ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1ο

Ενζυμική Δράση

«Πιστεύω ότι τα ένζυμα είναι μόρια που έχουν συμπληρωματική δομή με ενεργοποιημένα

σύμπλοκα των αντιδράσεων που καταλύουν, δηλαδή με τη μοριακή διαμόρφωση που είναι ενδιάμεση μεταξύ των αντιδρώντων ουσιών

και των προϊόντων της αντίδρασης, για αυτές τις καταλυόμενες πορείες. Έτσι η έλξη του

ενζύμου για το ενεργοποιημένο σύμπλοκο θα μπορούσε να οδηγήσει σε μία ελάττωση της

ενέργειάς του, και ως εκ τούτου σε μία ελάττωση της ενέργειας ενεργοποίησης της

αντίδρασης και σε μία αύξηση της ταχύτητας της αντίδρασης»Linus Pauling

Nature 161:707(1948).

Μετά το τέλος του κεφαλαίου θα είστε σε θέση: Να αναγνωρίζετε τα ένζυμα ως υψηλού βαθμού εξειδίκευσης

πρωτεϊνικούς βιοκαταλύτες. Να διατυπώνετε τις διαφορές μεταξύ ενζύμων και ανοργάνων

καταλυτών. Να ελέγχετε τη δυνατότητα πραγματοποίησης μιας

αντίδρασης μέσω της ΔG και το ρόλο του ενζύμου στην ελάττωση της ΔG≠ δημιουργώντας έναν εναλλακτικό μηχανισμό.

Να διακρίνετε το ρόλο των ενζύμων στη σταθεροποίηση της μεταβατικής κατάστασης, και να διατυπώνετε τα χαρακτηριστικά των ενεργών κέντρων.

Να περιγράφετε το μοντέλο Michaelis-Menden που εξηγεί τις κινητικές ιδιότητες πολλών ενζύμων: Να εξηγείτε τη φυσική σημασία των Km, Vmax, Kcat.

Να διατυπώνετε τις γραμμικές τροποποιήσεις της εξίσωσης Michaelis-Menden

Να διακρίνετε τη συναγωνιστική από τη μη συναγωνιστική αναστολή.

Να διατυπώνετε τους παράγοντες που επηρεάζουν τη δράση των ενζύμων και τον τρόπο επίδρασης του κάθε παράγοντα.

Να ελέγχετε τις γνώσεις που αποκτήθηκαν με την επίλυση διαφόρων τύπων ερωτήσεων και προβλημάτων.

1

1.1 Τα ένζυμα είναι ισχυροί και σε μεγάλο βαθμό εξειδικευμένοι καταλύτες.

Οι καταλύτες στα βιολογικά συστήματα είναι ένζυμα και σχεδόν όλα τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες.

Τα ένζυμα είναι πολύ εξειδικευμένα και έχουν μεγάλη καταλυτική ισχύ. Μπορούν να αυξήσουν τις ταχύτητες των αντιδράσεων κατά παράγοντες της τάξης του 106 ή και περισσότερο.

Πολλά ένζυμα χρειάζονται συμπαράγοντες για τη δραστικότητα. Τέτοιοι συμπαράγοντες μπορεί να είναι ιόντα μετάλλων ή μικρά οργανικά μόρια που προέρχονται από βιταμίνες και ονομάζονται συνένζυμα.

Τα ένζυμα είναι βιοκαταλύτες, δηλαδή βιομόρια που επιταχύνουν τις χημικές αντιδράσεις. Η ομαλή εξέλιξη των μεταβολικών λειτουργιών θα ήταν αδύνατη αν δεν υπήρχε η γενετικά καθορισμένη «δεξαμενή» των ενζύμων που βρίσκεται σε όλα τα κύτταρα. Οι περισσότεροι μηχανισμοί που ελέγχουν τις μεταβολικές διεργασίες περιλαμβάνουν ένζυμα, και η ρύθμιση των ενεργοτήτων αυτών των ενζύμων επιτρέπει στο μεταβολισμό να ανταποκρίνεται με ευλυγισία στις μεταβαλλόμενες συνθήκες του περιβάλλοντος.

Σχήμα Αριστερά: Ηλεκτρονιομικρογραφία μορίων της DNA πολυμεράσης (άσπρα σφαιρίδια) που έχουν προσδεθεί σε ένα συνθετικό εκμαγείο DNA που μοιάζει με νήμα.Σχήμα Δεξιά: Μοντέλο κορδέλας του ενζύμου DNA πολυμεράση.

Τα ένζυμα, οι καταλύτες των βιολογικών συστημάτων, είναι αξιοθαύμαστα μόρια που προσδιορίζουν τον τρόπο των χημικών μετασχηματισμών και μεσολαβούν στον μετασχηματισμό των διαφόρων μορφών ενέργειας. Τα κυριότερα χαρακτηριστικά των ενζύμων είναι η καταλυτική τους ισχύς, η εξειδίκευσή τους και ακόμη το γεγονός ότι σε πολλά ένζυμα γίνεται ρύθμιση της δράσης τους. Σχεδόν όλα τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες. Η σχετικά πρόσφατη ανακάλυψη καταλυτικά ενεργών μορίων RNA δείχνει ότι οι πρωτεΐνες δεν έχουν το αποκλειστικό μονοπώλιο της κατάλυσης.Οι πρωτεΐνες ως μακρομόρια, καταλύουν πολύ αποτελεσματικά διάφορες χημικές αντιδράσεις λόγω της ικανότητάς τους να προσδένουν εξειδικευμένα μία ευρεία

2

τάξη μορίων. Τα ένζυμα χρησιμοποιώντας ολόκληρο το απόθεμα των ενδομοριακών τους δυνάμεων, φέρνουν κοντά τα υποστρώματα και τα προσανατολίζουν κατάλληλα πράγμα που είναι προϋπόθεση για τη διάσπαση και το σχηματισμό των χημικών δεσμών. Στην ουσία, τα ένζυμα καταλύουν αντιδράσεις σταθεροποιώντας την μεταβατική κατάσταση (την υψηλότερη ενεργειακά διαμόρφωση) στις πορείες των αντιδράσεων. Ένα ένζυμο πραγματοποιεί αυτή τη λειτουργία επιλεκτικά και προσδιορίζει ποια από τις αντιδράσεις που μπορούν να πραγματοποιηθούν λαμβάνει χώρα. Επίσης τα ένζυμα δρουν ως μοριακοί διακόπτες με το να ρυθμίζουν την καταλυτική δραστικότητα και να μετασχηματίζουν ενέργεια, εξ’ αιτίας της ικανότητάς τους να επιτυγχάνουν σύζευξη των δράσεων σε διαφορετικές περιοχές πρόσδεσης, κάτι που σύντομα ονομάζεται αλλοστερική συμπεριφορά. Τα ένζυμα είναι πολύ ειδικά στην αντίδραση που καταλύουν όσο και στην επιλογή των αντιδρώντων που ονομάζονται υποστρώματα. Ένα ένζυμο καταλύει συνήθως μία απλή χημική αντίδραση ή μία σειρά από πολύ συγγενικές αντιδράσεις. Στις ενζυμικές αντιδράσεις σπανίως συμβαίνουν παράπλευρες αντιδράσεις που οδηγούν στον άχρηστο σχηματισμό παραπροϊόντων, σε αντίθεση με τις αντιδράσεις που δεν καταλύονται. Ο βαθμός εξειδίκευσης του ενζύμου για το υπόστρωμα είναι συνήθως υψηλός και μερικές φορές στην ουσία απόλυτος. Όλα αυτά θα τα αναλύσουμε στα κεφάλαια που ακολουθούν.

Παράδειγμα 1: Τα πρωτεολυτικά ένζυμα καταλύουν την υδρόλυση ενός πεπτιδικού δεσμού.

Τα περισσότερα πρωτεολυτικά ένζυμα καταλύουν την υδρόλυση ενός εστερικού δεσμού που είναι μία διαφορετική αλλά σχετική αντίδραση: Εστέρας + Νερό Οξύ + Αλκοόλη

Τα πρωτεολυτικά ένζυμα διαφέρουν σημαντικά στον βαθμό εξειδίκευσης που έχουν για το υπόστρωμα.

Η σαμντιλυσίνη, η οποία προέρχεται από ορισμένα βακτήρια, δεν ξεχωρίζει τη φύση των πλευρικών αλυσίδων που βρίσκονται εκατέρωθεν του πεπτιδικού δεσμού που πρόκειται να διασπαστεί. Η σαμντιλυσίνη περιέχεται σε σκευάσματα για τον εβδομαδιαίο πρωτεϊνικό καθαρισμό των φακών επαφής.

Η θρυψίνη είναι απολύτως εξειδικευμένη στο να καταλύει τη διάσπαση των πεπτιδικών δεσμών των οποίων το καρβοξυλικό άκρο προέρχεται από λυσίνη ή αργινίνη.

Η χυμοθριψίνη διασπά τους πεπτιδικούς δεσμούς των πρωτεϊνών στο καρβοξυλικό άκρο αρωματικών, ή ογκοδών αλειφατικών καταλοίπων.

Η θρομβίνη είναι ένα ένζυμο που συμμετέχει στην πήξη του αίματος, και είναι περισσότερο εξειδικευμένη από τη θρυψίνη. Καταλύει την υδρόλυση των δεσμών Arg-Gly μόνο σε ειδικές αλληλουχίες πεπτιδίων.

Παράδειγμα 2: Η DNA πολυμεράση Ι, η οποία είναι ένα ένζυμο που καθοδηγείται από εκμαγείο, και είναι ένας άλλος καταλύτης με υψηλή εξειδίκευση. Η αλληλουχία νουκλεοτιδίων της συντιθέμενης αλυσίδας DNA προσδιορίζεται από την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων σε μία άλλη αλυσίδα DNA που χρησιμεύει ως εκμαγείο. Η DNA πολυμεράση Ι μεταφέρει τις πληροφορίες που δίνονται από το εκμαγείο με αξιοθαύμαστη ακρίβεια. Η πιθανότητα λάθους στην εισαγωγή των νουκλεοτιδίων στην νεοσχηματιζόμενη αλησίδα DNA, είναι μικρότερη από μία στο εκατομμύριο, γιατί η DNA πολυμεράση πραγματοποιεί διορθωτική ανάγνωση στο νεοσχηματιζόμενο προϊόν και απαλείφει τα λάθη της.

3

1.2 Χαρακτηριστικά των ενζύμων. Γενικά χαρακτηριστικα

Μέτρηση ενζυμικής ενεργότητας Ενζυμική ονοματολογία

Α. Είναι βιοκαταλύτες: Τα ένζυμα έχουν κοινά στοιχεία με τους κλασικούς χημικούς καταλύτες αλλά και αρκετές διαφορές.

1. Κοινές ιδιότητες με τους ανόργανους καταλύτεςa) Τα ένζυμα ούτε καταναλώνονται ούτε παράγονται. Παραμένουν

αναλοίωτα κατά την πορεία της αντίδρασης.b) Τα ένζυμα δεν προκαλούν έναρξη της αντίδρασης που καταλύουν.

Επιταχύνουν αντιδράσεις οι οποίες θα πραγματοποιούνταν και απουσία τους, αλλα με πολύ μικρότερη ταχύτητα. Με άλλα λόιγια δεν μεταβάλλουν τις σταθερές ισορροπίας των αντιδράσεων που καταλύουν.

2. Διαφορές μεταξύ ενζύμων και ανοργάνων καταλυτών.c) Τα ένζυμα είναι σχεδόν όλα πρωτεΐνες.

d) Τα ένζυμα παρουσιάζουν υψηλή εξειδίκευση για τις αντιδράσεις που καταλύουν, και παράγουν μόνο τα αναμενόμενα προϊόντα από δοσμένα υποστρώματα (αντιδρώντα). Δηλαδή δεν υπάρχουν παράπλευρες αντιδράσεις με σχηματισμό παραπροϊόντων.

e) Τα ένζυμα συχνά παρουσιάζουν υψηλή εξειδίκευση ως προς το υπόστρωμα, αν και μερικά ένζυμα έχουν μικρότερη εξειδίκευση, χρησιμοποιώντας περισσότερα του ενός υποστρώματα.

f) Τα ένζυμα λειτουργούν σε μέσες (όχι ακραίες) τιμές ΡΗ και θερμοκρασίας.

Β. Μέτρηση της ενζυμικής ενεργότητας:

1.Μονάδα ενζυμικής ενεργότητας: είναι συνήθως ισοδύναμη με την ποσότητα ενζύμου που καταλύει το σχηματισμό 1 μmol

4

υποστρώματος ανά λεπτό κάτω από τις βέλτιστες συνθήκες προσδιορισμού.2.Ειδική ενεργότητα: είναι ο αριθμός των μονάδων ενζυμικής ενεργότητας ανά mg πρωτεΐνης.

3.Αριθμός μετατροπής, ή Kcat είναι ο αριθμός μορίων υποστρώματος που μεταβολίζονται ανά μόριο ενζύμου στη μονάδα του χρόνου.

C. Ενζυμική ονοματολογία. Σήμερα είναι γνωστά περίπου 2000 ένζυμα. Η Διεθνής Ένωση Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας (IUMB) ανέπτυξε ένα σύστημα στο οποίο τα ένζυμα χωρίζονται σε έξι κύριες τάξεις: Καθεμία διαιρείται σε υποτάξεις. Το σύστημα αυτό λαμβάνει υπ’ όψιν την αντίδραση στην οποία το ένζυμο εξειδικεύεται καθώς και το υπόστρωμα πάνω στο οποίο δρα.Όλα τα ένζυμα περιλαμβάνονται σε έναν Ενζυμικό Κατάλογο Enzyme Catalogue. Σε κάθε ένζυμο αντιστοιχεί ο EC Number που περιλαμβάνει 4 αριθμούς που διαχωρίζονται από τελείες. Ο πρώτος αριθμός δείχνει σε ποια από τις 6 κύριες τάξεις ανήκει το ένζυμο. Ο δεύτερος αριθμός δείχνει την υποτάξη. Ο τρίτος αριθμός την υπο-υποτάξη και ο τέταρτος τον σειριακό αριθμό του ενζύμου στην υπο-υποτάξη.

Η κατάληξη –αση είναι προσαρμοσμένη σε μία αρκετά πλήρη περιγραφή της χημικής αντίδρασης που καταλύεται. Για παράδειγμα:3-φωσφορική γλυκεραλδεύδη: NAD οξειδορεδουκτάση.

1.3 Η ελεύθερη ενέργεια G είναι μια χρήσιμη θερμοδυναμική

συνάρτηση για την κατανόηση των ενζύμων.

Η ελεύθερη ενέργεια G είναι η πλέον χρήσιμη θερμοδυναμική παράμετρος για τον προσδιορισμό του εάν μια αντίδραση μπορεί να γίνει, καθώς και για την κατανόηση της ενεργειακής θεώρησης της κατάλυσης.

Η ελεύθερη ενέργεια αποτελεί ένα μέτρο της ικανότητας του συστήματος να παράγει χρήσιμο έργο σε σταθερή θερμοκρασία και πίεση.

Μια αντίδραση μπορεί να γίνει αυθόρμητα μόνο όταν η μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας ΔG είναι αρνητική.

Η ΔG μιας αντίδρασης είναι ανεξάρτητη από την πορεία και εξαρτάται μόνο από τη φύση των αντιδρώντων και από τις ενεργότητες (οι οποίες είναι σχεδόν ίσες με τις συγκεντρώσεις τους).

Η μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας μιας αντίδρασης που γίνεται όταν τα αντιδρώντα και τα προϊόντα έχουν ενεργότητα ίση με τη μονάδα, ονομάζεται μεταβολή της πρότυπης ελεύθερης ενέργειας ΔG0.

Οι βιοχημικοί χρησιμοποιούν συνήθως τη ΔG0΄, που είναι η μεταβολή της πρότυπης ελεύθερης ενέργειας σε ΡΗ=7.

Τα ένζυμα δεν μεταβάλλουν τις ισορροπίες των αντιδράσεων, αντιθέτως αυξάνουν τις ταχύτητές τους.

Σε πολλές βιοχημικές αντιδράσεις η ενέργεια των αντιδρώντων μετατρέπεται σε ενέργειες διαφορετικής μορφής. Για παράδειγμα, στη φωτοσύνθεση η ενέργεια του φωτός μετατρέπεται σε ενέργεια χημικού δεσμού. Στα μιτοχόνδρια, η ελεύθερη ενέργεια που περιέχεται στα μικρά μόρια που προσλαμβάνονται με την τροφή, μετατρέπεται σε ελεύθερη ενέργεια της τριφωσφορικής αδενοσύνης (ATP). Στη

5

συνέχεια η ενέργεια χημικού δεσμού της ATP, χρησιμοποιείται με πολλούς και διάφορους τρόπους. Στη μυϊκή συστολή η ενέργεια της ATP μετατρέπεται σε μηχανική ενέργεια. Κύτταρα και οργανίδια έχουν αντλίες που χρησιμοποιούν την ATP για να μεταφέρουν μόρια και ιόντα ενάντια στη χημική και ηλεκτρική βαθμίδωση.

Σχήμα: Ηλεκτρονιομικρογραφία μορίων της αντλίας Καλίου-Νατρίου (Κ/Να ΑΤΡαση) σε μία κυτταρική μεμβράνη. Τα πυκνοσυσκευασμένα μόρια του ενζύμου, καταλύουν με δαπάνη ATP τη ροή ιόντων Na+ και Κ+ έξω και μέσα στα κύτταρα.

Αυτοί οι μετασχηματισμοί εκτελούνται από ένζυμα που είναι αναπόσπαστα τμήματα συγκροτημάτων με υψηλό βαθμό οργάνωσης.Στη θερμοδυναμική ένα σύστημα ορίζεται ως η ύλη που περιέχεται μέσα σε μία καθορισμένη περιοχή. Η ύλη στο υπόλοιπο σύμπαν ονομάζεται περιβάλλον.

Το πρώτο Θερμοδυναμικό αξίωμα ορίζει ότι η συνολική ενέργεια ενός συστήματος και του περιβάλλοντος παραμένει σταθερή. Δηλαδή η συνολική ενέργεια διατηρείται. Η μαθηματική έκφραση του πρώτου θερμοδυναμικού αξιώματος είναι:

Όπου και είναι η εσωτερική ενέργεια του συστήματος στην αρχή και στο

τέλος της διεργασίας, είναι το ποσό θερμότητας που εκλύθηκε ή απορροφήθηκε από το σύστημα, και το έργο που παρήχθη από το σύστημα ή επιτελέστηκε πάνω στο σύστημα. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό στη μαθηματική έκφραση του πρώτου νόμου, είναι ότι η μεταβολή στην εσωτερική ενέργεια ενός συστήματος εξαρτάται μόνο από τις αρχικές και τελικές καταστάσεις και όχι από την πορεία της διεργασίας.

Το πρώτο θερμοδυναμικό αξίωμα δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει εάν μία αντίδραση μπορεί να πραγματοποιηθεί αυθόρμητα. Μερικές αντιδράσεις συμβαίνουν αυθόρμητα ακόμη και αν η είναι θετική (η εσωτερική ενέργεια αυξάνεται). Σε αυτές τις περιπτώσεις το σύστημα απορροφά ενέργεια από το περιβάλλον. Γίνεται επομένως φανερό ότι απαιτείται μία διαφορετική παράμετρος από τη . Μία τέτοια παράμετρος είναι η εντροπία ( ), η οποία είναι ένα μέτρο του τυχαίου ή της αταξίας ενός συστήματος. Η εντροπία ενός συστήματος αυξάνεται όταν αυτό γίνεται περισσότερο άτακτο. Το δεύτερο θερμοδυναμικό αξίωμα ορίζει ότι μία διεργασία μπορεί να συμβεί αυθόρμητα μόνο αν το άθροισμα της της εντροπίας του συστήματος και του περιβάλλοντος αυξάνεται.

για μία αυθόρμητη διεργασία.

Σημειώνουμε εδώ ότι η εντροπία ενός συστήματος μπορεί να ελαττωθεί κατά τη διάρκεια μίας αυθόρμητης διεργασίας, εφ’ όσον η εντροπία του περιβάλλοντος αυξάνεται έτσι ώστε το άθροισμά τους να είναι θετικό. Ο σχηματισμός μίας βιολογικής δομής με υψηλή τάξη είναι θερμοδυναμικά εφικτός, γιατί η ελάττωση της

6

εντροπίας ενός τέτοιου συστήματος αντισταθμίζεται από την αύξηση της εντροπίας του περιβάλλοντος.

Η δυσκολία για τη χρησιμοποίηση της εντροπίας ως κριτήριο για το αυθόρμητο μίας βιοχημικής διαδικασίας είναι ότι δεν μπορούν συνήθως να μετρηθούν οι αλλαγές της εντροπίας των χημικών αντιδράσεων. Επί πλέον το κριτήριο του αυθόρμητου που δίνεται από την έχει ως προϋπόθεση να είναι γνωστές οι μεταβολές της εντροπίας του περιβάλλοντος και του συστήματος. Αυτές οι δυσκολίες αποφεύγονται με τη χρησιμοποίηση μίας διαφορετικής θερμοδυναμικής παραμέτρου που ονομάζεται ελεύθερη ενέργεια (free energy), η οποία συμβολίζεται με το σύμβολο G. Το 1878 ο Josiah Willard Gibbs δημιούργησε τη συνάρτηση της ελεύθερης ενέργειας συνδυάζοντας τον πρώτο και τον δεύτερο νόμο της Θερμοδυναμικής. Η βασική εξίσωση είναι:

Όπου ΔG είναι η μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας του συστήματος που μετασχηματίζεται κάτω από σταθερή πίεση (Ρ) και θερμοκρασία (Τ), ΔΗ είναι η μεταβολή της ενθαλπίας του συστήματος, και ΔS είναι η μεταβολή της εντροπίας του συστήματος. Σημειώνουμε ότι οι ιδιότητες του περιβάλλοντος δεν υπεισέρχονται μέσα σε αυτήν την εξίσωση:

Η μεταβολή της εντροπίας ΔS του περιβάλλοντος θα είναι ευθέως ανάλογη της ποσότητας θερμότητας που έχει μεταφερθεί σε αυτό και αντιστρόφως ανάλογη της θερμοκρασίας του περιβάλλοντος, διότι η εισροή θερμότητας οδηγεί σε μεγαλύτερη αύξηση της εντροπίας στις χαμηλές, παρά στις υψηλές θερμοκρασίες. Στα βιολογικά συστήματα η Τ (απόλυτη θερμοκρασία Kelvin) θεωρείται σταθερή. Αν ορίσουμε το σύνολο της θερμότητας ενός συστήματος ως ενθαλπία (Η), τότε μπορούμε να εκφράσουμε τη σχέση που συνδέει την εντροπία (S) του περιβάλλοντος με τη μεταφερόμενη σε αυτό θερμότητα και τη θερμοκρασία του, ως μία απλή εξίσωση:

Η ολική μεταβολή της εντροπίας καθορίζεται από τη σχέση:

Η αντικατάσταση της ΔSπεριβάλλοντος από τη (-ΔΗσυστήματος/Τ) μας δίνει:

Και με απαλοιφή παρονομαστών έχουμε:

Η συνάρτηση –Τ.ΔS έχει διαστάσεις ενέργειας και ονομάζεται ελεύθερη ενέργεια ή ελεύθερη ενέργεια Gibbs προς τιμήν του Josiah Willard Gibbs που την επινόησε το 1878.

Ο δεύτερος νόμος της Θερμοδυναμικής ορίζει ότι σε κάθε αυθόρμητο φαινόμενο η εντροπία του σύμπαντος πρέπει να αυξάνεται. Η εξίσωση:

δείχνει ότι η εντροπία του σύμπαντος αυξάνεται όταν

και μόνον όταν:

Με ανακατανομή των όρων έχουμε ότι:

7

Ή ότι η εντροπία θα αυξηθεί όταν και μόνο όταν:

Με άλλα λόγια η μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας μιας αντίδρασης πρέπει να είναι αρνητική για να είναι η αντίδραση αυθόρμητη. Η αρνητική μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας μιας αντίδρασης συνοδεύεται πάντοτε από αύξηση της εντροπίας του σύμπαντος. Άρα χρειάζεται πάντοτε να ασχολούμαστε με έναν και μόνον όρο, την ελεύθερη ενέργεια του συστήματος ΔG, για να αποφασίσουμε αν μία αντίδραση μπορεί να λάβει χώρα αυθόρμητα ή όχι. Όλες οι άλλες επιδράσεις των μεταβολών του συστήματος στο σύμπαν έχουν ρυθμιστεί αυτόματα με αυτή και μόνο τη θεώρηση.

Η μεταβολή της ενθαλπίας δίνεται από τη σχέση: Αν λάβουμε υπ’ όψιν ότι η μεταβολή όγκου ΔV είναι πολύ μικρή σε όλες σχεδόν τις βιοχημικές αντιδράσεις, τότε η ΔH είναι σχεδόν ίση με τη ΔU. Έτσι έχουμε:

Δηλαδή η μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας ΔG εξαρτάται από τη μεταβολή της εσωτερικής ενέργειας και από τη μεταβολή της εντροπίας ενός συστήματος.Ένα χρήσιμο κριτήριο για το αν μία αντίδραση μπορεί να γίνει αυθόρμητα είναι η μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας (ΔG) και όχι η μεταβολή της εσωτερικής ενέργειας (ΔU).

1. Μία αντίδραση μπορεί να γίνει αυθόρμητα μόνον εάν η ΔG είναι αρνητική.2. Όταν ένα σύστημα βρίσκεται σε ισορροπία, καμμία καθαρή μεταβολή δεν

μπορεί να γίνει εάν η ΔG ισούται με το μηδέν.3. Μία αντίδραση δεν μπορεί να γίνει αυθόρμητα εάν η ΔG είναι θετική. Για να

γίνει μία τέτοια αντίδραση απαιτείται επιπρόσθετη ελεύθερη ενέργεια.Χρειάζεται να διευκρινιστούν δύο ακόμη σημεία:

Πρώτον, η ΔG μίας αντίδρασης εξαρτάται μόνο από τη διαφορά της ελεύθερης ενέργειας των προϊόντων (τελικό στάδιο) από την ελεύθερη ενέργεια των αντιδρώντων (αρχικό στάδιο). Η ΔG μίας αντίδρασης είναι ανεξάρτητη από την πορεία (ή μοριακό μηχανισμό) ενός μετασχηματισμού. Ο μηχανισμός μίας αντίδρασης δεν επηρεάζει τη ΔG. Για παράδειγμα η ΔG της οξείδωσης της γλυκόζης σε CO2 και Η2Ο, είναι η ίδια, είτε γίνεται με καύση in vitro είτε γίνεται in vivo μέσα σε ένα κύτταρο από μία σειρά ενζυμικών αντιδράσεων.

Δεύτερον η ΔG δεν δίνει πληροφορίες για την ταχύτητα μίας αντίδρασης. Μία αρνητική τιμή της ΔG υποδηλώνει ότι μία αντίδραση μπορεί να γίνει αυθόρμητα, αλλά δεν καθορίζει εάν θα προχωρήσει με μία αισθητή ταχύτητα. Όπως θα περιγραφεί στα επόμενα, η ταχύτητα μίας αντίδρασης εξαρτάται από την ελεύθερη ενέργεια ενεργοποίησης ( ), η οποία δεν σχετίζεται με τη μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας ΔG.

1.4 Τα ένζυμα επιταχύνουν τις αντιδράσεις, διευκολύνοντας το σχηματισμό της μεταβατικής κατάστασης.

Τα ένζυμα δρουν ως καταλύτες ελαττώνοντας την ελεύθερη ενέργεια ενεργοποίησης μιας χημικής αντίδρασης.

Τα ένζυμα επιταχύνουν τις αντιδράσεις με το να προσφέρουν μια πορεία αντίδρασης, στην οποία η μεταβατική κατάσταση (το υψηλότερο ενεργειακό είδος) έχει τη χαμηλότερη ελεύθερη ενέργεια και έτσι είναι πιο προσιτή (σχηματίζεται πιο γρήγορα) απ’ ότι στη μη

8

καταλυόμενη αντίδραση. Το πρώτο βήμα στην κατάλυση είναι ο σχηματισμός ενός συμπλόκου

ενζύμου-υποστρώματος. Τα υποστρώματα προσδένονται στα ένζυμα σε εσοχές των ενεργών κέντρων από τα οποία αποκλείεται το νερό όταν το υπόστρωμα είναι προσδεμένο.

Η εξειδίκευση των αλληλεπιδράσεων ενζύμου-υποστρώματος προέρχεται κυρίως από τους δεσμούς υδρογόνου, οι οποίοι έχουν δεδομένο προσανατολισμό, και από το σχήμα του ενεργού κέντρου, το οποίο αποβάλλει μόρια που δεν έχουν ένα ικανοποιητικά συμπληρωματικό σχήμα.

Η αναγνώριση των υποστρωμάτων από τα ένζυμα είναι μια δυναμική πορεία συνοδεύεται από μεταβολές στερεοδιάταξης στο ενεργό κέντρο, οι οποίες διευκολύνουν το σχηματισμό της μεταβατικής κατάστασης.

1.4.1 Μεταβολή της ΔG και η σχέση της με την σταθερά ισορροπίας.

Θεωρούμε την αντίδραση: . Η ΔG αυτής της αντίδρασης

δίνεται από:

Όπου ΔG0 είναι η μεταβολή της πρότυπης ελεύθερης ενέργειας, R είναι η σταθερά των αερίων, Τα είναι η απόλυτη θερμοκρασία, και [Α],[Β],[Γ],[Δ] είναι οι μοριακές συγκεντρώσεις (ακριβέστερα οι ενεργότητες) των αντιδρώντων. Η ΔG0 είναι η μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας κάτω από πρότυπες συνθήκες, δηλαδή όταν το καθένα από τα αντιδρώντα Α, Β, Γ και Δ έχει συγκέντρωση 1,0 Μ (για αέριο η πρότυπη κατάσταση επιλέγεται Ρ=1 Atm). Έτσι η ΔG μίας αντίδρασης εξαρτάται από τη φύση των αντιδρώντων (που εκφράζεται στον όρο ΔG0 στην εξίσωση) και από τις συγκεντρώσεις των αντιδρώντων (που εκφράζονται στο λογαριθμικό όρο της εξίσωσης).Έχει υιοθετηθεί μία σύμβαση ώστε να απλοποιηθούν οι υπολογισμοί για τον προσδιορισμό της ελεύθερης ενέργειας στις βιοχημικές αντιδράσεις. Ως πρότυπη κατάσταση ορίζεται αυτή στην οποία το ΡΗ=7. Συνεπώς όταν το Η+

είναι ένα από τα αντιδρώντα, η ενεργότητά του έχει τιμή 1 (που αντιστοιχεί στο ΡΗ=7) στις παραπάνω εξισώσεις. Επίσης η ενεργότητα του Η2Ο λαμβάνεται ίση με 1 σε αυτές τις εξισώσεις. Η μεταβολή της πρότυπης ελεύθερης ενέργειας σε ΡΗ=7, που παριστάνεται με το σύμβολο ΔG0’, θα χρησιμοποιείται στη συνέχεια.Η σχέση μεταξύ της πρότυπης ελεύθερης ενέργειας και της σταθεράς ισορροπίας μίας αντίδρασης προκύπτει εύκολα. Στην ισορροπία ΔG0’=0 οπότε η εξίσωση γίνεται:

Άρα

Η σταθερά ισορροπίας Κeq κάτω από πρότυπες συνθήκες ορίζεται ως εξής:

Οπότε αντικαθιστώντας έχουμε ότι:

9

Η οποία μπορεί να μετασχηματιστεί και να δώσει:

Αντικαθιστώντας το R=1,98.10-3 Kcal/mol.K και Τ=298 0Κ (που αντστοιχεί στους 25 0C) έχουμε:

Αντικαθιστώντας το R=8,314.10-3 KJ/mol.K και Τ=298 0Κ (που αντστοιχεί στους 25 0C) έχουμε:

Όταν η ΔG0’ εκφράζεται σε KJ/mol.Έτσι η πρότυπη ελεύθερη ενέργεια και η σταθερά ισορροπίας μιας αντίδρασης σχετίζονται με μία απλή σχέση. Για παράδειγμα μία σταθερά ισορροπίας με τιμή 10 αντιστοιχεί σε μία μεταβολή της πρότυπης ελεύθερης ενέργειας των -1,36 Kcal/mol στους 25 0C. Η σχέση-μεταβολή της ΔG0’ και Keq δίνεται στον παρακάτω πίνακα.

Keq ΔG0’ (Kcal/mol)10-5 6,8210-4 5,4610-3 4,0910-2 2,7310-1 1,361 0

101 -1,36102 -2,73103 -4,09104 -5,46105 -6,82

Σαν παράδειγμα θα υπολογίσουμε τη ΔG0’ της αντίδρασης ισομερισμού της φωσφορικής διυδροξυακετόνης (DHAP) σε 3-φωσφορική γλυκεραλδεΰδη (G-3P).

Αυτή η αντίδραση λαμβάνει χώρα στη γλυκόλυση. Στην ισορροπία, ο λόγος [G-3P]/[DHAP] στους 25 0C (298 0K) και ΡΗ=7 είναι 0,045. Έτσι Κeq=0,045. Η μεταβολή της πρότυπης ελεύθερης ενέργειας αυτής της αντίδρασης υπολογίζεται από την εξίσωση:

Τώρα ας υπολογίσουμε τη ΔG αυτής της αντίδρασης όταν η αρχική συγκέντρωση της DHAP είναι 2.10-4 Μ και η αρχική συγκέντρωση της G-3P είναι 3.10-6 Μ. Αντικαθιστώντας αυτές τις τιμές στην εξίσωση :

λαμβάνουμε:

10

Αυτή η αρνητική τιμή για τη ΔG υποδηλώνει ότι ο ισομερισμός της DHAP σε G-3P μπορεί να γίνει αυθόρμητα όταν αυτές οι ενώσεις βρίσκονται στις συγκεντρώσεις που καθορίστηκαν παραπάνω. Σημειώνουμε ότι παρά το γεγονός ότι η ΔG0’ της αντίδρασης αυτής είναι θετική, η ΔG είναι αρνητική.Το αν η ΔG μιας αντίδρασης θα είναι μεγαλύτερη, μικρότερη ή ίση με τη ΔG0’

εξαρτάται από τις συγκεντρώσεις των αντιδρώντων. Το κριτήριο του αυθόρμητου μιας αντίδρασης είναι η ΔG και όχι η ΔG0’.

1.4.2 Τα ένζυμα δεν μεταβάλλουν τις ισορροπίες των αντιδράσεων.Τα ένζυμα είναι καταλύτες και έτσι δεν μπορούν να μεταβάλλουν την ισορροπία μιας χημικής αντίδρασης. Αυτό σημαίνει ότι ένα ένζυμο επιταχύνει την αντίδραση και προς τις δύο κατευθύνσεις ακριβώς κατά τον ίδιο παράγοντα.Θεωρούμε την αλληλομετατροπή των Α και Β. Υποθέτουμε ότι απουσία ενζύμου, η προς τα δεξιά κινητική σταθερά (Kf) είναι 10-4 s-1 και η αντίστροφη κινητική σταθερά (KR) είναι 10-6 s-1. Η σταθερά ισορροπίας Κ δίνεται από το λόγο αυτών των κινητικών σταθερών.

Στην ισορροπία η συγκέντρωση του Β είναι 100 φορές μεγαλύτερη από αυτή του Α, ανεξάρτητα από το εάν είναι παρόν ή όχι το ένζυμο. Εν τούτοις απουσία του ενζύμου πολύς χρόνος (πχ πάνω από μία ώρα) για να επιτευχθεί χημική ισορροπία ενώ παρουσία ενός κατάλληλου ενζύμου η ισορροπία επιτυγχάνεται τάχιστα (πχ σε λίγα δευτερόλεπτα). Τα ένζυμα επιταχύνουν την επίτευξη της ισορροπίας αλλά δεν μεταβάλλουν τη θέση της.

1.4.3 Τα ένζυμα σταθεροποιούν τις μεταβατικές καταστάσεις.

Μία χημική αντίδραση μετατροπής ενός υποστρώματος S (Substrate) σε ένα προϊόν Ρ (Product) λαμβάνει χώρα μέσω μιας μεταβατικής κατάστασης που έχει υψηλότερη ελεύθερη ενέργεια από το S ή το Ρ.

Κατά την πορεία μιας αντίδρασης η μεταβατική κατάσταση, λόγω της υψηλότερης ελεύθερης ενέργειας, είναι η πλέον σπάνια καταλαμβανόμενη διαμόρφωση. Η ελεύθερη ενέργεια ενεργοποίησης κατά Gibbs, που συμβολίζεται με , είναι ίση με τη διαφορά της ελεύθερης ενέργειας μεταξύ της μεταβατικής κατάστασης και του υποστρώματος. Ο διπλός σταυρός στίξης υποδηλώνει μία θερμοδυναμική ποσότητα μίας μεταβατικής κατάστασης.

11

Η ταχύτητα της αντίδρασης V είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση του , η οποία

εξαρτάται από τη , γιατί βρίσκεται σε ισορροπία με το .

Σε αυτές τις εξισώσεις, k είναι η σταθερά του Boltzmann και h είναι η σταθερά του Plank. Η τιμή του kT/h στους 25 0C είναι 6,2.1012 s-1. Υποθέτουμε ότι η ελεύθερη

ενέργεια ενεργοποίησης είναι 6,82 Kcal/mol. Τότε ο λόγος

είναι 10-5. Έχουμε ήδη υποθέσει ότι [S]=1, έτσι η ταχύτητα της αντίδρασης V είναι 6,2.107 s-1. Ελάττωση της κατά 1,36 Kcal/mol έχει ως αποτέλεσμα τον δεκαπλασιασμό της ταχύτητας.Τα ένζυμα επιταχύνουν τις αντιδράσεις με το να ελαττώνουν τη , το φράγμα ενεργοποίησης. Ο συνδυασμός ενζύμου-υποστρώματος δημιουργεί μία καινούργια πορεία αντίδρασης, της οποίας η ενέργεια μεταβατικής κατάστασης είναι χαμηλότερη από αυτήν της αντίδρασης απουσία ενζύμου. Η ουσία της κατάλυσης όπως θα περιγραφεί στα επόμενα, είναι η ειδική πρόσδεση στο ένζυμο της μεταβατικής κατάστασης.

1.4.4 Ο σχηματισμός Ενζύμου – Υποστρώματος είναι το πρώτο βήμα στην ενζυμική κατάλυση.

Το μεγαλύτερο μέρος της καταλυτικής ισχύος των ενζύμων πηγάζει από το ότι φέρνουν τα υποστρώματα κοντά σε ευνοϊκό προσανατολισμό μέσα σε σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος (ES). Τα υποστρώματα προσδένονται σε μία ειδική περιοχή του ενζύμου που ονομάζεται ενεργό κέντρο (active site). Τα περισσότερα ένζυμα είναι πολύ εκλεκτικά στην πρόσδεσή τους με το υπόστρωμα. Πράγματι η καταλυτική εξειδίκευση των ενζύμων κατά ένα μέρος εξαρτάται από την εξειδίκευση της πρόσδεσης. Επιπλέον, η δραστικότητα μερικών ενζύμων ελέγχεται σ’ αυτό το στάδιο.Η ύπαρξη συμπλόκων ES έχει αποδειχθεί με ποικίλους τρόπους:

1. Η ταχύτητα μίας ενζυμικής αντίδρασης, σε σταθερή συγκέντρωση ενζύμου, αυξάνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος μέχρις ότου επιτευχθεί μία μέγιστη ταχύτητα (σχήμα). Αντίθετα, οι μη καταλυόμενες αντιδράσεις δεν επιδεικνύουν αυτό το φαινόμενο του κορεσμού. Το 1913, ο Leonor Michaelis ερμήνευσε τη μέγιστη ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης ως το αποτέλεσμα σχηματισμού ενός ξεχωριστού συμπλόκου ES. Σε αρκετά υψηλή συγκέντρωση υποστρώματος, οι καταλυτικές περιοχές των μορίων του ενζύμου είναι κατειλημμένες και έτσι η ταχύτητα της αντίδρασης πλησιάζει το μέγιστο.

12

Σχήμα: Διάγραμμα της ταχύτητας μιας ενζυμικής αντίδρασης σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση του υποστρώματος.

2. Τα σύμπλοκα ES έχουν γίνει απ’ ευθείας ορατά με την ηλεκτρονική μικροσκοπία, όπως στη μικροφωτογραφία της DNA πολυμεράσης που έχει προσδεθεί στο εκμαγείο DNA. Η κρυσταλλογραφία μα ακτίνες Χ μας παρέχει υψηλής πιστότητας εικόνες υποστρωμάτων και αναλόγων υποστρωμάτων, που είναι προσδεμένα στο ενεργό κέντρο πολλών ενζύμων. Στο επόμενο κεφάλαιο θα δούμε λεπτομερέστερα αρκετά από αυτά τα σύμπλοκα. Επί πλέον μελέτες με ακτίνες Χ που έγιναν σε χαμηλές θερμοκρασίες (για να επιβραδυνθούν οι αντιδράσεις παρέχουν αποκαλυπτικές εικόνες των ενδιαμέσων στις ενζυμικές αντιδράσεις.

3. Τα φασματοσκοπικά χαρακτηριστικά πολλών ενζύμων και υποστρωμάτων αλλάζουν με τον σχηματισμό ενός συμπλόκου ES. Αυτές οι αλλαγές είναι ιδιαίτερα έντονες όταν το ένζυμο περιέχει μία έγχρωμη προσθετική ομάδα. Η συνθετάση της θρυπτοφάνης, ένα βακτηριακό ένζυμο παρέχει ένα ωραίο διάγραμμα έντασης φθορισμού, επειδή περιέχει ως προσθετική ομάδα τη φωσφορική πυριδοξάλη. Αυτό το ένζυμο καταλύει τη σύνθεση της L-τρυπτοφάνης από L-σερίνη και ινδόλιο. Η προσθήκη της L-σερίνης στο ένζυμο προκαλεί μία αξιοσημείωτη αύξηση στον φθορισμό της ομάδας της φωσφορικής πυριδοξάλης (σχήμα). Η προσθήκη στη συνέχεια του ινδολίου, του δεύτερου υποστρώματος, αποσβένει την αύξηση του φθορισμού σε επίπεδο χαμηλότερο ακόμα και από αυτό που έχει από μόνο του το ένζυμο.

13

Σχήμα: Η ένταση φθορισμού της φωσφορικής πυριδοξάλης στο ενεργό κέντρο της συνθετάσης της θρυπτοφάνης αλλάζει με την προσθήκη των υποστρωμάτων

σερίνης και ινδολίου.

Έτσι η φασματοσκοπία φθορισμού αποκαλύπτει την ύπαρξη ενός συμπλόκου ενζύμου-σερίνης και ενός συμπλόκου ενζύμου-σερίνης-ινδολίου. Άλλες τεχνικές φασματοσκοπίας, όπως ο πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός (NMR) και ο ηλεκτρονικός παραμαγνητικός συντονισμός (ESR) δίνουν επίσης πολλές πληροφορίες για τις αλληλεπιδράσεις ES.

1.4.5 Μερικά σημαντικά χαρακτηριστικά των ενεργών κέντρων.Το ενεργό κέντρο ενός ενζύμου είναι η περιοχή όπου προσδένονται τα υποστρώματα (και η προσθετική ομάδα εάν υπάρχει) και περιέχει τα κατάλοιπα που συμμετέχουν απ’ ευθείας στη σύνθεση ή τη διάσπαση δεσμών. Αυτά τα κατάλοιπα ονομάζονται καταλυτικές ομάδες. Αν και τα ένζυμα διαφέρουν ευρέως στην δομή, την εξειδίκευση και τον τρόπο κατάλυσης, μπορεί να αναφερθεί ένας αριθμός από γενικεύσεις που αφορούν στο ενεργό κέντρο.

1. Το ενεργό κέντρο καταλαμβάνει ένα σχετικά μικρό μέρος στον συνολικό όγκο ενός ενζύμου. Τα περισσότερα από τα κατάλοιπα των αμινοξέων σε ένα ένζυμο δεν έρχονται σε επαφή με το υπόστρωμα. Αυτό εγείρει το ερώτημα γιατί τα ένζυμα είναι τόσο μεγάλα. Σχεδόν όλα τα ένζυμα αποτελούνται από περισσότερα των 100 καταλοίπων αμινοξέων, τα οποία τους προσδίνουν μία μάζα μεγαλύτερη από 100 Kd και διάμετρο μεγαλύτερη από 25 Α0.

Σχήμα: Δομικό μοντέλο της λυσοζύμης. Οι επιφάνειες Van der Waals δύο κρίσιμων καταλοίπων του ενεργού κέντρου είναι έγχρωμες.

2. Το ενεργό κέντρο είναι μία τρισδιάστατη οντότητα που έχει σχηματιστεί από ομάδες που προέρχονται από διαφορετικές περιοχές μίας γραμμικής αλληλουχίας αμινοξέων. Πράγματι κατάλοιπα μακριά το ένα από το άλλο στη γραμμική αλληλουχία των αμινοξέων, αλληλεπιδρούν πιο ισχυρά απ’ ότι παρακείμενα κατάλοιπα στην αλληλουχία των αμινοξέων. Στη λυσοζύμη, ένα ένζυμο που θα περιγραφεί λεπτομερέστερα σε επόμενο κεφάλαιο, οι σημαντικές ομάδες του ενεργού κέντρου προσφέρονται από τα κατάλοιπα που αριθμούνται ως 35, 52, 62, 63 και 101 στη γραμμική αλληλουχία των 129 αμινοξέων.

3. Τα σύμπλοκα προσδένονται στα ένζυμα με πολλαπλές ασθενείς έλξεις. Τα σύμπλοκα ES έχουν συνήθως σταθερές ισορροπίας που κυμαίνονται από 10-2

14

έως 10-8 Μ, οι οποίες αντιστοιχούν σε τιμές ελεύθερης ενέργειας από -3 έως -12 Kcal/mol. Οι μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις στα σύμπλοκα ES είναι πολύ ασθενέστερες από τους ομοιοπολικούς δεσμούς, οι οποίοι έχουν ενέργειες μεταξύ -50 και -110 Kcal/mol. Όπως είναι γνωστό οι αντιστρεπτές αλληλεπιδράσεις των βιομορίων διαμεσολαβούνται από ηλεκτροστατικούς δεσμούς, δεσμούς υδρογόνου, δυνάμεις Van der Waals και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Στην πρόσδεση, οι δυνάμεις Van der Waals γίνονται σημαντικές μόνο όταν αρκετά άτομα του υποστρώματος μπορούν ταυτόχρονα να έλθουν κοντά σε πολλά άτομα του ενζύμου. Ως εκ τούτου, το ένζυμο και το υπόστρωμα θα έπρεπε να έχουν συμπληρωματικά σχήματα. Ο κατευθυντικός χαρακτήρας των δεσμών υδρογόνου μεταξύ του ενζύμου και του υποστρώματος συχνά επιβάλλει τον υψηλό βαθμό εξειδίκευσης.

4. Τα ενεργά κέντρα είναι εσοχές ή σχισμές. Σε όλα τα ένζυμα με γνωστή δομή, τα μόρια του υποστρώματος προσδένονται σε μία εσοχή ή μία σχισμή. Το νερό συνήθως δεν περιλαμβάνεται, εκτός και αν είναι αντιδρόν. Ο μη πολικός χαρακτήρας των περισσοτέρων εσοχών αυξάνει την πρόσδεση του υποστρώματος. Εν τούτοις, η εσοχή μπορεί να περιέχει επίσης και μη πολικά κατάλοιπα. Δημιουργεί ένα μικροπεριβάλλον στο οποίο κάποια από αυτά τα κατάλοιπα αποκτούν ειδικές ιδιότητες που είναι ουσιώδεις στην κατάλυση. Οι εσωτερικές θέσεις αυτών των πολικών καταλοίπων είναι βιολογικά κρίσιμες εξαιρέσεις από τον γενικό κανόνα όπου τα κατάλοιπα εκτίθενται στο νερό.

5. Η εξειδίκευση της πρόσδεσης εξαρτάται από την επακριβώς καθορισμένη τοποθέτηση των ατόμων στο ενεργό κέντρο. Ένα υπόστρωμα, για να εφαρμόσει σε μία περιοχή πρέπει να έχει ένα ταιριαστό σχήμα. Η μεταφορική έννοια του κλειδιού και της κλειδαριάς του Emil Fischer, που διατυπώθηκε το 1899, αποδείχτηκε πολύ αποτελεσματική. Εν τούτοις, είναι τώρα προφανές ότι το σχήμα του ενεργού κέντρου μερικών ενζύμων τροποποιείται σημαντικά με την πρόσδεση του υποστρώματος, όπως παρουσιάστηκε από τον Daniel E. Koshland το 1958. Το ενεργό κέντρο αυτών των ενζύμων έχει σχήμα που είναι συμπληρωματικό με το σχήμα του υποστρώματος μόνο μετά την πρόσδεση του υποστρώματος στο ενεργό κέντρο. Αυτή η πορεία δυναμικής αναγνώρισης ονομάζεται επαγόμενη προσαρμογή.

1.5 Το μοντέλο Michaelis-Menden εξηγεί τις κινητικές ιδιότητες πολλών ενζύμων.

Στο μοντέλο Michaelis-Menden (Μ-Μ) ένα ένζυμο (Ε) συνδυάζεται με ένα υπόστρωμα (S) για να σχηματίσουν ένα σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος (ES) το οποίο μπορεί να σχηματίσει ένα προϊόν (Ρ) ή να διασπαστεί σε Ε και S.

Η αρχική ταχύτητα V σχηματισμού του προϊόντος δίνεται από την εξίσωση Michaelis-Menden:

Στην εξίσωση Μ-Μ είναι η ταχύτητα όταν το ένζυμο είναι πλήρως

κορεσμένο με υπόστρωμα και , η σταθερά Michaelis, είναι η συγκέντρωση κατά την οποία η ταχύτητα της αντίδρασης είναι ίση με το μισό της μέγιστης ταχύτητας.

Η μέγιστη ταχύτητα είναι ίση με το γινόμενο της ή , και της

15

ολικής συγκέντρωσης του ενζύμου :

Η κινητική σταθερά που ονομάζεται αριθμός μετατροπής, είναι ο αριθμός μορίων του υποστρώματος που μετατρέπονται σε προϊόν ανά μονάδα χρόνου σε μία μόνο καταλυτική περιοχή, όταν το ένζυμο είναι πλήρως κορεσμένο με υπόστρωμα. Ο αριθμός μετατροπής για τα περισσότερα ένζυμα είναι μεταξύ 1 και 104 ανά δευτερόλεπτο. Ο λόγος

/ παρέχει ένα διεισδυτικό ανιχνευτή αποδοτικότητας του ενζύμου. Τα αλλοστερικά ένζυμα απαρτίζουν μια σπουδαία τάξη ενζύμων των

οποίων μπορεί να ρυθμιστεί η καταλυτική δραστικότητα. Τα ένζυμα αυτά τα οποία δεν ακολουθούν την κινητική Michaelis-Menden, έχουν πολλαπλά ενεργά κέντρα. Αυτά τα ενεργά κέντρα εμφανίζουν συνεργειακότητα, όπως αποδεικνύεται από τη σιγμοειδή εξάρτηση της ταχύτητας της αντίδρασης από τη συγκέντρωση του υποστρώματος.

1.5.1 Η εξίσωση Michaelis-MentenΣε πολλά ένζυμα η ταχύτητα της κατάλυσης V, μεταβάλλεται με τη συγκέντρωση του υποστρώματος, [S], με τον τρόπο που παρουσιάζεται στο σχήμα. Ως ταχύτητα V ορίζεται ο αριθμός των μορίων του προϊόντος που σχηματίζονται ανά δευτερόλεπτο. Σε σταθερή συγκέντρωση ενζύμου και σε χαμηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος, η ταχύτητα V είναι σχεδόν ευθέως ανάλογη προς τη συγκέντρωση του υποστρώματος [S]. Σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος [S], η ταχύτητα V είναι περίπου ανεξάρτητη από το [S]. Το 1913, ο Leonor Michaelis και η Maud Menten πρότειναν ένα απλό μοντέλο που να εξηγεί αυτά τα κινητικά χαρακτηριστικά. Το κρίσιμο χαρακτηριστικό στην συμπεριφορά των ενζύμων είναι ότι ένα ειδικό σύμπλοκο ES είναι το αναγκαίο ενδιάμεσο στην κατάλυση. Το μοντέλο που προτάθηκε, το οποίο είναι το απλούστερο που εξηγεί τις κινητικές ιδιότητες πολλών ενζύμων, είναι:

Ένα ένζυμο (Ε) αντιδρά με το υπόστρωμα (S) για να σχηματίσει ένα σύμπλοκο (ES) με μια κινητική σταθερά k1. Το σύμπλοκο ES μπορεί να ακολουθήσει δύο δρόμους: Είτε να διασπαστεί σε Ε και S με μια κινητική σταθερά K2, ή να σχηματίσει προϊόν Ρ με μία κινητική σταθερά K3. Υποτίθεται ότι το προϊόν δεν επανέρχεται στο αρχικό υπόστρωμα, μία συνθήκη που ισχύει στο αρχικό στάδιο μιας αντίδρασης προτού η συγκέντρωση του προϊόντος αυξηθεί σημαντικά.Θέλουμε μία σχέση που να σχετίζει την ταχύτητα της κατάλυσης με τις συγκεντρώσεις του υποστρώματος και του ενζύμου, και με τις ταχύτητες των επί μέρους βημάτων. Το εναρκτήριο σημείο είναι ότι η ταχύτητα κατάλυσης είναι ίση με το γινόμενο της συγκέντρωσης του συμπλόκου [ES] με την K3:

Τώρα χρειάζεται να εκφράσουμε το [ES] με όρους γνωστών ποσοτήτων. Οι ταχύτητες σχηματισμού και διάσπασης του ES δίνονται από:

Ταχύτητα σχηματισμού του ES = K1.[E].[S]Ταχύτητα διάσπασης του ES = (K2+K3).[ES]

Ενδιαφερόμαστε για την ταχύτητα της κατάλυσης κάτω από συνθήκες σταθερής κατάστασης (steady state). Στη σταθερή κατάσταση οι συγκεντρώσεις των ενδιαμέσων παραμένουν σταθερές, ενώ οι συγκεντρώσεις των αρχικών ενώσεων και των προϊόντων αλλάζουν. Αυτό συμβαίνει όταν οι ταχύτητες σχηματισμού και διάσπασης του συμπλόκου ES είναι ίσες. Θέτοντας ίσες τις ταχύτητες σχηματισμού και διάσπασης του ES έχουμε:

16

Λύνοντας ως προς ES έχουμε ότι:

Η εξίσωση αυτή μπορεί να απλοποιηθεί με το να ορίσουμε μία νέα σταθερά την , που ονομάζεται σταθερά Michaelis:

Οπότε για το [ES] έχουμε:

Ας εξετάσουμε τον αριθμητή της τελευταίας εξίσωσης. Η συγκέντρωση του μη προσδεδεμένου υποστρώματος [S], είναι περίπου ίση με τη συγκέντρωση του συνολικού υποστρώματος, λαμβάνοντας υπ’ όψιν ότι η συγκέντρωση του ενζύμου είναι πολύ μικρότερη από από τη συγκέντρωση του υποστρώματος. Η συγκέντρωση του μη προσδεδεμένου ενζύμου, [Ε], είναι ίση με τη συγκέντρωση του ολικού ενζύμου [ΕΤ], μείον τη συγκέντρωση του συμπλόκου ES.

Αντικαθιστώντας αυτή τη σχέση στην εξίσωση για το [ES] λαμβάνουμε:

Λύνοντας ως προς [ES] έχουμε:

και πολλαπλασιάζοντας επί λαμβάνουμε:

Παρατηρούμε ότι το γινόμενο είναι η αρχική ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης.Η μέγιστη ταχύτητα επιτυγχάνεται όταν τα ενεργά κέντρα των μορίων του ενζύμου είναι κορεσμένα με υπόστρωμα, δηλαδή όταν η [S] είναι πολύ

μεγαλύτερη από την ( ) έτσι ώστε ο λόγος να

πλησιάζει τη μονάδα. Έτσι έχουμε:

Οπότε παράγεται η εξίσωση Michaelis-Menten

Αυτή η εξίσωση εξηγεί τα κινητικά δεδομένα του σχήματος. Σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος, όταν η [S] είναι πολύ

μικρότερη από την ( ) και άρα η ταχύτητα V

δίνεται από την σχέση: . δηλαδή, η ταχύτητα είναι ευθέως

ανάλογη της συγκέντρωσης του υποστρώματος. Σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος, όταν η [S] είναι πολύ

μεγαλύτερη από την ( ) και άρα η ταχύτητα V

δίνεται από την σχέση: . δηλαδή, η ταχύτητα είναι μέγιστη, ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση του υποστρώματος.

17

Η έννοια της είναι προφανής από την εξίσωση Michaelis-Menten.

Όταν τότε . Έτσι η είναι ίση με τη συγκέντρωση του

υποστρώματος όταν η ταχύτητα της αντίδρασης είναι ίση με το μισό της μέγιστης τιμής της.

1.5.2 Οι τιμές και μπορούν να προσδιοριστούν μεταβάλλοντας τη συγκέντρωση του υποστρώματος.Διαγράμματα Linweaver-Burk Eadie

Η σταθερά Michaelis και η μέγιστη ταχύτητα μπορούν εύκολα να προσδιοριστούν από τις ταχύτητες της κατάλυσης που μετρήθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις υποστρώματος, εάν ένα ένζυμο λειτουργεί σύμφωνα το απλό σχήμα της εξίσωσης Μichaelis-Μenten που μόλις περιγράψαμε. Με άλλα λόγια όταν το ένζυμο υπακούει στην κινητική Michaelis-Menten. Είναι βολικό να μετατρέψουμε την εξίσωση Michaelis-Menten σε μία μορφή που να δίνει γραφική παράσταση ευθείας γραμμής. Αυτό μπορεί να γίνει με το να πάρουμε το αντίστροφο και από τα δύο μέλη της εξίσωσης ΜΜ και έτσι έχουμε:

Το διάγραμμα του διπλού αντιστρόφου της σε συνάρτηση με την

ονομάζεται διάγραμμα Linweaver-Burk, είναι μία ευθεία γραμμή με κλίση και

τομές στους άξονες των y και χ αντίστοιχα, και .

1.5.3 Η σημασία των τιμών Km και Vmax.Οι τιμές της Km και Vmax ποικίλουν όπως φαίνεται από τον παρακάτω πίνακα. Για τα περισσότερα ένζυμα η Km έχει τιμές μεταξύ 10-1 και 10-7. Η τιμή Km για ένα ένζυμο εξαρτάται από το συγκεκριμένο υπόστρωμα, καθώς επίσης από τις περιβαλλοντικές συνθήκες όπως το ΡΗ, η θερμοκρασία και η ιοντική ισχύς. Η σταθερά Michaelis Km έχει δύο έννοιες.

Πρώτον, η Km είναι εκείνη η συγκέντρωση του υποστρώματος όπου τα μισά από τα ενεργά κέντρα έχουν καταληφθεί από το υπόστρωμα. Εφ’ όσον η Km

είναι γνωστή, το κλάσμα των περιοχών που έχουν καταληφθεί, , σε οποιαδήποτε συγκέντρωση υποστρώματος μπορεί να υπολογιστεί από τον τύπο.

Δεύτερον, η Km σχετίζεται με τις κινητικές σταθερές των επιμέρους

βημάτων στο καταλυτικό σχήμα: . Η Km ορίζεται

ως . Ας θεωρήσουμε μία οριακή περίπτωση κατά την οποία η

είναι πολύ μεγαλύτερη από την . Αυτό σημαίνει ότι η διάσπαση του συμπλόκου ES σε Ε και S είναι πολύ πιο γρήγορη απ’ ότι ο σχηματισμός του Ε του προϊόντος. Κάτω απ’ αυτές τις συνθήκες :

όμως

Με άλλα λόγια η Km είναι ίση με τη σταθερά διάστασης του συμπλόκου ES όταν η k3 είναι πολύ μικρότερη από την k2. Όταν ισχύει αυτή η συνθήκη, η Km παρέχει ένα μέτρο της δύναμης του συμπλόκου ES: Μία υψηλή τιμή της Km δείχνει

18

ασθενή πρόσδεση, ενώ μία χαμηλή τιμή της Km δείχνει ισχυρή πρόσδεση. Συνεπώς η Km δίνει ένα μέτρο της συγγένειας του συμπλόκου ES μόνο όταν

.

Ο αριθμός μετατροπής (turnover number) ενός ενζύμου είναι ο αριθμός των μορίων του υποστρώματος που μετατρέπονται σε προϊόν ανά μονάδα χρόνου από ένα μόριο ενζύμου, όταν το ένζυμο είναι πλήρως κορεσμένο με υπόστρωμα. Ο αριθμός μετατροπής ισούται με την κινητική σταθερά k3. Εάν η συγκέντρωση των ενεργών κέντρων [ΕΤ] είναι γνωστή, τότε ο αριθμός μετατροπής ενός ενζύμου μπορεί να προσδιοριστεί μέσω της μέγιστης ταχύτητας (Vmax) διότι:

Για παράδειγμα ένα διάλυμα ανθρακικής ανυδράσης 10-6 Μ, όταν είναι πλήρως κορεσμένη με υπόστρωμα, καταλύει το σχηματισμό 0,6 Μ H2CO3 ανά δευτερόλεπτο. Ως εκ τούτου, η k3 ισούται με 6.105 s-1. Αυτός ο αριθμός μετατροπής είναι ένας από τους μεγαλύτερους που είναι γνωστός. Κάθε γύρος κατάλυσης γίνεται σε χρόνο ίσο με 1/k3, ο οποίος για την ανθρακική ανυδράση ισούται με 1,7 μικροδευτερόλεπτα. Ο αριθμός μετατροπής των περισσοτέρων ενζύμων με τα φυσιολογικά τους υποστρώματα κυμαίνεται από 1 έως104 ανά δευτερόλεπτο (Πίνακας).

1.5.4 Η κινητική τελειότητα στην ενζυμική κατάλυση: Το κριτήριο Kcat/Km.Όταν η συγκέντρωση του υποστρώματος είναι πολύ μεγαλύτερη από την Km, η ταχύτητα κατάλυσης είναι ίση με την k3, τον αριθμό μετατροπής όπως περιγράφηκε. Εν τούτοις πολλά ένζυμα δεν είναι συνήθως κορεσμένα με υπόστρωμα. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, ο λόγος [S]/Km κυμαίνεται τυπικά μεταξύ 0,01 και 1. Όταν

, η ενζυμική ταχύτητα είναι πολύ μικρότερη από την k3, γιατί τα περισσότερα

από τα ενεργά κέντρα δεν έχουν καταληφθεί από το υπόστρωμα. Υπάρχει κάποια ποσότητα που να χαρακτηρίζει την κινητική ενός ενζύμου κάτω από αυτές τις συνθήκες; Πράγματι υπάρχει όπως θα φανεί αν συνδυάσουμε τις εξισώσεις:

και οπότε λαμβάνουμε:

Όταν , η συγκέντρωση του ελεύθερου ενζύμου [Ε] είναι σχεδόν ίση με την

ολική συγκέντρωση του ενζύμου [ΕΤ], και έτσι έχουμε:

Έτσι όταν , η ενζυμική ταχύτητα εξαρτάται από την τιμή του λόγου k3/Km και

από τη συγκέντρωση του υποστρώματος [S].Υπάρχουν φυσικά όρια στην τιμή του λόγου k3/Km; Παρατηρούμε κατ’ αρχήν ότι ο λόγος αυτός εξαρτάται από τις k1,k2 και k3 όπως αποδεικνύεται από την αντικατάσταση της Km.

Παρατηρούμε ότι το ανώτατο όριο στην τιμή του λόγου k3/Km καθορίζεται από την k1, δηλαδή την ταχύτητα σχηματισμού του συμπλόκου ES. Αυτή η ταχύτητα δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερη από τη συχνότητα συνάντησης ενός ενζύμου με το υπόστρωμά του, που εξαρτάται αποκλειστικά από το φαινόμενο της διάχυσης. Η διάχυση περιορίζει την τιμή της k1 έτσι ώστε δεν μπορεί να είναι υψηλότερη από από τα όρια των 108 και 109 M-1.s-1. Ως εκ τούτου, το ανώτερο όριο στην τιμή του λόγου k3/Km είναι μεταξύ του 108 και 109 M-1.s-1.

19

Αυτός ο περιορισμός αναφέρεται επίσης και σε ένζυμα με πορεία αντίδρασης πιο

περίπλοκη από αυτήν της εξίσωσης: Η μέγιστη καταλυτική

ταχύτητα που ορίζεται από την kcat, όταν το υπόστρωμα είναι κορεσμένο δεν εξαρτάται μόνο από την k3 αλλά και από άλλες κινητικές σταθερές. Η σχετική παράμετρος γι’ αυτά τα ένζυμα είναι ο λόγος kcat/Km. Είναι γεγονός ότι οι λόγοι kcat/Km των ενζύμων ακετυλοχολινεστεράση, ανθρακική ανυδράση και ισομεράση της φωσφοτριόζης είναι μεταξύ του 108 και 109 M-1.s-1, πράγμα που δείχνει ότι έχουν πετύχει κινητική τελειότητα. Η καταλυτική τους ταχύτητα περιορίζεται μόνο από τον ρυθμό με τον οποίο συναντούν το υπόστρωμα μέσα στο διάλυμα. Κάθε επιπρόσθετο κέρδος στην καταλυτική ταχύτητα προέρχεται μόνο από την ελάττωση του χρόνου διάχυσης. Πράγματι μερικά ένζυμα είναι συνδεδεμένα σε οργανωμένα συγκροτήματα έτσι ώστε το προϊόν του ενός ενζύμου να συναντά πολύ γρήγορα το άλλο ένζυμο. Αποτέλεσμα είναι ότι τα προϊόντα διοχετεύονται από το ένα ένζυμο στο επόμενο όπως γίνεται σε μία γραμμή παραγωγής. Έτσι, το όριο που επιβάλλεται από το ρυθμό διάχυσης στο διάλυμα μπορεί να ξεπεραστεί εν μέρει με τον περιορισμό των υποστρωμάτων και των προϊόντων στον περιορισμένο όγκο ενός πολυενζυμικού. συμπλόκου.

1.6 Ενζυμική αναστολή

Ειδικά μικρά μόρια ή ιόντα αναστέλλουν ακόμη και μη αλλοστερικά ένζυμα.

Στη μη αντιστρεπτή αναστολή, ο αναστολέας ενώνεται ομοιοπολικά με το ένζυμο ή συνδέεται τόσο ισχυρά ώστε ο διαχωρισμός του από το ένζυμο να είναι πολύ αργός. Ομοιοπολικοί αναστολείς παρέχουν έναν τρόπο χαρτογράφησης του ενεργού κέντρου του ενζύμου.

Η αντιστρεπτή αναστολή χαρακτηρίζεται από μια ταχεία ισορροπία μεταξύ του ενζύμου και του αναστολέα.

Ένας συναγωνιστικός αναστολέας εμποδίζει το υπόστρωμα από την πρόσδεσή του στο ενεργό κέντρο. Ελαττώνει την ταχύτητα της αντίδρασης με το να ελαττώνει την αναλογία μορίων του ενζύμου που είναι προσδεμένα στο υπόστρωμα. Στη μη συναγωνιστική αναστολή, ο αναστολέας ελαττώνει τον αριθμό μετατροπής.

Η συναγωνιστική αναστολή μπορεί να διακριθεί από τη μη συναγωνιστική αναστολή, με το να προσδιοριστεί εάν η αναστολή μπορεί να υπερνικηθεί με αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος.

Η ουσία της κατάλυσης είναι η επιλεκτική σταθεροποίηση της μεταβατικής κατάστασης. Επομένως, ένα ένζυμο προσδένει τη μεταβατική κατάσταση περισσότερο στέρεα από ότι το υπόστρωμα.

Τα ανάλογα μεταβατικής κατάστασης είναι σταθερές ενώσεις οι οποίες μιμούνται βασικά χαρακτηριστικά του υψηλότερου ενεργειακού είδους. Είναι ισχυροί και ειδικοί αναστολείς των ενζύμων.

Η απόδειξη ότι η σταθεροποίηση της μεταβατικής κατάστασης είναι μια σημαντική εκδοχή της ενζυμικής δραστικότητας προέρχεται από την παραγωγή των καταλυτικών αντισωμάτων. Στην παραγωγή καταλυτικών αντισωμάτων χρησιμοποιούνται ως αντιγόνα ή ανοσογόνα, ανάλογα μεταβατικής κατάστασης.

20

1.6.1 Τα ένζυμα αναστέλλονται από ειδικά μόρια.Η αναστολή της ενζυμικής δραστικότητας από ειδικά μικρά μόρια και ιόντα είναι σημαντική γιατί αποτελεί έναν από τους κύριους μηχανισμούς ελέγχου στα βιολογικά συστήματα. Επίσης πολλά φάρμακα και τοξικοί παράγοντες δρουν με αναστολή της ενζυμικής δραστικότητας. Περαιτέρω, η ενζυμική αναστολή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για την κατανόηση του μηχανισμού της ενζυμικής δράσης. Κατάλοιπα αμινοξέων κρίσιμα για την κατάλυση μπορούν συχνά να προσδιοριστούν με τη χρησιμοποίηση ειδικών αναστολέων. Η ενζυμική αναστολή μπορεί να είναι είτε αντιστρεπτή είτε μη αντιστρεπτή. Ένας μη αντιστρεπτός αναστολέας διαχωρίζεται πολύ αργά από το ένζυμο-στόχο, γιατί συνδέεται πολύ ισχυρά με το ένζυμο, είτε ομοιοπολικά είτε μη ομοιοπολικά. Η δράση των νευροτοξικών αερίων (nerve gases) στην ακέτυλοχολινεστεράση, ένα ένζυμο που παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταβίβαση των νευρικών ώσεων, αποτελεί ένα πολύ καλό παράδειγμα μη αντιστρεπτής αναστολής. Ένας από αυτούς τους παράγοντες, το διϊσοπροπυλοφωσφοφθορίδιο (DIPF) αντιδρά με ένα κρίσιμο κατάλοιπο σερίνης στο ενεργό κέντρο του ενζύμου για να σχηματιστεί ένα ανενεργό διϊσοπροπυλοφωσφορυλο-ενζυμο (σχήμα). Αλκυλιωτικοί παράγοντες, όπως το ιωδοακεταμίδιο, αναστέλλουν μη αντιστρεπτά την καταλυτική δραστικότητα μερικών ενζύμων με το να τροποποιούν την κυστεΐνη και άλλες πλευρικές αλυσίδες.Η αντιστρεπτή αναστολή, σε αντίθεση με τη μη αντιστρεπτή αναστολή, χαρακτηρίζεται από έναν ταχύ διαχωρισμό του συμπλόκου ενζύμου-αναστολέα. Στη συναγωνιστική αναστολή το ένζυμο μπορεί να προσδένει υπόστρωμα (σχηματίζοντας το σύμπλοκο ES) ή αναστολέα (ΕΙ) αλλά όχι και τα δύο (ESI). Πολλοί συναγωνιστικοί αναστολείς μοιάζουν με το υπόστρωμα και προσδένονται στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Ένας συναγωνιστικός αναστολέας ελαττώνει την ταχύτητα της κατάλυσης με το να ελαττώνει την αναλογία μορίων του ενζύμου που είναι προσδεδεμένα με ένα υπόστρωμα.

Ένα κλασσικό παράδειγμα της συναγωνιστικής αναστολής είναι η δράση του μηλονικού οξέος στην ηλεκτρική αφυδρογονάση, ένα ένζυμο που αφαιρεί δύο άτομα υδρογόνου από το ηλεκτρικό οξύ. Το μηλονικό διαφέρει από το ηλεκτρικό στο ότι έχει μία αντί δύο μεθυλενικές ομάδες.

Ένα σημαντικό φυσιολογικό παράδειγμα συναγωνιστικής αναστολής βρίσκεται στο σχηματισμό του 2,3-διφωσφογλυκερικού (BPG) από το 1,3-διφωσφογλυκερικό. Η μουτάση του διφωσφογλυκερικού, το ένζυμο που καταλύει αυτό τον ισομερισμό, αναστέλλεται συναγωνιστικά ακόμα και από χαμηλές συγκεντρώσεις του 2,3-διφωσφογλυκερικού. Πράγματι δεν είναι ασυνήθιστο για ένα ένζυμο να αναστέλλεται συναγωνιστικά από το δικό του προϊόν, εξ’ αιτίας της δομικής ομοιότητάς του με το υπόστρωμα.

Η συναγωνιστική αναστολή μπορεί να ξεπεραστεί με αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος.Στη μη συναγωνιστική αναστολή, η οποία είναι επίσης αντιστρεπτή, ο αναστολέας και το υπόστρωμα μπορούν να προσδένονται ταυτόχρονα σ’ ένα μόριο ενζύμου. Αυτό σημαίνει ότι οι περιοχές πρόσδεσής τους δεν επικαλύπτονται. Ένας μη συναγωνιστικός αναστολέας δρα ελαττώνοντας τον αριθμό μετατροπής ενός ενζύμου, παρά με το να ελαττώνει την αναλογία των μορίων του ενζύμου που είναι προσδεδεμένα με το υπόστρωμα. Η μη συναγωνιστική αναστολή σε αντίθεση με τη συναγωνιστική αναστολή, δεν μπορεί να ξεπεραστεί με αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος.Ένα πιο περίπλοκο σχήμα, που ονομάζεται μεικτή αναστολή, παράγεται όταν ένας αναστολέας και επηρεάζει την πρόσδεση του υποστρώματος και μεταβάλλει τον αριθμό μετατροπής του ενζύμου.

21

1.6.2. Τα αλλοστερικά ένζυμα δεν υπακούουν στην κινητική Michaelis-Menten.

Το μοντέλο Michaelis-Menten έχει επηρεάσει πολύ την ανάπτυξη της χημείας των ενζύμων. Η ελκυστικότητά του έγκειται στην απλότητά του και στην ευρεία εφαρμογή του. Εν τούτοις, οι κινητικές ιδιότητες πολλών ενζύμων δεν μπορούν να εξηγηθούν από το μοντέλο Michaelis-Menten. Μία σημαντική ομάδα ενζύμων, τα αλλοστερικά ένζυμα, συχνά επιδεικνύουν σιγμοειδείς γραφικές παραστάσεις της ταχύτητας της αντίδρασης (V) σε συνάρτηση με τη συγκέντρωση του υποστρώματος (S), παρά ορθογώνιες υπερβολές που προβλέπονται από την εξίσωση Michaelis-Menten. Η καμπύλη πρόσδεσης του οξυγόνου στη μυοσφαιρίνη είναι ορθογώνια υπερβολή, ενώ η καμπύλη πρόσδεσης του οξυγόνου στην αιμοσφαιρίνη είναι σιγμοειδής. Η πρόσδεση των ενζύμων με τα υποστρώματα είναι ανάλογη. Στα αλλοστερικά ένζυμα, η πρόσδεση του υποστρώματος σε ένα ενεργό κέντρο μπορεί να επηρεάσει τις ιδιότητες των άλλων ενεργών κέντρων στο ίδιο μόριο. Ένα πιθανό αποτέλεσμα αυτής της αλληλεπίδρασης μεταξύ υπομονάδων είναι ότι η πρόσδεση του υποστρώματος γίνεται συνεργειακά, ώστε να προκύψει σιγμοειδής γραφική παράσταση της (V) σε συνάρτηση με το (S). Επιπλέον, η δραστικότητα των αλλοστερικών ενζύμων μπορεί να μεταβληθεί από ρυθμιστικά μόρια που προσδένονται σε διαφορετικές περιοχές από τα καταλυτικά κέντρα, όπως η πρόσδεση του οξυγόνου στην αιμοσφαιρίνη επηρεάζεται από το BPG, το Η+

και το CO2.

1.6.3 Η συναγωνιστική και η μη συναγωνιστική αναστολή είναι κινητικά διακριτές.

Επιστρέφουμε στα ένζυμα που υπακούουν στην κινητική Michaelis-Menten. Οι μετρήσεις των ταχυτήτων της κατάλυσης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις υποστρώματος και αναστολέα έχουν σκοπό τη διάκριση μεταξύ συναγωνιστικής και μη συναγωνιστικής αναστολής. Στη συναγωνιστική αναστολή η τεταγμένη επί την αρχή της γραφικής παράστασης της (1/V) σε συνάρτηση με την (1/[S]) είναι ίδια παρουσία ή απουσία του αναστολέα, αν και η κλίση είναι διαφορετική. Αυτό αντανακλά στο γεγονός ότι η Vmax δεν μεταβάλλεται από έναν συναγωνιστικό αναστολέα. Η σφραγίδα γνησιότητας της συναγωνιστικής αναστολής είναι ότι μπορεί να ξεπεραστεί από αρκετά υψηλή συγκέντρωση υποστρώματος. Σε αρκετά υψηλή συγκέντρωση υποστρώματος σχεδόν όλα τα ενεργά κέντρα καταλαμβάνονται από το υπόστρωμα, και έτσι το ένζυμο είναι πλήρως λειτουργικό. Η αύξηση της κλίσης της γραφικής παράστασης της 1/V σε συνάρτηση με την 1/[S] δείχνει την ισχύ της πρόσδεσης του συναγωνιστικού αναστολέα. Παρουσία ενός συναγωνιστικού αναστολέα η εξίσωση λαμβάνει τη μορφή:

Στην εξίσωση αυτή, [Ι ] είναι η συγκέντρωση του αναστολέα και Ki είναι η σταθερά διάστασης του συμπλόκου ενζύμου-αναστολέα:

και

Με άλλα λόγια η κλίση της γραφικής παράστασης αυξάνεται κατά έναν παράγοντα (1+[I ]/Ki) παρουσία ενός συναγωνιστικού αναστολέα.Για παράδειγμα ας θεωρήσουμε ένα ένζυμο με μία Km ίση με 10-4 Μ. Απουσία αναστολέα, η ταχύτητα V= Vmax/2 όταν το [S]= 10-4 M. Παρουσία όμως 2.10-3 M συναγωνιστικού αναστολέα που είναι προσδεδεμένος με το ένζυμο με μία Ki= 10-3 M, η φαινομενική Km θα είναι ίση με:

22

Η αντικατάσταση αυτών των τιμών στην εξίσωση Michaelis-Menten δίνει:

Στη μη συναγωνιστική αναστολή, η Vmax ελαττώνεται σε V’max και έτσι η τετμημένη

επί την αρχή αυξάνεται. Η καινούργια κλίση η οποία είναι (Km/ V’max), αυξάνεται

κατά τον ίδιο παράγοντα. Σε αντίθεση με τη Vmax η Km δεν επηρεάζεται από αυτό το είδος αναστολής. Η μη συναγωνιστική αναστολή δεν μπορεί να ξεπεραστεί με αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος. Η μέγιστη ταχύτητα παρουσία ενός μη συναγωνιστικού αναστολέα, V’

max δίνεται από:

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ1. Ο EC αριθμός ενός ενζύμου είναι:

A. Ο αριθμός των μορίων υποστρώματος που μετατρέπονται σε προϊόν, ανά μόριο ενζύμου και ανά δευτερόλεπτο.

B. Ο αριθμός των υπομονάδων που υπάρχουν στο ένζυμο.C. Ένας αριθμός ταξινόμησης που χρησιμοποιείται για να ταυτοποιεί με

ακρίβεια μία ενζυμική αντίδραση.D. Ο αριθμός των αμινοξέων που υπάρχουν στο μόριο του ενζύμου.E. Ένα μέτρο του βέλτιστου ΡΗ για την ενζυμική αντίδραση.

[Απ: C Ο αριθμός EC (Enzyme Commission) για μία ενζυμική αντίδραση καθορίζεται από 4 αριθμούς που διαχωρίζονται με τελείες. Ο πρώτος αριθμός δείχνει σε ποια από τις έξι κύριες κλάσεις ανήκει το ένζυμο. Ο δεύτερος αριθμός δείχνει την υποκλάση, και ο τρίτος την υπο-υποκλάση. Ο τέταρτος αριθμός είναι ο σειριακός αριθμός του ενζύμου στην υπο-υποκλάση].

2. Με ποια ενζυμική κλάση μπορεί να γίνει η προσθήκη νερού σε διπλό δεσμό άνθρακα-άνθρακα [>C=C<];

A. Υδρολάση.B. Λυάση.C. Οξειδο-ρεδουκτάση.D. Λιγκάση (Δεσμάση).E. Τρανσφεράση.

[Απ: Β Οι λυάσες είναι μία από τις έξι κύριες κλάσεις ενζύμων. Η καταλυτική τους δράση συνίσταται στην διάσπαση μιας ένωσης μη υδρολυτικά, και τη δημιουργία συνήθως ενός διπλού δεσμού στο ένα από τα δύο προϊόντα της διάσπασης. Αν το δούμε από τη σκοπιά της αντίστροφης αντίδρασης μπορούμε να θεωρήσουμε ότι συνενώνουν δύο ενώσεις προς σχηματισμό ενός ενιαίου μορίου, χωρίς τη χρήση ενώσεων υψηλής ενέργειας. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η προσθήκη νερού σε ένα διπλό δεσμό όπως πχ στην υδάτωση του φουμαρικού οξέος προς σχηματισμό μηλικού οξέος.

3. Η μεταβατική κατάσταση σε μία ενζυμική αντίδραση είναι:A. Το σταθερότερο μοριακό είδος στην πορεία της αντίδρασης.B. Το μακροβιότερο μοριακό είδος στην πορεία της αντίδρασης.C. Ένα μοριακό είδος με προσωρινή ύπαρξη, αλλά σχετικά σταθερό.D. Ένα σταθερό μοριακό ενδιάμεσο.E. Το ασταθέστερο μοριακό είδος στην πορεία της αντίδρασης.

[Απ: Ε Η μεταβατική κατάσταση στην πορεία της αντίδρασης, είναι εξ’ ορισμού το μοριακό είδος με την υψηλότερη ελεύθερη ενέργεια, επομένως το πλέον ασταθές. Μία εναλλακτική διατύπωση θα μπορούσε να είναι ότι είναι το μοριακό είδος με το

23

μικρότερο χρόνο ζωής. Πράγματι η μεταβατική κατάσταση έχει πολύ μικρά χρονικά διαστήματα ύπαρξης, της τάξης των 10-12 sec].

4. Τα ένζυμα δρουν ως καταλύτες διότι:A. Είναι απόλυτα εξειδικευμένα μόνο για ένα υπόστρωμα.B. Δεν μεταβάλλουν τη θέση θερμοδυναμικής ισορροπίας.C. Παραμένουν αναλλοίωτα στην αντίδραση που καταλύουν.D. Δεσμεύουν τη μεταβατική κατάσταση της καταλυόμενης αντίδρασης, πιο

σταθερά απ’ ότι δεσμεύουν το υπόστρωμα ή το προϊόν.E. Το ενεργό τους κέντρο είναι συμπληρωματικό με το υπόστρωμα της

αντίδρασης.[Απ: D Η θεωρία αυτή διατυπώθηκε στο περιοδικό Nature το 1948 από τον Linus Pauling. Το ένζυμο χαμηλώνει την ενέργεια ενεργοποίησης της καταλυόμενης αντίδρασης σταθεροποιώντας τη μεταβατική κατάσταση, που είναι το μοριακό είδος με την υψηλότερη ελεύθερη ενέργεια στην πορεία της αντίδρασης μεταξύ υποστρωμάτων και προϊόντων. Οι απαντήσεις A, B, C, παρά το ότι είναι σωστές, δεν εξηγούν την κατάλυση].

5. Οι μη καταλυόμενες αντιδράσεις μπορούν να διακριθούν από τις ενζυμικές διότι:

A. Οι μη καταλυόμενες πραγματοποιούνται σε μικρότερη θερμοκρασία.B. Οι ενζυμικές αντιδράσεις παράγουν ποικιλία προϊόντων από ένα και

μοναδικό υπόστρωμα.C. Οι μη καταλυόμενες αντιδράσεις είναι κορεσμένες με υπόστρωμα.D. Οι ενζυμικές αντιδράσεις δεν παρουσιάζουν κινητική πρώτης τάξεως ως

προς το υπόστρωμα, σε τιμές συγκέντρωσης μικρότερες από την Κm.E. Η ελεύθερη ενέργεια ενεργοποιήσεως είναι μικρότερη σε μία

ενζυμική αντίδραση.[Απ: Ε Οι ενζυμικές αντιδράσεις είναι απίστευτα πιο γρήγορες από τις αντίστοιχες μη καταλυόμενες αντιδράσεις σε υδατικό διάλυμα. Έτσι η ενέργεια ενεργοποιήσεως ΔG≠ γίνεται πολύ μικρότερη με την παρουσία του ενζύμου].

6. Για ένα καθαρό ένζυμο:A. Η Vmax επιτυγχάνεται σε μία minimum συγκέντρωση υποστρώματος.B. Η Κm είναι μέγιστη.C. Η Κm είναι ελάχιστη.D. Η ειδική ενεργότητα είναι μέγιστη.E. Η ειδική ενεργότητα είναι ελάχιστη.

[Απ: Ε Σε ένα καθαρό πρωτεϊνικό παρασκεύασμα η μόνη πρωτεΐνη που είναι παρούσα είναι αυτή του ενζύμου. Η παρουσία προσμίξεων θα αυξήσει το συνολικό πρωτεϊνικό περιεχόμενο και θα μειώσει την ενζυμική ενεργότητα. Συνεπώς σε ένα καθαρό ενζυμικό παρασκεύασμα η ενεργότητα είναι η μέγιστη. Γενικά η Km είναι ανεξάρτητη από την καθαρότητα, εκτός αν υπάρχει κάποιος παρεμποδιστής. Η Vmax είναι το όριο της μέγιστης ταχύτητας, η οποία προσεγγίζεται σε μεγάλες τιμές συγκέντρωσης του υποστρώματος (Η καμπύλη τείνει ασυμπτωτικά στην τιμή Vmax. Συνεπώς δεν μπορούμε να πούμε ότι η Vmax πραγματοποιείται για ορισμένη συγκέντρωση υποστρώματος].

Οι παρακάτω πληροφορίες αφορούν στις ερωτήσεις 7-14.Ο μερικός καθαρισμός της λυσοζύμης επιτεύχθηκε κρυσταλλώνοντας το ένζυμο από 80 ml ασπράδι αυγού. Μετρήσεις της πρωτεΐνης διενεργήθηκαν στο αρχικό ασπράδι αυγού, και στο καθαρισμένο διάλυμα λυσοζύμης (9ml). Μετρήσεις της ενεργότητας της λυσοζύμης διενεργήθηκαν στο αρχικό ασπράδι αυγού, στο καθαρισμένο διάλυμα λυσοζύμης και σε ένα πρότυπο καθαρό διάλυμα λυσοζύμης (20 μg/ml). Τα αποτελέσματα των μετρήσεων φαίνονται στον παρακάτω πίνακα.

24

Ασπράδι αυγού Καθαρισμένη Λυσοζύμη

Πρότυπη λυσοζύμη

Ενεργότητα λυσοζύμηςU/ml διαλύματος

18Αραίωση 1/250

16Αραίωση 1/800

15Χωρίς αραίωση

Πρωτεΐνημg/ml διαλύματος

160Αραίωση 1/500

110Αραίωση 1/200

20Χωρίς αραίωση

7. Ποια είναι η ειδική ενεργότητα σε U/μg του ασπραδιού του αυγού;A. 0,113B. 28C. 1,7D. 0,056E. 2,8

[Απ: D Η ειδική ενεργότητα ενός ενζυμικού παρασκευάσματος είναι ο αριθμός των μονάδων ενεργότητας ανά μονάδα μάζας πρωτεΐνης. Στην περίπτωση του ασπραδιού του αυγού έχουμε:

Άρα:

8. Ποια είναι η ειδική ενεργότητα σε U/μg της καθαρισμένης λυσοζύμης;A. 0,145B. 0,582C. 1,72D. 1,45E. 56

[Απ: Β Για την καθαρισμένη λυσοζύμη έχουμε:

9. Ποια είναι η ειδική ενεργότητα σε U/μg της πρότυπης λυσοζύμης;A. 1,33B. 0,75C. 7,5D. 13,3E. 0,13

[Απ: Β Στην περίπτωση της πρότυπης λυσοζύμης έχουμε:

25

10. Ποια είναι η καθαρότητα της λυσοζύμης στο ασπράδι του αυγού;A. 7,5%B. 75%C. 0,75%D. 0,075%E. 13,4%

[Απ: Α Ο βαθμός καθαρότητας δίνεται δίδεται ως ποσοστό της ειδικής ενεργότητας ως προς την καθαρή λυσοζύμη. Έτσι για το ασπράδι του αυγού έχουμε:

11. Ποια είναι η καθαρότητα της καθαρισμένης λυσοζύμης;A. 1,29%B. 0,78%C. 83%D. 0,83%E. 78%

[Απ: Α Ο βαθμός καθαρότητας δίνεται δίδεται ως ποσοστό της ειδικής ενεργότητας ως προς την καθαρή λυσοζύμη. Έτσι για την καθαρισμένη λυσοζύμη έχουμε:

12. Ποιος ο συνολικός αριθμός μονάδων λυσοζύμης στο ασπράδι του αυγού;A. 360000B. 1440C. 20000D. 14400E. 36000

[Απ: Α Η συνολική ποσότητα μονάδων λυσοζύμης στο ασπράδι του αυγού είναι:

Αυτή η ποσότητα είχε ληφθεί από 1 ml εκ των αρχικών 80 ml του ασπραδιού. Άρα για τα αρχικά 80 ml ασπραδιού έχουμε:

13. Ποια είναι η % ανάκτηση της λυσοζύμης από το ασπράδι του αυγού;A. 3,2%B. 32%C. 64%D. 6,4%E. 16%

[Απ: Β Η % ανάκτηση της λυσοζύμης είναι ο συνολικός αριθμός μονάδων ενζύμου στην καθαρισμένη λυσοζύμη, εκφρασμένη ως αναλογία (ποσοστό) επί του συνολικού αριθμού ενζυμικών μονάδων στο ασπράδι του αυγού.Η συνολική ποσότητα μονάδων λυσοζύμης στην καθαρισμένη λυσοζύμη είναι:

Αυτή η ποσότητα είχε ληφθεί από 1 ml εκ των αρχικών 9 ml της καθαρισμένης λυσοζύμης. Άρα για τα αρχικά 9 ml καθαρισμένης λυσοζύμης έχουμε:

26

Και το ποσοστό επί του συνολικού αριθμού ενζυμικών μονάδων στο ασπράδι του αυγού είναι:

14. Ποιος είναι ο βαθμός καθαρισμού που έχει επιτευχθεί;A. 1,5 φορέςB. 208 φορέςC. 104 φορέςD. 52 φορέςE. 10,4 φορές.

[Απ: Ε Ο βαθμός καθαρισμού δίνεται από την ειδική ενεργότητα της καθαρισμένης λυσοζύμης, εκφρασμένη ως ποσοστό της ειδικής ενεργότητας στο ασπράδι του αυγού.

15. Ποια από τις ακόλουθες διατυπώσεις δεν ισχύει όσον αφορά στην επίδραση της θερμοκρασίας στις ενζυμικές αντιδράσεις.A. Σε χαμηλές θερμοκρασίες η ταχύτητα σχεδόν διπλασιάζεται για κάθε 10 0C

αύξηση της θερμοκρασίας.B. Σε υψηλές θερμοκρασίες το ένζυμο μπορεί να μετουσιωθεί.C. Με τη μείωση της θερμοκρασίας τα μετουσιωμένα ένζυμα πάντοτε

επανακτούν την χαμένη ενεργότητα.D. Τα ένζυμα μετουσιώνονται όταν διατηρούνται είτε για μεγάλα χρονικά

διαστήματα σε μεσαίες θερμοκρασίες είτε για μικρά χρονικά διαστήματα σε υψηλές θερμοκρασίες.

E. Η θερμοκρασία στην οποία παρατηρείται το μέγιστο της ενεργότητας, εξαρτάται από το χρονικό διάστημα της μέτρησης.

[Απ: C Κατά κανόνα η μετουσίωση μιας πρωτεΐνης είναι μη αντιστρεπτή διαδικασία].

16. Ποια από τις ακόλουθες διατυπώσεις δεν ισχύει για τις ενζυμικές αντιδράσεις.

A. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος σε σχέση με την Κm, η αρχική ταχύτητα είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση του υποστρώματος.

B. Σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος σε σχέση με την Κm, η αρχική ταχύτητα είναι ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση του υποστρώματος.

C. Σε υψηλές συγκεντρώσεις υποστρώματος σε σχέση με την Κm, η αρχική ταχύτητα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ενζύμου.

D. Η μέγιστη ταχύτητα της αντίδρασης είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του υποστρώματος.

E. Εκείνη η συγκέντρωση υποστρώματος που δίνει αρχική ταχύτητα ίση με το μισό της μέγιστης, είναι μερικές φορές ένα καλό ενδεικτικό μέτρο της συγγένειας του ενζύμου για το υπόστρωμα.

[Απ: D Η αρχική ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης προσεγγίζει την οριακή τιμή Vmax σε μεγάλες τιμές αύξησης της συγκέντρωσης του υποστρώματος].

17. Το μοντέλο Michaelis-Menten για την ενζυμική δράση:A. Υποθέτει το σχηματισμό ομοιοπολικού ενδιαμέσου μεταξύ ενζύμου και

υποστρώματος.

27

B. Εξηγεί την αλλοστερική συμπεριφορά ορισμένων ρυθμιστικών ενζύμων.C. Εξηγεί την στερεοειδικότητα των ενζυμικών αντιδράσεων.D. Εξηγεί την καταλυτική απόδοση των ενζυμικών αντιδράσεων.E. Εξηγεί το φαινόμενο κορεσμού που παρατηρείται σε υψηλές συγκεντρώσεις

υποστρώματος.[Απ: Ε Το μοντέλο Michaelis-Menten για την ενζυμική δράση, υποθέτει ότι ένζυμο και υπόστρωμα, συνδέονται και σχηματίζουν ένα σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος ES. Αυτό το σύμπλοκο δεν απαιτεί το σχηματισμό ομοιοπολικού δεσμού μεταξύ ενζύμου και υποστρώματος. Η αλληλεπίδραση αυτή για το σχηματισμό του ES γίνεται μέσω μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων (Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, Δεσμοί Υδρογόνου, δεσμοί ιόντος-διπόλου, δεσμοί διπόλου-διπόλου, γέφυρες άλατος). Το μοντέλο Michaelis-Menten δεν μπορεί να εξηγήσει την αλλοστερική συμπεριφορά ορισμένων ρυθμιστικών ενζύμων, ούτε επίσης τη σερεοειδικότητα και καταλυτική απόδοση των ενζύμων].

18. Η μέγιστη ταχύτητα Vmax μιας ενζυμικής αντίδρασης είναι:A. Η μέγιστη ταχύτητα που μπορεί να επιτευχθεί σε ορισμένη θερμοκρασία και

τιμή ΡΗ.B. Η μέγιστη ταχύτητα που μπορεί να επιτευχθεί σε ορισμένη θερμοκρασία και

τιμή ΡΗ, για ορισμένη ποσότητα ενζύμου.C. Διπλάσια από την Κm.D. Η οριακή ταχύτητα για δεδομένη θερμοκρασία, ΡΗ, και συγκέντρωση

ενζύμου, καθώς η συγκέντρωση του υποστρώματος αυξάνεται.E. Ο αριθμός μετατροπής του ενζύμου.

[Απ: D Η μέγιστη ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης εξαρτάται από τη συγκέντρωση του ενζύμου. Έτσι για τον προσδιορισμό της Vmax η συγκέντρωση του ενζύμου καθώς και οι ιδιότητες του περιβάλλοντος μέσου πρέπει να είναι καθορισμένες. Η τιμή της Vmax πρέπει να θεωρείται ως η οριακή εκείνη ταχύτητα που προσεγγίζεται καθώς η συγκέντρωση του υποστρώματος αυξάνει απεριόριστα. Σε κάποιες περιπτώσεις δεν είναι πρακτικά δυνατό να προσεγγιστεί η τιμή της Vmax

κυρίως λόγω παραγόντων όπως η δυσδιαλυτότητα του υποστρώματος].

Οι ακόλουθες πληροφορίες αναφέρονται στις ερωτήσεις 19-24.Η εξάρτηση της αρχικής ταχύτητας μιας ενζυμικής αντίδρασης V συναρτήσει της συγκέντρωσης του υποστρώματος [S] μελετήθηκε πειραματικά προσθέτοντας την ίδια ποσότητα ενζύμου σε σειρές μιγμάτων αντίδρασης, που περιλάμβαναν διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις υποστρώματος. Οι τιμές της V καθορίστηκαν μετρώντας την ποσότητα του υποστρώματος που μετατρέπεται σε προϊόν ανά λεπτό μέσα στο μίγμα των αντιδραστηρίων. Οι όγκοι των μιγμάτων ήταν ίδιοι και καθένα περιείχε συνολική συγκέντρωση ενζύμου 10-9 Μ. Ελήφθησαν έτσι τα ακόλουθα πειραματικά δεδομένα:

[S]0 (M) V0 (μmol/min)1,25.10-2 0,51,25.10-3 0,51,25.10-4 0,451,25.10-5 0,251,25.10-6 0,0451,25.10-7 0,005

19. Ποια είναι η τιμή της Vmax όταν η συνολική συγκέντρωση του ενζύμου σε κάθε αντιδρόν μίγμα είναι 10-9 Μ;

[Απ: Ε Ο πίνακας δείχνει ότι αυξάνοντας η συγκέντρωση του υποστρώματος από 1,25.10-3 Μ σε 1,25.10-2 Μ δεν προκαλείται περαιτέρω αύξηση της αρχικής ταχύτητας, η οποία και παραμένει στα 0,5 μmol/min. Η τιμή αυτή είναι η Vmax].

28

20. Ποια είναι κατά προσέγγιση η τιμή της συγκέντρωσης του ελεύθερου ενζύμου [Ε] όταν η [S]0=1,25.10-2 M και η συνολική συγκέντρωση του ενζύμου είναι 10-9 Μ;A. 1,25.10-2 Μ.B. ΜηδένC. 1,25.10-5 ΜD. 0,25 μmol/minE. 0,50 μmol/min

[Απ: Β Όταν [S]0=1,25.10-2 M, η τιμή της Vmax έχει πρακτικά επιτευχθεί και όλα τα ενεργά κέντρα του ενζύμου είναι κορεσμένα με υπόστρωμα. Συνεπώς δεν υπάρχουν ελεύθερα μόρια ενζύμου, άρα η συγκέντρωση του ελεύθερου ενζύμου είναι σχεδόν μηδέν].

21. Ποια είναι η τιμή της Κm για το ένζυμο αυτό, όταν η συνολική συγκέντρωση του ενζύμου είναι 10-9 Μ;A. 10-9 ΜB. 1,25.10-2 ΜC. 0,25 μmol/minD. 0,50 μmol/minE. 1,25.10-5 M.

[Απ: Ε Η τιμή της Km είναι εκείνη η συγκέντρωση υποστρώματος στην οποία η ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης είναι η μισή της μέγιστης, δηλαδή Vmax/2. Εφ’ όσον η Vmax=0,5 μmol/min η Km είναι εκείνη η συγκέντρωση υποστρώματος που απαιτείται για να έχουμε αρχική ταχύτητα 0,25 μmol/min. Δηλαδή Km=1,25.10-5 M].

22. Ποια είναι η συνολική ποσότητα προϊόντος που σχηματίστηκε στο αντιδρόν μίγμα κατά τα πρώτα 5 min της αντίδρασης, όταν [S]0=5.10-2 M;A. 0,5 μmol.10-2 Μ θα υπάρχει επίσης κορεσμός και η ταχύτητα θα είναι

Vmax=0,5 μmol/min. B. ΜηδένC. 5.10-2 ΜD. 2,5 μmolE. 10-9 M.

[Απ: D Εφ’ όσον για συγκέντρωση υποστρώματος 1,25.10-2 Μ υπάρχει κορεσμός, για συγκέντρωση υποστρώματος 5.10-5 Μ θα υπάρχει επίσης κορεσμός και V=Vmax=0,5 μmol/min. Σε 5 min η ποσότητα προϊόντος που θα έχει παραχθεί θα είναι 0,5.5=2,5 μmol υποθέτοντας ότι η ταχύτητα μένει περίπου σταθερή σε αυτό το χρονικό διάστημα. Επειδή η συγκέντρωση του υποστρώματος είναι αρκετά μεγάλη, η μείωση της συγκέντρωσής του δεν θα προκαλέσει αισθητή μεταβολή της αρχικής ταχύτητας].

23. Ποια θα είναι η τιμή της Vmax εάν η ολική συγκέντρωση του ενζύμου διπλασιαστεί;A. 2,5.10-2 Μ.B. Μηδέν.C. 2,5.10-5 Μ.D. 0,50 μmol/min.E. 1,00 μmol/min.

[Απ: Ε Η Vmax είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ενζύμου. Διπλασιάζοντας τη συγκέντρωση του ενζύμου θα έχουμε Vmax=1,00 μmol/min].

24. Ποια θα είναι η τιμή της Km εάν η ολική συγκέντρωση του ενζύμου σε κάθε αντιδρόν μίγμα διπλασιαστεί;A. 2.10-9 Μ.B. 1,25.10-2 Μ.

29

C. 0,50 μmol/min.D. 1,25.10-5 M.E. 2,50.10-5 M.

[Απ: D Η Km είναι ανεξάρτητη της συγκέντρωσης του ενζύμου και δεν θα αλλάξει διπλασιάζοντας τη συγκέντρωση του ενζύμου. Αυτό καταδεικνύει ότι στο ένζυμο δεν προκαλείται αντίδραση αυτοσσυσσώρευσης, ή μεταβολές στις κινητικές του ιδιότητες.

ΑΣΚΗΣΕΙΣ1) Η υδρόλυση του πυροφωσφορικού σε ορθοφωσφορικό είναι σημαντική στο να οδηγεί προς τα δεξιά βιοσυνθετικές αντιδράσεις όπως τη σύνθεση του DNA. Αυτή η αντίδραση υδρόλυσης καταλύεται στο βακτήριο E.Coli από μια πυροφωσφατάση που έχει μοριακό βάρος 120 Kd και αποτελείται από 6 ίδιες υπομονάδες. Γι’ αυτό το ένζυμο, μία μονάδα δραστικότητας ορίζεται ως η ποσότητα του ενζύμου που υδρολύει 10 μmoles πυροφωσφορικού σε 15 λεπτά στους 37 0C κάτω από πρότυπες συνθήκες αντίδρασης. Το καθαρισμένο ένζυμο έχει μία Vmax ίση με 2800 μονάδες ανά mg ενζύμου.Α) Πόσα moles υποστρώματος υδρολύονται ανά δευτερόλεπτο ανά mg ενζύμου όταν η συγκέντρωση του υποστρώματος είναι πολύ μεγαλύτερη από την Km;Β) Πόσα moles ενεργών κέντρων υπάρχουν σε 1 mg ενζύμου; Υποθέστε ότι κάθε υπομονάδα έχει ένα ενεργό κέντρο.Γ) Ποιος είναι ο αριθμός μετατροπής του ενζύμου; Συγκρίνετε την τιμή αυτή με άλλες που αναφέρθηκαν.[Απ: (Α) 31,1 μmoles (Β) 0,05 μmoles (Γ) 622 s-1.

2) Η πενικιλίνη υδρολύεται από την πενικιλινάση (επίσης γνωστή ως β-λακταμάση), ένα ένζυμο που υπάρχει σε ορισμένα ανθεκτικά βακτήρια, και ως εκ τούτου καθίσταται ανενεργός. Το μοριακό βάρος αυτού του ενζύμου στο Stsphylococcus aureus ισούται με 29,6 Kd. Το ποσό της πενικιλίνης που υδρολύεται σε 1 λεπτό σε 10 ml διαλύματος που περιέχει 10-9 g καθαρής πενικιλινάσης μετρήθηκε ως συνάρτηση της συγκέντρωσης της πενικιλίνης. Υποθέστε ότι η συγκέντρωση της πενικιλίνης δεν αλλάζει σημαντικά κατά τη διάρκεια της αντίδρασης.Α) Δώστε το διάγραμμα 1/V σε συνάρτηση με την 1/[S] γι’ αυτά τα δεδομένα. Η πενικιλινάση ακολουθεί την κινητική Michaelis-Menten; Εάν είναι έτσι ποια είναι η τιμή της Km;Β) Ποια είναι η τιμή της Vmax;Ποιος είναι ο αριθμός μετατροπής της πενικιλινάσης κάτω από αυτές τις πειραματικές συνθήκες.Υποθέστε ένα ενεργό κέντρο για κάθε μόριο ενζύμου.

Πενικιλίνη Ποσότητα που υδρολύεται (moles)0,1.10-5 M 0,11.10-9 M0,3.10-5 M 0,25.10-9 M0,5.10-5 M 0,34.10-9 M1,0.10-5 M 0,45.10-9 M3,0.10-5 M 0,58.10-9 M5,0.10-5 M 0,61.10-9 M

[Απ: (Α) Μάλιστα ΚΜ=5,2.10-6 Μ (Β) Vmax=6,84.10-10 moles/min (Γ) 3,37 s-1.

3) Η πενικιλινάση (β-λακταμάση) υδρολύει πενικιλίνη. Συγκρίνετε την πενικιλίνη με την τρανσπεπτιδάση των γλυκοπεπτιδίων.

30

[Απ: Η πενικιλινάση, όπως και η τρανσπεπτιδάση των γλυκοπεπτιδίων, σχηματίζει μαζί με το υπόστρωμά της ένα ενδιάμεσο ακυλοενζύμου, μεταφέρει όμως το υπόστρωμά της στο νερό αντί στην τελική γλυκίνη της πενταγλυκινικής γέφυρας].

4) Η κινητική ενός ενζύμου μετράται ως μία συνάρτηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος παρουσία και απουσία 2 mM αναστολέα (Ι).

[S] μΜ Ταχύτητα σε μmole/minΧωρίς αναστολέα Με αναστολέα

3 10,4 4,15 14,5 6,4

10 22,5 11,330 33,8 22,690 40,5 33,8

Α) Ποιες είναι οι τιμές των Vmax και Km απουσία και παρουσία αναστολέα;Β) Τι τύπος αναστολής είναι αυτός;Γ) Ποια είναι η σταθερά διάστασης του συμπλόκου ενζύμου-αναστολέα;Δ) Εάν [S]=10 μΜ και [Ι]=2 mM, πόσα μόρια ενζύμου έχουν προσδεμένο υπόστρωμα; Πόσα έχουν προσδεμένο αναστολέα;Ε) Εάν [S]=30 μΜ, πόσα μόρια ενζύμου έχουν προσδεμένο υπόστρωμα παρουσία και απουσία 2 mM αναστολέα; Να συγκρίνετε τον λόγο αυτό με τον λόγο των ταχυτήτων της αντίδρασης κάτω από τις ίδιες συνθήκες.

4. Σύμφωνα με την εξίσωση Michaelis-Menten ποια είναι η τιμή του λόγου V/Vmax

όταν [S]=4Km;

[Απ: άρα:

31