ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΚΑΤΩΤΕΡΟΥ

ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΥ

ΙΩΑΝΝΗΣ Σ. ΠΑΠΑΔΑΚΗΣΕΙΔΙΚΕΥΟΜΕΝΟΣ ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΓΝΗ02-11-2011

ΑΝΑΤΟΜΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ

ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΥ

Ανώτερο αναπνευστικό Κοινό κρυολόγημα Ρινίτιδα Φαρυγγίτιδα Διφθερίτιδα

Αεραγωγοί Croup (οξεία λαρυγγίτιδα, λαρυγγοτραχειοβρογχίτιδα, επιγλωττίτιδα) Γρίπη Κοκκύτης Οξεία βρογχίτιδα Βρογχιολίτιδα

Κατώτερο αναπνευστικό

Πνευμονία

ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ ΚΑΤΩΤΕΡΟΥ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΥ

ΠΝΕΥΜΟΝΙΕΣ

ΠΝΕΥΜΟΝΙΑ

Λοίμωξη πνευμονικών κυψελίδων + παρεγχύματος

Διάγνωση πνευμονίας σχετικά απλή

δεδομένου ότι τόσοι πολλοί μικροοργανισμοί μπορούν

να προκαλέσουν πνευμονία, ο προσδιορισμός της αιτίας μιας πνευμονίας μπορεί να

είναι πολύ δύσκολος

ΠΑΘΟΓΟΝΑ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑΣ

πολυάριθμοι μικροοργανισμοί μπορούν να προκαλέσουν πνευμονία

συνήθως προκαλείται από βακτήρια

συνήθη παθογόνα πνευμονίας σχετίζονται με →• κατάσταση ανοσοποιητικού συστήματος ασθενούς, • περιβάλλον ασθενούς, • ηλικία ασθενούς,• τύπο πνευμονίας ασθενούς (π.χ., τυπική έναντι

διάμεσης πνευμονίας)

ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑ ΑΝΑΛΟΓΑ ΜΕ ΤΗΝ ΗΛΙΚΙΑ

ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑ ΣΕ ΣΥΣΧΕΤΙΣΜΟ ΜΕ ΤΟΝ ΤΥΠΟ ΤΗΣ

ΠΝΕΥΜΟΝΙΑΣ

ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑ ΣΕ ΣΥΣΧΕΤΙΣΜΟ

ΜΕ ΤΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΤΟΥ ΑΣΘΕΝΟΥΣ

ΠΑΘΟΓΟΝΑ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑ ΣΕ ΣΥΣΧΕΤΙΣΜΟ ΜΕ ΤΟΝ ΤΥΠΟ ΤΗΣ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑΣ ΚΑΙ ΤΟΝ

ΤΡΟΠΟ ΜΕΤΑΔΟΣΗΣ ΤΟΥ ΠΑΘΟΓΟΝΟΥ

ΔΙΑΦΟΡΟΙ ΤΥΠΟΙ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑΣΤΑ ΠΙΟ ΣΥΝΗΘΙΣΜΕΝΑ ΠΑΘΟΓΟΝΑ

ΑΙΤΙΑ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑΣ ΕΠΙ ΕΔΑΦΟΥΣ ΑΛΛΗΣ ΑΣΘΕΝΕΙΑΣ Η ΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ

ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑΣ ΤΗΣ ΚΟΙΝΟΤΗΤΑΣ

Βασικοί Εργαστηριακοί Άξονες

• Gram χρώση και καλλιέργεια πτυέλων• Καλλιέργεια αίματος • Ορολογικός έλεγχος• Αντιγονικές δοκιμασίες • Nucleic acid amplification tests

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑΣ πρόσθετες εργαστηριακές εξετάσεις που μπορούν να βοηθήσουν στην οριστική διάγνωση

Γενική αίματος – τύπος λευκοκυττάρων

Βιοχημικός έλεγχος – γλυκόζη, ουρία, ηλεκτρολύτες

Ορολογικός έλεγχος HIV με σύμφωνη γνώμη του ασθενούς

Αέρια αίματος

Gram χρώση και καλλιέργεια πτυέλων

καλλιέργειες αίματος για βακτηρίδια, μύκητες - θετικές στο 15-25% ενδονοσοκομειακών πνευμονιών

ορολογικός έλεγχος IgG, IgM – όχι ρουτίνα (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma)

έλεγχος P. jiroveci (PCP)

ορολογική ανίχνευση αντισωμάτων (π.χ., ψυχροσυγκολλητίνες M. Pneumoniae με < 25% θετικά αποτελέσματα, ανίχνευση αντισωμάτων καψιδίου S. pneumoniae)

αντιγόνα από τον παθογόνο παράγοντα (π.χ., για S. pneumoniae, H. Influenzae και RSV το χειμώνα)

έλεγχος για μύκητες

έλεγχος για Coxiella burnetii (αγρότες)

PCR σε δείγματα πτυέλων για να καθορίσουν γρήγορα την αιτία της πνευμονίας (π.χ. φυματίωση)

αντιγόνο ούρων Legionella

ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΚΑΤΩΤΕΡΟΥ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΥ

• πτύελα αποβαλλόμενα με φυσική απόχρεμψη

• πτύελα μετά από πρόκληση βήχα

• βρογχικά εκκρίματα ληφθέντα με προστατευμένη βούρτσα (PSB) – ευαισθησία 40-100%, ειδικότητα 50-80% - – αξιολόγηση ≥ 103cfu/ml αντανακλά σε 106 cfu/ml

• βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα(BAL) – ευαισθησία περίπου 70%, αξιολόγηση ≥ 104cfu/ml BAL

• βρογχικά εκκρίματα ληφθέντα με βιοψία (ανοιχτή διαβρογχική)

• βρογχικά εκκρίματα ληφθέντα με διατραχειακή αναρρόφηση (ΤΤΑ)

ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΚΑΤΩΤΕΡΟΥ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΥ

BAL

Πτύελα φυσική απόχρεμψη

προστατευμένη βούρτσα (PSB)

βρογχικά εκκρίματα διατραχειακή αναρρόφηση

ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΚΑΤΩΤΕΡΟΥ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΥ

• Οξεία πνευμονία –> πτύελα• Συνδεδεμένες με αναπνευστήρα πνευμονίες

–> βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα - BAL• Χρόνια πνευμονία –> πτύελα, BAL

Τα αποβαλλόμενα πτύελα πρέπει να λαμβάνονταιμετά από βαθύ βήχα

ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΠΤΥΕΛΩΝ• Σωστή καθοδήγηση ασθενών

– Λήψη τροφής απαγορευτική 1-2 ώρες πριν από την απόχρεμψη – Ξέπλυμα στόματος με φυσιολογικό ορό ή νερό – Βαθιές αναπνοές και βήχας από τον ασθενή

• Ο ασθενής θα πρέπει να αποβάλλει το περιεχόμενο σε αποστειρωμένο δοχείο • Η μεταφορά θα πρέπει να γίνεται άμεσα στο εργαστήριο (< 2 hr ) και ψύξη του

δείγματος αν καθυστερήσει η ανάλυση• Χρώση Gram και καλλιέργεια το συντομότερο δυνατό• Δεν θα πρέπει να γίνεται εργαστηριακή επεξεργασία σε δείγματα κάτω των 2 ml

που δεν είναι εμφανώς πυώδη• Μόνο 1 εξέταση ανά 24 hr θα πρέπει να προσκομίζεται• Θα πρέπει να χρησιμοποιείται κάποιο σύστημα βαθμονόμησης για την

απόρριψη δειγμάτων επιμολυσμένων με φυσιολογική χλωρίδα• Χειρισμός δειγμάτων χρησιμοποιώντας βασικούς κανόνες προφύλαξης στο

εργαστήριο

ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΛΗΨΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΠΤΥΕΛΩΝ

• Κύρια πηγή επιμόλυνσης δείγματος πτυέλων – βακτηριακές επιμολύνσεις από ανώτερο αναπνευστικό και λάρυγγα (π.χ. S. pneumoniae, H. influenzae)

• Τραχειοβρογχικό δέντρο στείρο ή με ελάχιστο αριθμό μικροοργανισμών σε υγιή άτομα

• Βακτηριακά παθογόνα κατώτερου αναπνευστικού ≥ 106/mL στις αναπνευστικού εκκρίσεις = «μέτρια" έως «μεγάλη" ανάπτυξη στην απομόνωση σε καλλιέργεια

• Καλύτερα τα πρώτα πρωινά δείγματα (ολονύχτιες εκκρίσεις πλούσιες σε παθογόνα)

ΜΑΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΠΤΥΕΛΩΝ ΚΑΙ ΣΥΣΧΕΤΙΣΜΟΣ ΜΕ ΠΑΘΟΓΟΝΑ

“Η καλλιέργεια δειγμάτων του κατώτερου αναπνευστικού μπορεί να οδηγήσει στις πιο ατελέσφορες προσπάθειες μικροβιολογικής

ανάλυσης από οποιοδήποτε άλλο τύπο δείγματος"

Raymond C Bartlett

ΕΠΙΜΟΛΥΝΣΕΙΣ ΑΠΟ ΟΡΟΦΑΡΥΓΓΑ

Viridans group streptococci άλλοι από τον Streptococcus pneumoniae

Coagulase-negative StaphylococcusNeisseria (σαπροφυτικά είδη)

Corynebacterium species

Αναπτύσσονται στην κλασική καλλιέργεια πτυέλων αλλά ΔΕΝ αναφέρονται

ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΧΛΩΡΙΔΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΥ

ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΠΑΘΟΓΟΝΑ ΑΝΩΤΕΡΟΥ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΥ

ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΠΑΘΟΓΟΝΑ ΤΩΝ ΑΕΡΑΓΩΓΩΝ

Bronchoalveolar Lavage (BAL) ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΤΗΤΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ

• Μικροσκοπική εξέταση με Gram χρώση– Αποδεκτό όταν < 1% των κυττάρων είναι

πλακώδη επιθηλιακά κύτταρα– Μη αποδεκτό όταν > 1% των κυττάρων είναι

πλακώδη επιθηλιακά κύτταρα

Thorpe JE et. al. 1987. Bronchoalveolar lavage for diagnosing acute bacterial pneumonia. J. Infect. Dis. 155:855-861

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΠΙΧΡΙΣΜΑΤΟΣ ΠΤΥΕΛΩΝ• Πλύσιμο πτυέλων με

φυσιολογικό ορό 1:1 3 φορές

• Θραύση πτυέλων με sputazole (1:1)

• Vortex• Κλίβανος στους 37οC

για 30 min• Vortex• 10 λεπτά στον πάγκο

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑΣ

Gram χρώση των πτυέλων από έναν ασθενή με υποψία

πνευμονίας μπορεί να είναι χρήσιμη για τον

τεκμηριωμένο προσδιορισμό της

αιτίας της πνευμονίας

Gram ΧΡΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΠΤΥΕΛΩΝ

Υποστηρικτές

Ο κυρίαρχος μορφότυπος στη χρώση Gram καθοδηγεί σε θεραπεία

Η ακρίβεια είναι καλή όταν χρησιμοποιούνταιαυστηρά κριτήρια

Μη δαπανηρή μέθοδος

Αμφισβητίες

Συνήθως κακή συλλογή

Υποκειμενικότητα εργαστηριακής ερμηνείας χρώσης Gram

Χαμηλή ευαισθησία και ειδικότητα

Εμπειρική θεραπεία με βάση κατευθυντήριες γραμμές

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΒΡΟΓΧΟΚΥΨΕΛΙΔΙΚΩΝ ΕΚΠΛΥΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΠΤΥΕΛΩΝ

• ΑιματούχοΒρογχικά (4 τρυβλία – τα 3 με αραιώσεις ομογενοποιημένου δείγματος 10-

3, 10-5, 10-7)Πτύελα (3 τρυβλία – τα 2 με αραιώσεις 10-5, 10-7)

• Σοκολατόχρωμο (4 τρυβλία στα βρογχικά με τις αντίστοιχες

αραιώσεις – 3 τρυβλία στα πτύελα με τις αντίστοιχες αραιώσεις)

• Chapman

• Sabouraud

• Drigalski

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΠΤΥΕΛΩΝ

Με ποσοτικό προσδιορισμό στο αιματούχο άγαρ, παρατηρείται γενικά μια κυρίαρχη ανάπτυξη ενός έως

τριών δυνητικών παθογόνων παραγόντων των αναπνευστικών οδών

Ευαισθησία καλλιέργειας πτυέλων για πνευμονιοκοκκική πνευμονία με βακτηριαιμία = 50-55%

Ευαισθησία καλλιέργειας πτυέλων για πνευμονία από Haemophilus influenzae με βακτηριαιμία = 53-66 %

Επιμόλυνση πτυέλων από αποικισμό gram αρνητικών = 32% καλλιεργειών

ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΠΤΥΕΛΩΝ ΚΑΙ ΕΝΔΟΤΡΑΧΕΙΑΚΩΝ ΑΝΑΡΡΟΦΗΣΕΩΝ

• Αξιολόγηση μικροβίων σε συγκέντρωση > 105

• Αναγνώριση και εκτέλεση δοκιμασιών τυποποίησης σε 2-3 δυνητικά παθογόνα που θεωρούνται ως κυρίαρχα στη χρώση Gram

• Δ/Δ S. pneumoniae από στρεπτοκόκκους ομάδας Α• Δ/Δ Cryptococcus neoformans από άλλους μύκητες• S. aureus, Gram (-) βάκιλλοι < φυσιολογική χλωρίδα, ποσοτικός

προσδιορισμός και περιορισμός στην αναφορά της ταυτότητας των παθογόνων που ανήκουν σε αυτήν

• Προσθήκη σχολίου ότι δεν υπάρχει κυρίαρχο παθογόνο στη Gram

• Ταυτοποίηση των μυκήτων, των μυκοβακτηριδίων ή των Nocardia spp.

.

Συνηθέστερα αίτια Πνευμονίας της Κοινότητας

• Streptococcus pneumoniae• Haemophilus influenzae• Moraxella catarrhalis• Staphylococcus aureus• Klebsiella pneumoniae

Streptococcus pneumoniae

• Gram(+) λογχοειδής διπλόκοκκος, καταλάση - , κατά ζεύγη ή μικρές αλυσίδες

• Αιματούχο, Σοκολατούχο (CO2%)• α-αιμόλυση, ‘ξάσπρισμα’ στο Σοκολατούχο,

σαν ‘πιατάκια’ στα παλιά καλλιεργήματα• Ε στην οπτοχίνη (για διαχωρισμό από

πρασινίζοντες)• + δοκιμασία διαλυτότητας στη χολή

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae

Haemophilus influenzae

• Gram(-) εξωκυττάριοι μικροί βάκιλοι/κοκκοβάκιλοι

• μόνο Σοκολατούχο (CO2%) (γκριζωπές στιλπνες αποικίες)

• Απαραίτητοι παράγοντες V και X (διαφορά με H.parainfluenzae: V)

Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae

Moraxella catarrhalis

• Gram(-) διπλόκοκκος, OX +, αυστηρά αερόβιο

• Αιματούχο, Σοκολατούχο (CO2%)

Moraxella catarrhalis

Staphylococcus aureus

• Gram (+) κόκκος δυνητικά αναερόβιος, καταλάση + , κοαγκουλάση +, σαν ‘σταφύλια’

• Αιματούχο (χρυσοκίτρινες αποικίες) Σοκολατούχο (CO2%), Chapman(κίτρινες αποικίες)• Β-αιμόλυση

S. aureus

Klebsiella pneumoniae

• Gram (-) βάκιλος,ακίνητος, δυνητικά αναερόβιος, ΟΧ (-), λακτόζη (+)

• Αιματούχο, Σοκολατούχο (CO2%),Drigalsky (κίτρινες αποικίες), Mc Conkey (ροζ αποικίες)

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑΣ

μερικά παθογόνα βάφονται κατά Gram ανεπαρκώς ή δεν χρωματίζονται κατά Gram, οπότε αν υπάρχει

υποψία για συγκεκριμένους παθογόνους παράγοντες είναι καλό να πραγματοποιούνται οι

ακόλουθες χρώσειςLegionella sp. - Dieterle silver stain

Μυκοβακτηρίδια – οξεάντοχη χρώση

Μύκητες ή Pneumocystis - Gomori methenamine silver stain

Legionella sp. - Dieterle silver stain

Ziehl – Neelsen οξεάντοχη χρώση

Gomori’s Silver Stain P. jiroveci

Lung Biopsy Impression Smear

ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΕΡΟΒΙΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ

Λόγω των επιμολύνσεων από τη φυσιολογική χλωρίδα, τα δείγματα πτυέλων και τα βρογχικά

εκπλύματα δεν ενδείκνυνται να μπαίνουν σε εμπλουτιστικό ζωμό ή αναερόβια καλλιέργεια

Μόνο τα δείγματα που προκύπτουν από διαδερμική αναρρόφηση(συμπεριλαμβανομένων των

διατραχειακών αναρροφήσεων) και με προστατευμένη βούρτσα είναι κατάλληλα για

αναερόβια ποσοτική καλλιέργεια – εμβολιασμός σε εμπλουτισμένο thioglycollate ζωμό, και

καλλιέργεια σε στερεά υλικά

Για εικαζόμενες περιπτώσεις νόσου λεγεωνάριων επώαση σε εκλεκτικό buffered charcoal –yeast

extract (BCYE) agar

ΕΚΛΕΚΤΙΚΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑΔείγματα από ασθενείς που είναι

γνωστό ότι έχουν κυστική ίνωση πρέπει να καλλιεργούνται σε

εκλεκτικό άγαρ, όπως το Chapman (μανιτόλη + άλας) για την ανάκτηση του S .aureus και εκλεκτικό σοκολατόχρωο άγαρ

με βακιτρακίνη για την ανάκτηση του H. influenzae που μπορεί να συγκαλυφθεί από τη βλεννώδη P.

aeroginosa σε συνήθη μέσα. Συνιστάται η χρήση επιλεκτικού

μέσου για B. cepacia, όπως PC ή OFPBL άγαρ.

ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΕΙΔΙΚΩΝ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑ

Legionella (καλλιέργεια σε ειδικό θρεπτικό υλικό, ούρα, ορολογική)

Chlamydophila pneumoniae (ορολογική)

Mycoplasma pneumoniae (ορολογική)

Αναερόβια βακτήρια (προστατευμένη βρογχοσκόπηση με βούρτσα για αναερόβια

καλλιέργεια)

Clin Microbiol Infect 2006; 12 (Suppl. 3): 12–24

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΗΣ LEGIONELLA

ΠλεονεκτήματαGold standard – δεν αφήνει καμία αμφιβολία για τη διάγνωσηΑπομονωθέντα παθογόνα επιτρέπουν το συσχετισμό με απομονωθέντα

παθογόνα του περιβάλλοντος σε μελέτες PFGE

ΜειονεκτήματαΑπαιτεί εκλεκτικά μέσα: BCYE άγαρΑπαιτεί χρόνο 5-7 ημερών για να αναπτυχθεί. Ενδοκυττάριο παθογόνο, οι ασθενείς συχνά δεν παράγουν πτύελα.

ΑΝΤΙΓΟΝΟ ΟΥΡΩΝ LEGIONELLA

• Μέθοδοι – RIA – Radio immuno assay– EIA – Enzyme Immuno assay– ICT - Immuno chromagraphic test (~pregnancy test).– Παροόμοια ευαισθησία και ειδικότητα

• Πλεονεκτήματα– Υψηλή ευαισθησία (80-90%) – Υψηλή ειδικότητα (~ 100%) – Ταχεία – διαρκεί μόνο λίγες ώρες

• Μειονεκτήματα– Αντιγόνο μπορεί να εντοπισθεί για μήνες μετά την προσβολή - αμφιβολίες σχετικά με την

πηγή μόλυνσης και στάδιο της νόσου– Ανιχνεύει μόνο L. pneumophila 1. (Αν και ορισμένες δοκιμασίες δίνοθν διασταυρούμενες

αντιδράσεις με τον ορότυπο 3). – Ορισμένοι ασθενείς δεν μπορούν να παράγουν ούρα

ΟΡΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΓΙΑ LEGIONELLA

• Πλεονεκτήματα– Επιτρέπει εκ των υστέρων μελέτες – Ορισμένες IFAs ανιχνεύουν IgM – Τα περισσότερα κιτ ανιχνεύουν L.

pneumophila οροτύπων 1-6

• Μειονεκτήματα– Απαιτούνται μήνες για να προβούμε σε μια

διάγνωση. – IFA έχει χαμηλότερη ειδικότητα – Μεμονωμένοι θετικοί τίτλοι μπορεί να είναι

χωρίς νόημα! – Δεν θα εντοπίζουν άλλους ορότυπους εκτός

από serogroups 1-6

Legionella sp. - Dieterle silver stain

Standardizing Chlamydia pneumoniae Assays:

Recommendations from the Centers for Disease

Control and Prevention (USA) and the

Laboratory Centre for Disease Control (Canada)

Scott F. Dowell,1 Rosanna W. Peeling,5 Jens Boman,6

George M. Carlone,1 Barry S. Fields,1 Jeannette Guarner,1

Margaret R. Hammerschlag,4 Lisa A. Jackson,2 Cho-Chou Kuo,3

Matthias Maass,7 Trudy O. Messmer,1 Deborah F. Talkington,1

Maria Lucia Tondella,1 Sherif R. Zaki,1 and the C. pneumoniae

Workshop Participants

‘There are no wholly satisfactory serological methods for diagnosis of C. pneumoniae

infection’

Clin Infect Dis 2001;33:492-502

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE

• Καλλιέργεια ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος

• Δοκιμασίες αντισωμάτων (ανοσοκαθήλωση συμπληρώματος και ανοσοφθορισμός) – ανίχνευση IgG, IgM, και IgA– Οξεία λοίμωξη τετραπλή

αύξηση τίτλου IgG, αύξηση τίτλουIgM >16,ή αύξηση τίτλου IgG >512.

– Παλιότερη ή παρελθούσα λοίμωξη : 16<IgG τίτλος<512

• Άμεση ανίχνευση αντιγόνου (άμεσος ανοσοφθορισμός [DFA] και ενζυμικές ανοσολογικές δοκιμασίες [EIA])

• Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)– Γρήγορη και ευαίσθητη

τυποποίηση– Περιορισμός στον έλεγχο

μικροβιακής αντοχής

CHLAMYDIA PNEUMONIAE

ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΣΤΗΝ ΟΡΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ

• Ανάγκη από κατάλληλα ζεύγη δειγμάτων ορού • Οξεία μόλυνση

– Αύξηση των IgM 2-3 εβδομάδες μετά την εκδήλωση – Υψηλός τίτλος IgG υψηλό μόνο μετά από 6-8 εβδομάδες

• Σε επαναμόλυνση τα IgM και IgG δεν αυξάνονται για 1-2 εβδομάδες

• Επίπεδα επίπεδα IgG χαρακτηριστικά σε κάποιες κοινότητες • Έλλειψη τυποποιημένων μεθόδων δοκιμής • Έλλειψη αντιδραστηρίων υψηλής ποιότητας • Υποκειμενική ερμηνεία • Ψευδή +ve IgM αποτελέσματα• Καλλιέργειες +ve, παρουσιάζουν MIF –ve!

ΠΝΕΥΜΟΝΙΑ ΑΠΟ Mycoplasma• Καλλιέργεια (οριστική

διάγνωση) – Πτύελα (συνήθως

σπάνια) ή εκπλύματα από τον λαιμό

– Ειδικό μεταφορικό μέσο σε υποψία M. pneumoniae

– Μπορεί να πάρει 2-3 εβδομάδες

• Ορολογικές εξετάσεις – Ανοσοκαθήλωση

συμπληρώματος (4 - 6 εβδομάδες) με τετραπλασιασμό τίτλου

– Ψυχροσυγκολλητίνες (1/3 - 2/3 των ασθενών)

• ELISA• PCR

Mycoplasma pneumoniae

ΠΤΥΕΛΑ ΧΡΟΝΙΑΣ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑΣ

Χρώση Gram για NocardiaΟξεάντοχη χρώση για μυκοβακτηρίδια

Χρώση Gomori methenamine silver ή χρώση periodic acid-Schiff (ιστόπλασμα) για μύκητες

Αρνητική χρώση σινικής μελάνης για κρυπτόκοκκο

Κυτταρολογική εξέταση για νεοπλασματικά κύτταρα και μύκητες

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΣΤΗ ΧΡΟΝΙΑ ΠΝΕΥΜΟΝΙΑ

• Μυκοβακτηρίδια: Lowenstein-Jensen slants, Middlebrook agars (7H10, 7H11, S7H11), Middlebrook broths

• Μύκητες: Brain heart infusion (BHI) agar, inhibitory mold agar (με chloramphenicol), cornmeal agar

Result Reporting of AFS

AFB* Acid Fast Bacilli

ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΓΙΑ ΤΒ

Ziehl – Neelsen οξεάντοχη χρώση

ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ IFN- ΣΕ ΟΛΙΚΟ ΑΙΜΑ QuantiFERON-TB Test

ESAT-6 CFP 10MitogenControl

TMB

COLOR

Stage 1 Whole Blood Culture

Stage 2 IFN-gamma ELISA

NilControl

Incubate → INF- from sensitized T-

cells

Draw blood + heparin

Aliquot blood & add antigen

Harvest plasma from above settled

cells

Measure [ IFN- g ] in ‘Sandwich’ ELISA

Computerizedinterpretation

QuantiFERON®-TB Gold Test MethodΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΚΑΙ ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ

• Πλεονεκτήματα: – Μόνο μία επίσκεψη απαιτείται– Αντικειμενική και αναπαραγώγιμη - Δεν εξαρτάται από το

χειριστή – Δε δίνει διασταυρούμενη αντίδραση με BCG, λίγες

διασταυρούμενες αντιδράσεις με μη-φυματιώδη μυκοβακτηρίδια

– Έλεγχος για χαμηλή ή καθόλου ανοσολογική απάντηση – Καμία πιθανότητα του εξέλκωσης λόγω της έντονης

αντίδρασης κατά τη δερματική δοκιμασία • Μειονεκτήματα: – Αίμα πρέπει να παραληφθεί στο εργαστήριο μέσα σε 12 ώρες – Εντατική εργασία για το εργαστήριο – Όχι πολλά στοιχεία για κάποιες ομάδες ασθενών

ευχαριστώ για την προσοχή σας