки вакцинации, негативное влияние на иммунореактивность недостатка в рационе

перевариваемого протеина, аминокислот, стресса и радиации, пути передачи антител от матерей потомству, принципы иммунопрофилактики болезней новорожденных животных.

За цикл работ по ветеринарной иммунологии Я.Р.Коваленко в 1977 году был награжден золотой медалью им.С.Н.Вышелесского.

Научные сотрудники лаборатории иммунитета (М.Н.Соколов, Э.А.Шегидевич, И.А.Яблонская)

В эти годы в лаборатории велись исследования по изучению роли различных вирусов, пастерелл, микоплазм, кишечной палочки в

этиологии респираторных, желудочно-кишечных болезней овец и крупного рогатого скота (Э.А.Шегидевич, М.Н.Соколов, А.П.Брылин).

Все эксперименты были направлены на поиск сведений о

механизмах формирования поствакцинального иммунного ответа для определения принципов устойчивости животных к инфекционным заболеваниям при массовой иммунизации.

Развитие ветеринарной иммунологии в области инфекционной патологии, изучение механизмов взаимодействия макро- и

микроорганизма, биосинтеза протективных антител неразрывно связано с разработкой диагностических препаратов и внедрением новых

методов, в основе которых лежат современные знания в области иммунологии. В разные годы этими исследованиями занимались научные сотрудники лаборатории иммунологии И.Д.Фесенко, М.Ю.Горбунова,

С.О.Кадыров, И.Ю.Ездакова, Т.А.Чеботарева, В.К.Сологуб, О.А.Верховский, В.И.Кис, М.И.Кузнецова, И.В.Третьякова, А.И.Жаданов.

Индикация уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови и секреторных жидкостях организма животных является одним из основных тестов для диагностики острых инфекций, первичных и вторичных иммунодефицитов, оценки эффективности применения вакцин и иммуномодуляторов, воздействия различных факторов среды и оценки иммунного статуса. Для этого необходимы моноспецифические антисыворотки к иммуноглобулинам животных.

Значительный объем исследований лаборатории был посвящен

разработке технологии получения и использования моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам крупного и мелкого рогатого скота, свиней для оценки состояния иммунной системы организма. На

основании проведенных исследований разработаны «Наборы компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в

биологических жидкостях крупного рогатого скота и свиней методом радиальной иммунодиффузии», утвержденным Министерством Сельского хозяйства и продовольствия РФ (1996 г.).

Известно, что поликлональные антисыворотки имеют такие недостатки, как гетерогенность и низкая активность, зависимая от

животных-продуцентов антител. Поэтому использование в иммунохимических тест-системах моноклональных антител (МкА) определенной специфичности значительно повышает диагностическую

значимость исследуемых параметров. Разработанная Г.Келером и Ц.Мильштейном технология получения гибридом, продуцирующих

моноклональные антитела заданной специфичности, открыла новые пути в иммунологических исследованиях. В связи с этим в лаборатории

началась серия экспериментов по гибридизации клеток лимфоцитов иммунизированных мышей BALB/c с клетками миеломы Sp 2/0. Были получены гибридомы-продуценты МкА к иммуноглобулинам классов M

и A крупного рогатого скота. В процессе экспериментов получено и протестировано более 10000 первичных гибридных клеточных клонов.

С помощью иммунологических и электрофоретических методов была

определена иммунохимическая характеристика МкА. Показана возможность использования полученных МкА для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма

животных методами «сэндвич»-ИФА и РИД. Проведены исследования по определению перекрестной видоспецифичности полученных МкА с

целью создания универсальных диагностических тест-систем для идентификации и количественного определения иммуноглобулинов в

биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец. Также были получены моноклональные антитела к отдельным изотипам иммуноглобулинов свиней и с их помощью изучена структура и

функциональные свойства антител. Эти исследования и в настоящее время остаются уникальными в отечественной ветеринарной

иммунологии. Для оценки любого компонента иммунной системы предлагается

большой набор тестов, позволяющих идентифицировать различные

стадии развития и составные части этой системы. При этом необходимо выбрать такой комплекс тестов, который позволяет получить наиболее

значимую информацию о состоянии иммунной системы. Иммунодиагностика требует применения стандартного набора тестов, позволяющих оценивать функциональное состояние отдельных звеньев

иммунной системы. Пользуясь этими методами, можно было бы решать проблемы весьма широкого спектра – от постановки лабораторного

диагноза иммунодефицита до выяснения функционального состояния Т-, В- и фагоцитарного звеньев иммунитета.

За последние годы иммунология стала экспериментальной наукой с ясными предметами исследования (компоненты иммунной системы) и специфическими методами исследований. Но развитие любой науки это

не только новые идеи, но и новые методики. Именно методологические возможности лежат в основе развития современной науки.

Внедрение новой методологии должно основываться на хорошо изученных традиционных подходах. Так, например, известная с 50-х годов прошлого столетия реакция розеткообразования открыла новые

методические возможности в изучении функциональной и рецепторной общности иммуноцитов у различных видов животных. Данная реакция,

наряду с методами иммуноцитохимии, отражает изменения поверхностных структур клетки, которые происходят в процессе онто- и иммуногенеза. С помощью этой методики в лаборатории иммунологии

была проведена оценка рецепторной активности лимфоцитов лабораторных животных при введении иммунотропных препаратов,

вакцин, Т-зависимых и Т-независимых антигенов. Лаборатория проводила исследования в рамках Государственного

контракта по ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным

направлениям развития науки и техники на 2002-2006 гг.» Министерства

промышленности науки и технологий РФ. Трудности при изучении молекулярных механизмов, лежащих в

основе межклеточных взаимодействий, стимулируют поиск новых и

усовершенствование уже известных методов исследования. Использование оптимизированных для различных групп животных

иммунологических методов – залог дальнейших исследований в эволюционной иммунологии, одним из основных направлений которой

является изучение филогенетической связи между врожденным и приобретенным иммунитетом.

Оригинальные результаты получены при исследовании

фагоцитарной активности клеток серебряного карася. В мазках крови были обнаружены эритроциты, захватившие частицы зимозана и тест-

микроб St.aureus. Несомненно, вопрос о фагоцитарных свойствах эритроцитов рыб и земноводных остается дискуссионным, поскольку данные имеют противоречивый характер. С нашей точки зрения,

эритроциты рыб, обладая всеми клеточными структурами (ядро, ядрышко, эндоплазматическая сеть, митохондрии, комплекс Гольджи и

др), в определенных условиях могут проявлять фагоцитарные свойства. В любом случае, вопрос о способности ядерных эритроцитов к фагоцитозу требует дальнейших исследований, так как это представляет

несомненный интерес в познании эволюции иммунной системы. Сотрудниками лаборатории иммунологии проведена большая

работа по усовершенствованию и оптимизации методов исследования иммунокомпетентных клеток. Изучена количественная динамика

антителообразующих клеток ELISPOT-методом, CD2-, CD19-клеток лабораторных животных методом иммунофлуоресценции в процессе иммуногенеза. В экспериментах in vitro, проведенных в лаборатории

иммунологии установлено, что IgSF-рецепторы (члены суперсемейства иммуноглобулинов) клеток определяют функциональную способность

лимфоцитов к распознаванию чужеродных агентов. Проведены исследования по выделению иммуноглобулинов классов

G, М и А, а также гамма-глобулинов из гипериммунной сыворотки крови

овец, полученной на капсульный антиген P.multocida серовариантов А, В и D с использованием хроматографических методов (гель-фильтрация,

ионообменная хроматография) и иммуноэлектрофореза. Полученные иммунохимически чистые иммуноглобулины отдельных классов использованы в тест-системах для серотиповой идентификации

P.multocida. В настоящее время проводятся исследования механизма формирования поствакцинального иммунного ответа при пероральном

введении лизат-вакцины против сальмонеллеза свиней (диплом «100 лучших изобретений России 2012 г.»).

Сотрудниками лаборатории иммунологии на основании результатов

проведенных экспериментов разработан способ выделения иммуноглобулина А из биологической жидкости крупного рогатого скота, разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток

для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М. По результатам

этих исследований было получено 5 патентов на изобретение. В процессе исследований систематизированы экспериментальные

данные о функционально-рецепторной характеристике белков суперсемейства иммуноглобулинов, с помощью которых сделаны выводы по методическому подходу к изучению иммунной системы животных, а

также даны рекомендации, которые позволяют интенсифицировать исследования в области ветеринарной иммунологии.

Разработаны и утверждены Отделением ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук методические рекомендации по оценке естественной резистентности

сельскохозяйственных животных, количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток

животных, определению поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методами иммуноцитохимии, методические наставления по использованию моноклональных антител для оценки уровня

иммуноглобулинов классов М и А в биологических жидкостях крупного рогатого скота и овец, методические положения по конъюгированию

поли- и моноклональных антител с пероксидазой методом периодатного окисления.

Научными сотрудниками лаборатории иммунологии получены: серебряная медаль на Российской агропромышленной выставке ЗОЛОТАЯ ОСЕНЬ «За Способ получения секреторного иммуноглобулина

А крупного рогатого скота» в 2006 г. и золотая медаль «За способ определения антител в иммуноцитохимическом анализе» в 2008 г.;

медали «Лауреат ВВЦ» в 1998, 2008, 2012, 2013 гг. за разработку препаратов для оценки состояния иммунной системы животных. Изданы монографии «Иммунодефициты домашних животных», «Основы

иммунологии и иммунопатологии собак», «Рецепторы иммунного узнавания у животных».

Результаты научных исследований, проведенных в лаборатории, были представлены на международной конференции «Физиология и патология иммунной системы», посвященной 100-летию присуждения

И.И.Мечникову Нобелевской премии и 25-летию со дня основания Всесоюзного научного общества иммунологов, VII съезде аллергологов и

иммунологов СНГ, Московском международном ветеринарном Конгрессе.

Расширение и углубление наших знаний с помощью

разрабатываемых в лаборатории иммунологии методов в области изучения молекулярной, клинической, эволюционной и экологической иммунологии позволит понять механизмы невосприимчивости организма

животных, что откроет новые возможности для эффективной борьбы с инфекционными болезнями.

В настоящее время лаборатория иммунологии ВИЭВ успешно продолжает научные исследования, начатые Яковом Романовичем

Коваленко по изучению механизмов формирования поствакцинального иммунного ответа на различные типы вакцин, а также разрабатывает новые подходы в исследовании клеточных и молекулярных аспектов

онто- и иммуногенеза у животных.

Аспирантка лаборатории иммунологии М.С.Ефремова

Научные сотрудники лаборатории иммунологии ВИЭВ проводят

исследования иммуноглобулинового профиля биологических жидкостей и иммунокомпетентных клеток, разрабатывают методы изучения состояния иммунной системы различных видов животных. В лаборатории получены

моноспецифические антисыворотки и моноклональные антитела к иммуноглобулинам различных видов животных для их количественного

определения методами иммунодиффузии, иммуноцитохимического и иммуноферментного анализа.

«Вирусы, бактерии и паразиты зондируют пределы возможностей

иммунного реагирования и иммунитета, и это предоставляет отличную возможность для оценки биологических, физиологических и молекулярных аспектов иммунного ответа»

Рольф Цинкернагель, лауреат Нобелевской премии 1996 г.

Основные показатели скринингового обследования

Количественное определение иммуноглобулинов

в биологических жидкостях крупного и мелкого

рогатого скота методом простой радиальной

иммунодиффузии (РИД) и ИФА.

Определение лейкоформулы

Определение фагоцитарной активности

Методические рекомендации по определению sIg В-клеток (иммунопероксидазное окрашивание)

В методических рекомендациях описан метод исследования поверхностных иммуноглобулинов В-лимфоцитов, который может быть использован как в

фундаментальных (изучение механизма дифференцировки В-клеток в процессах онто- и иммуногенеза животных), так и в

прикладных (количественное определение В-лимфоцитов) иммунологических исследованиях. Способ основан на использовании специфических

реагентов к Ig крупного рогатого скота (поли- и моноклональные антитела), что позволяет изучать различные формы распределения Ig-

рецепторов на мембране клетки и определять количество В-клеток. Разработанный метод определения поверхностных Ig состоит из двух

этапов: выделения мононуклеарных клеток и проведения иммуноферментного анализа.

Методические рекомендации

Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом иммунофлуоресценции

Реакция иммунофлуоресценции широко применяется в иммунологических исследованиях и

обладает значительной информативностью при иммунофенотипировании лимфоцитов. Метод имеет следующие преимущества: высокая специфичность,

быстрота реакции, возможность одновременной цитологической оценки клеток.

Иммунофлуоресценция может быть

использована как в фундаментальных (изучение механизма дифференцировки В-клеток в процессах

онто- и иммуногенеза животных), так и в прикладных (определение субпопуляций В-

лимфоцитов) исследованиях в зависимости от выбора моноклональных антител.

Методические наставления по использованию моноклональных антител для оценки уровня

иммуноглобулинов классов М и А в биологических жидкостях крупного

рогатого скота и овец

В лаборатории иммунологии на основе полученных моноклональных антител к IgM и IgA рогатого скота

приготовлены реагенты для количественного определения уровня иммуноглобулинов классов М и А в РИД и ИФА. Данные реагенты можно

использовать для анализа гуморального звена иммунитета крупного рогатого скота и овец.

РЕЦЕПТОРЫ ИММУННОГО УЗНАВАНИЯ У ЖИВОТНЫХ

В книге изложены современные представления о рецепторах иммунокомпетентных клеток, относящихся

по своему строению к семейству иммуноглобулинов. Обобщены и проанализированы материалы зарубежных и

отечественных ученых, а также данные, полученные лично автором.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

92,5 46,25 23,12 11,56 5,78 2,89 1,44 0,72

мкг/мл

Оп

тиче

ская

пл

отн

ост

ь

Адрес: 109428, Москва, Рязанский проспект, 24, к.1, ВИЭВ, лаб.

иммунологии: (495) 785-84-26, факс (495) 785-84-25,

e-mail: immsys@mail.ru

Опытная база ВИЭВ о. Лисий