タンパク質の結晶成長

- 実は結晶成長のモデル系？ -

徳島大学工学部化学応用工学科鈴木良尚

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目次

1. 結晶成長基礎知識2. タンパク質結晶を研究する意味3. 結晶化機構のマクロな解析

（面成長速度）4. 結晶化機構のミクロな解析

（ステップ前進速度と二次元核生成頻度）

5. まとめ

2/39

結晶成長とは？

Si wafer, d = 300 mm, (100) oriented

希望の品質・サイズの結晶を得るためにその結晶の成長機構を研究する学問

相転移の非平衡統計力学の一分野

3/39

結晶の生い立ち

…….

臨界核

核生成 成長

ANG

4/39

過飽和度

過飽和度大→成長速度大 同じ過飽和度でも成長速度変

化→速度論的要因

kTCC e /)/ln(

5/39

結晶の育ち方

(a) 渦巻き成長

らせん転位

(b) 二次元核成長

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分子の結晶への取り込み過程

step

kink

w

s

h

Diffusion

Adsorption

Surface diffusion

Desorption

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目次

1. 結晶成長基礎知識2. タンパク質結晶を研究する意味3. 結晶化機構のマクロな解析

（面成長速度）4. 結晶化機構のミクロな解析

（ステップ前進速度と二次元核生成頻度）

5. まとめ

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モデルタンパク質

Glucose isomerase (from Streptomyces Rubiginosus)

asymmetric unit tetramer

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背景

Extraction

Purification

Structure Analysis

Bottle Neck!!!

Crystal Growth

*124

*89

*63

*19

*15*A summary of progress in the Human Proteome Structural Genomics PilotProject (http://proteome.bnl.gov/)

PDB holdings: 31306X-ray: 27188NMR: 4118(27-Sep-2005)

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モデルタンパク質

Glucose isomerase (from Streptomyces Rubiginosus)

asymmetric unit tetramer

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Visuri’s work50

300

0

t / min

Cry

stal

con

cen

trat

ion

/ g

l-1

200 MPa

150 MPa

100 MPa

0.1 MPa

K. Visuri et al.Bio/Technology8 (1990) 547.

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結晶の生い立ち

…….

臨界核

核生成 成長

ANG

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目次

1. 結晶成長基礎知識2. タンパク質結晶を研究する意味3. 結晶化機構のマクロな解析

（面成長速度）4. 結晶化機構のミクロな解析

（ステップ前進速度と二次元核生成頻度）

5. まとめ

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試料調製

Crystal Suspension

40℃ dissolution

0.45 mfiltration

StartingSolution

4 ℃ incubation

Seed crystals

Dilution

Solution forSolubilitymeasurements

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グルコースイソメラーゼ結晶

Space group: I222Unit cell*: a=9.388 nm, b=9.964 nm, c=10.290 nm (Z=2)

*Carrell, H. L.; Glusker, J. P.; Burger, V.; Manfre, F.; Tritsch, D.; Biellmann, J.-F. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989, 86, 4440-4444.

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Morphology of the glucose isomerase crystal

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過飽和度

過飽和度大→成長速度大 同じ過飽和度でも成長速度変

化→速度論的要因

kTCC e /)/ln(

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{101} 面の成長速度過飽和度依存性

0

1

2

-2 0 2

R /

nm

s-1

100 MPa0.1 MPa

19/39

2

19

aKR s

)exp()1))(exp(3

2exp( 26/13/2

1 k

kR

渦巻き成長

二次元核成長(Birth & Spread model)

22

2

2 3

)101(

Tkk

20/39

0

1

2

-2 0 2

R /

nm

s-1

100 MPa0.1 MPa

渦巻き成長二次元核成長

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p / MPa (101) / kT

0.1

100 1.8 ± 0.3

4.1 ± 0.3

ステップレッジ表面エネルギーの

圧力変化

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目次

1. 結晶成長基礎知識2. タンパク質結晶を研究する意味3. 結晶化機構のマクロな解析

（面成長速度）4. 結晶化機構のミクロな解析

（ステップ前進速度と二次元核生成頻度）

5. まとめ

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結晶の面成長速度のみ→不確定要素あり

単位ステップの前進速度および二次元核生成頻度の測定が必要（しかも高圧力下！）

レーザー共焦点微分干渉顕微鏡 # で可能！#G. Sazaki, T. Matsui, K. Tsukamoto, et. al. J. Cryst. Growth 2004, 262, 536-542.

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目的

ステップ前進速度の圧力依存性 二次元核生成頻度の圧力依存性

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その場観察用高圧容器

Φ3 ｍｍ

45 ゜

50 ｍｍ

Φ30 ｍｍ

50 ｍｍ

18.3 ｍｍ

TERAMECS Co., Ltd. Max 100 MPa

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Sapphire window

Objective lens(Olympus, SLCPlanFl 40 X, WD = 7.6 mm, NA = 0.55 )

7.6 mm

Crystal

高圧容器内の結晶の配置と顕微鏡の位置関係

LCM – DIM(Olympus, FV300 + IX71 + U-DICTHC )

27/39

P = 0.1 MPa, 26.4 , 5.6 mgml℃ -128/39

P = 50 MPa, 26.4 , 5.6 mgml℃ -129/39

x-y

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-100 -50 0 50 100

y-z

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150z-x

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

-50 0 50 100 150

6.935 nm

30/39

h101 = 7.0 ± 0.7 nm

31/39

ステップ前進速度

))(exp(22esurf

kink CCkT

hwsv

step

kink kink

w

s

h

32/39

ステップ前進速度の濃度依存性

0

1

2

3

0 2 4

Va

ve /

nm

s-1

C-Ce / mgml

-1

50 MPa

25 MPa

0.1 MPa

33/39

)2sin

4exp()exp(

2sin2

)exp(

220

222202/1

Tk

fh

kTCwh

f

kT

GnZfJ

adsurf

sats

二次元核生成頻度34/39

二次元核生成頻度の圧力依存性

0.00E+00

1.00E+06

2.00E+06

3.00E+06

4.00E+06

5.00E+06

6.00E+06

0 20 40 60

p / MPa

Js /

m-2

s-2

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二次元核生成頻度の過飽和度依存性

0

2 106

4 106

6 106

0 0.4 0.8 1.2 1.6

J s / m

-2s-2

/ -

50 MPa

25 MPa

0.1 MPa

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目次

1. 結晶成長基礎知識2. タンパク質結晶を研究する意味3. 結晶化機構のマクロな解析

（面成長速度）4. 結晶化機構のミクロな解析

（ステップ前進速度と二次元核生成頻度）

5. まとめ

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結論

Pressure V(101) Pressure 　　 Js(101) タンパク質結晶→ 結晶成長機構を探るモデル物質

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謝辞 本研究の一部は東北大学金属材料研究所研究部共同研究の

一環として行われました。改めて感謝申し上げます。

メンバー

佐崎　元 , 中嶋一雄 （東北大学金属材料研究所）

松本雅光 , 永澤眞（テラメックス株式会社）

田村勝弘（徳島大学工学部）　　

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x-y

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-100 -50 0 50 100

y-z

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150z-x

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

-50 0 50 100 150

6.935 nm

h101 = 7.0 ± 0.7 nm

z-x

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

z-x

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

z-x

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

z-x

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

z-x

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

Morphology of the glucose isomerase crystal

Growth rate of {101} face

100 MPa0.1 MPa

0

1

2

0 20 40 60

R /

nm

s-1

C / mg ml -1

Ce(0.1 MPa)=2.6±0.5 mg ml-1

Ce(100 MPa)=3.1±0.9 mg ml-1

0

0.1

0 4 8

(a) 0.0 sec (b) 19.2 sec

(c) 38.5 sec (d) 57.6 sec

x-y

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

x-y

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

x-y

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

x-y

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

x-y

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

Dimer 形成3053.98 kJ/molTetramer 形成1200.42 kJ/molTetramer 形成972.80 kJ/molTetramer 間219.67 kJ/mol

y-z

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

y-z

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

y-z

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

y-z

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

y-z

-50

-30

-10

10

30

50

70

90

110

130

150

-50 0 50 100 150

BackgroundUnfolding(denaturation)Activity

Pressure

Crystal

Molecule

Atmospheric pressure

Enzymaticactivity

背景背景 タンパク質は高圧力下で常圧下とは異なタンパク質は高圧力下で常圧下とは異な

る機能を発現（る機能を発現（ αα キモトリプシン、タカキモトリプシン、タカアミラーゼアミラーゼ AA など）など）

→→高圧力下での分子立体構造の変化が原高圧力下での分子立体構造の変化が原因？因？

Native

Denatured

T

p

背景背景 深海微生物の増殖速深海微生物の増殖速

度などは高圧力下で度などは高圧力下で最も高い最も高い

→→高圧力下で最も高高圧力下で最も高い活性を持つタンパい活性を持つタンパク質が存在ク質が存在

絶対高圧性細菌の生育プロファイル（海洋科学センター Deepstar group ）

以上の問題の解決のためには？以上の問題の解決のためには？

高圧力下でのタンパク質の分子構造の原高圧力下でのタンパク質の分子構造の原子レベルでの解明が必要子レベルでの解明が必要

NMRNMR （（ Rafaee, et al. J. Mol. Biol. Rafaee, et al. J. Mol. Biol. 2003, 327, 857-8652003, 327, 857-865 ）　）　

XX 線結晶構造解析線結晶構造解析

モデルタンパク質モデルタンパク質 Glucose isomerase (from Glucose isomerase (from Streptomyces RubiginosusStreptomyces Rubiginosus, ,

I222, a=9.388 nm b=9.968 nm c=10.290 nm)I222, a=9.388 nm b=9.968 nm c=10.290 nm)

asymmetric unit tetramer

Future works

3D structure analysis of the crystal of pressurized protein (ex situ or in situ)

Effects of pressure on the Enzymatic activity

Concentration distribution

Growth24.7℃, 100 MPa

Dissolution44.1℃, 100 MPa

EquilibriumGrowth Dissolution

Bulk concentration → C Interference fringes

Crystals

Interference fringes

TG TDTe< <

Solubility curves

0

10

20

30

40

290 300 310

Ce /

mg

ml-1

T / K

0.1 MPa100 MPa

Table 1 List of the pressure effects on the solubility and the growth kinetics

Proteins Solubility Growth kinetics

Lysozyme (tetragonal form) Increase Inhibit

Lysozyme (orthorhombic form) Decrease Inhibit

Purafect subtilisin Increase Inhibit

Thaumatin* Decrease ?

Glucose isomerase Decrease (This work)

Table k1 and k2 for glucose isomerase and hen egg-white lysozyme crystals

Pressure / MPaProteins and Coefficients

0.1 50 100

Glucose isomerase

{101} faces

k1 / nm s-1 7 ± 6 0.16 ± 0.08k2 18 ± 2 3 ± 1

Hen egg-white lysozyme

Tetragonal form [12]

{110} faces

k1 / nm s-1 0.8 ± 0.6 3 ± 4 (7 ± 37)X106

k2 4 ± 2 9 ± 3 50 ± 10

k2 (k1 fixed)* 4 ± 2 5.4 ± 0.2 9.6 ± 0.6

{101} faces

k1 / nm s-1 0.1 ± 0.1 0.3 ± 0.5 0.9 ± 0.6

k2 1 ± 2 4 ± 3 6 ± 2

k2 (k1 fixed)* 1 ± 2 2.0 ± 0.3 2.59 ± 0.08

Orthorhombic form [21]{011} faces

k1 / nm s-1 5 ± 1 1.7 ± 0.6

k2 2.0 ± 0.4 1.5 ± 0.5

Table 3 List of the molecular surface energy of hen egg-white lysozyme and

glucose isomerase crystals.

Pressure / MPaProtein

0.1 50 100

Glucose isomerase

{101} / kT 4.1 ± 0.3 1.8 ± 0.3

{101} / kT (k1(0.1 MPa) fixed) 4.1 ± 0.3 3.52 ± 0.04

{101} / kT (k1(100 MPa) fixed) 2.68 ± 0.04 1.8 ± 0.3

Hen egg-white lysozyme

Tetragonal form

{110} / kT 1.9 ± 0.4 2.9 ± 0.5 6.6 ± 0.9

{110} / kT (k1(0.1 MPa) fixed) 1.9 ± 0.4 2.27 ± 0.04 3.02 ± 0.09

{101} / kT 1.0 ± 0.7 1.9 ± 0.8 2.5 ± 0.3

{101} / kT (k1(0.1 MPa) fixed) 1.0 ± 0.7 1.4 ± 0.1 1.58 ± 0.05

Orthorhombic form

{011} / kT 1.4 ± 0.1 1.2 ± 0.2

{011} / kT (k1(0.1 MPa) fixed) 1.4 ± 0.1 1.68 ± 0.02

k1 (3

)1/ 3a13/ 3h4 / 30 2 / 3Ce

4 / 3

exp( ad 2kink

3kT)

glass slides

silicone tubes

crystal

0.9 mm

2.0 mm

15 mm

spacer

silicone tubesspacer

Inner cell

Thermodynamic relations

H RlnCe

(1 /T )

S Rln Xe RT ln Ce

T

V RTlnCe

p

van’t Hoff plot

1

2

3

4

0.00315 0.00325 0.00335 0.00345

lnC

e

T-1 / K -1

0.1 MPa100 MPa

Protein (crystal form)

Pressure

0.1 MPa 50 MPa 100 MPa

Lysozyme(tetragonal)

Glucose isomerase

H / kJ mol-1:

S / J mol-1 K-1:

130±10 110±20 70±10

160±40 210±60

420±100 580±180

Lysozyme(orthorhombic)

460±40 400±60 280±40

35±3 35±5

140±10 140±20

V / cm3 mol-1:

H / kJ mol-1:

H / kJ mol-1:

S / J mol-1 K-1:

S / J mol-1 K-1:

-18±46

V / cm3 mol-1 :

V / cm3 mol-1 :

5±18

54±31

Thermodynamic functions

Growth rate of {101} face

0

0.4

0.8

0 2 4 6 8

R /

nm

s-1

100 MPa

0.1 MPa

Growth rate and Supersaturation

G

GG

G

Spiral Growth

Two dimensinal nucleation Growth

=/kT=ln(C/Ce)

: supersaturation Ce : equilibrium concentration

Adhesive Growth

W.D.=25.5 mm

Light source and camera

Objective lens (super long W.D.)

Beam splitter

Reference mirror

Adjustable (10 mm)

Sapphire window

Gold mirror

Seed crystal

Solution

Silicone tube

Quartz glass

Interference cell

Peltier element

Water jacket

(a)

(b) Volume of the cell: 36 µl

0.9 mm

Michelson interferometer

High-pressure vessel

Inner cell