Исследование антиоксидантной активности Исследование антиоксидантной активности фитопрепарата фитопрепарата «Тигровый глаз - орто»«Тигровый глаз - орто»

Лункин В.В., Поляшова Т.И.Лункин В.В., Поляшова Т.И.

НПФ «МЕДИКОМЕД»НПФ «МЕДИКОМЕД»

Действие активных форм кислорода

(АФК) на клетки и ткани

Доза АФКДоза АФК

LowLow

HighHigh

ВыживаемостьВыживаемость

Гибель Гибель

АпоптозАпоптоз

НекрозНекроз

Задержка роста Задержка роста

и старениеи старение

Митогенетическое и Митогенетическое и

пролиферативное пролиферативное

действиедействие

Воздействие активных форм кислорода в высоких концентрацияхна клетки и ткани приводит к их повреждению и гибели, что является причиной многих заболеваний.

АФК в низких дозах способствуют выживаемости

Активные формы Активные формы кислородакислорода и болезнии болезни

Генетические аномалииведут к

недостаточности компонентов

NADPH оксидазы (CGD)

Аллергии и аутоиммунные заболевания

Опухоли и ракСоматические заболевания

(сахарный диабет)

Дисфункция адгезии фагоцитов,

ослабление или отсутствие респираторного взрыва,

секреторной дегрануляции, апоптоза

Дисфункция нейтрофилов

D A N G E RChemicalsRadiationMicrobial and virus infection

D A N G E RChemicalsRadiationMicrobial and virus infection

Free radicalsROS

Free radicalsROS

DNA damageDNA damage

CarcinogenesisCarcinogenesis

EndogenicExogenic

?

Oxygen radicals scavengers

• Предпосылки работы. Природные соединения и их композиции являются потенциальными экзогенными «ловушками» АФК и других свободных радикалов и требуют научного анализа для их практического применения.

• Задача работы состояла в исследовании антиоксидантной активности препарата

«Тигровый глаз – орто» на экспериментальных моделях in vitro: нефракционированной крови человека, изолированных гранулоцитах крови человека, ферментативной бесклеточной среде.

Объект и МетодОбъект и Метод

Работа проведена на клетках периферической нефракционированной крови, изолированных гранулоцитах человека и на модели ферментативной реакции

Интенсивность генерации АФК была оценена Интенсивность генерации АФК была оценена по люминол-зависимой хемилюминесценции с использованием по люминол-зависимой хемилюминесценции с использованием хемилюминометра хемилюминометра ХЕМИЛЮМ-12ХЕМИЛЮМ-12,, который позволяет проводить измерения который позволяет проводить измерения одновременно в 12 образцах.одновременно в 12 образцах.Прибор разработан в Лаборатории клеточной нейробиологии Института Прибор разработан в Лаборатории клеточной нейробиологии Института биофизики клетки РАН.биофизики клетки РАН.

ХЕМИЛЮМ-12Хемилюминометр роторный 12-ячеечный

ХЕМИЛЮМ-12 работает с пробами объемом от 0,1 до 0,3 мл, помещаемыми одновременно в 12 ячеек. В процессе регистрации на экране монитора выстраиваются 12 графиков; через каждые 2,5

секунды на каждом из них ставится очередная точка. Одновременная регистрация хемилюминесценции от 12 проб позволяет получить серию

измерений с использованием минимального количества исследуемого материала.Высокая чувствительность при стабильном уровне нуля, возможность регистрировать

быстрые изменения хемилюминесценции, - все это при большом числе одновременно анализируемых проб малого объема - главные отличительные черты прибора.

Âðåì ÿ, ñ

0 250 500 750 1000 1250

Èíò

åíñè

âíîñ

òü ã

åíåð

àöèè

ÀÔ

Ê,

óñë

. åä

.

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6Êî í òðî ëüÄî áàâêà ï ðåï àðàòà"Òèãðî âû é ãëàç - î ðòî "

0,25 ì ã/ì ëî ï ñî í èçèðî âàí í û éçèì î çàí

Ï ðåï àðàò ÒÃ-î ðò î ,ðàçâåäåí èå 104

Âðåì ÿ, ñ

0 250 500 750 1000 1250

Èíò

åíñè

âíîñ

òü ã

åíåð

àöèè

ÀÔ

Ê,

óñë

. åä

.

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6Êî í òðî ëüÄî áàâêà ï ðåï àðàòà"Òèãðî âû é ãëàç - î ðòî "

0,25 ì ã/ì ëî ï ñî í èçèðî âàí í û éçèì î çàí

Ï ðåï àðàò ÒÃ-î ðò î ,ðàçâåäåí èå 104

Âðåì ÿ, ñ

0 250 500 750 1000 1250

Èíò

åíñè

âíîñ

òü ã

åíåð

àö

èè À

ÔÊ

, óñ

ë.

åä.

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Êî í òðî ëü Äî áàâêà ï ðåï àðàòà "Òèãðî âû é ãëàç - î ðòî "

Ï ðåï àðàò ÒÃ -î ðò î ,ðàçâåäåí èå 102

0,25 ì ã/ì ëî ï ñî í èçèðî âàí í û éçèì î çàí

Âðåì ÿ, ñ

0 250 500 750 1000 1250

Èíò

åíñè

âíîñ

òü ã

åíåð

àö

èè À

ÔÊ

, óñ

ë.

åä.

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Êî í òðî ëü Äî áàâêà ï ðåï àðàòà "Òèãðî âû é ãëàç - î ðòî "

Ï ðåï àðàò ÒÃ -î ðò î ,ðàçâåäåí èå 102

0,25 ì ã/ì ëî ï ñî í èçèðî âàí í û éçèì î çàí

Препарат «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ - орто» дозозависимо понижал уровень продукции активных форм кислорода (АФК) в цельной крови человека. Высокий уровень АФК в крови является опасным и высокореактивным повреждающим фактором для клеток и тканей организма.

Проявление антиоксидантных свойств Проявление антиоксидантных свойств препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» в цельной крови препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» в цельной крови

человекачеловека

Нейтрофил - полиморфноядерный нейтрофильный гранулоцит

•Фагоцитоз•Дегрануляция•Респираторный взрыв

Фагоцитоз зимозана нейтрофилом (с любезного разрешения Dr. K.B.Pryzwansky)

5 мкм

1 – прикрепление частицы зимозана;2 – образование псевдоподии вокруг зимозана;3 - поглощение

Респираторный взрыв

0 19 20 2221

Time, min

fMLP

0

2

4

6

Inte

nsity

of C

hL, o

rb.u

nits

2NADPH + 4O2 = 2NADP+ + 4O2- + 2H+

0,5-1 0,5-1 nmol/nmol/минмин/10/106 6 клетокклеток

•Повышенная утилизация Повышенная утилизация глюкозыглюкозы•Усиленное потребление ОУсиленное потребление О22

•Активация Активация гексозомонофосфатного путигексозомонофосфатного пути•Усиленная продукция Усиленная продукция активных форм кислородаактивных форм кислорода

Активированная продукция АФКАктивированная продукция АФК

Спонтанный уровень продукции АФК

Реактивные формы кислорода

HOClHOCl1O21O2

OH·OH·H2O2H2O2O2

-·O2-·

NO2·NO2·

SODSOD

OO22--·

OO22

O2

HH22OO22 H2O

H2O

FeFe22

+

FeFe33+

NO

MPOMPO

OONO- HOONO

H2O

+ Cl-

nitrogen dioxide radicalperoxynitri

teanion

nitricoxide

hydrogenperoxide

hydroxylradical

singletoxygenhypochlorus

acid

superoxideanion radical

Антиоксидантные свойства препарата Антиоксидантные свойства препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто»«ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто»

Âðåì ÿ, ñ

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Ñïî

íòàí

íûé

óðî

âåíü

ÀÔ

Ê,

óñë

. å

ä.

-5

0

5

10

15

20

25

Êî í òðî ëüÒÃ - î ðòî , 10-6

ÒÃ - î ðòî , 10-5

ÒÃ - î ðòî , 10-4

ÒÃ - î ðòî , 10-3

Âðåì ÿ, ñ

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Ñïî

íòàí

íûé

óðîâ

åíü

ÀÔ

Ê,

óñë

. åä

.

-5

0

5

10

15

20

25

Êî í òðî ëüÒÃ - î ðòî , 10-6

ÒÃ - î ðòî , 10-5

ÒÃ - î ðòî , 10-4

ÒÃ - î ðòî , 10-3

Препарат «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» дозозависимо понижает высокий уровень спонтанной

продукции АФК изолированными нейтрофилами человека

Клетки были инкубированы с ТГ-орто в возрастающих концентрациях в течение 30 мин при 37оС

Ýô

ôå

êò,

%

0

20

40

60

80

100

Êî í òðî ëü

ÒÃ - î ðò î 10-6 10-5 10-4 10-3

Ýô

ôå

êò,

%0

20

40

60

80

100

Êî í òðî ëü

ÒÃ - î ðò î 10-6 10-5 10-4 10-3

Влияние препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» на Влияние препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» на опосредованную рецептором хемотаксического пептида опосредованную рецептором хемотаксического пептида продукцию АФК изолированными гранулоцитами крови продукцию АФК изолированными гранулоцитами крови

человекачеловека

Препарат ТГ-орто дозозависимо подавляет развитиереспираторного взрыва в изолированных гранулоцитах.

Клетки были инкубированы с ТГ-орто в различных разведениях при 37оС в течение 30 мин, затем активированы 1 мкМ N-формил-Met-Leu-Phe, чтобы вызвать респираторный взрыв.

Âðåì ÿ, ñ

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Èíò

åíñè

âíîñ

òü ã

åíåð

àöèè

ÀÔ

Ê,

óñë

. åä

.

0

50

100

150

200

250

300

1 - Êî í òðî ëü2 - ÒÃ-î ðòî , 10-6

3 - ÒÃ-î ðòî , 10-5

4 - ÒÃ-î ðòî , 10-4

5 - ÒÃ-î ðòî , 10-3

Õåì î òàêñè÷åñêèé ï åï òèäN-ô î ðì èë-Met-Leu-Phe1 ì êÌ

1

2

3

4

5

Âðåì ÿ, ñ

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Èíò

åíñè

âíîñ

òü ã

åíåð

àöèè

ÀÔ

Ê,

óñë

. åä

.

0

50

100

150

200

250

300

1 - Êî í òðî ëü2 - ÒÃ-î ðòî , 10-6

3 - ÒÃ-î ðòî , 10-5

4 - ÒÃ-î ðòî , 10-4

5 - ÒÃ-î ðòî , 10-3

Õåì î òàêñè÷åñêèé ï åï òèäN-ô î ðì èë-Met-Leu-Phe1 ì êÌ

1

2

3

4

5

Ýô

ôåê

ò, %

0

20

40

60

80

100

120

Êî í òðî ëü

Àì ï ëèòóäà î òâåòà í à 1 ì êÌ N-ô î ðì èë-Met-Leu-Phe

Ï ðåï àðàò ÒÃ-î ðò î 10-6 10-5 10-4 10-3

Ýô

ôåê

ò, %

0

20

40

60

80

100

120

Êî í òðî ëü

Àì ï ëèòóäà î òâåòà í à 1 ì êÌ N-ô î ðì èë-Met-Leu-Phe

Ï ðåï àðàò ÒÃ-î ðò î 10-6 10-5 10-4 10-3

Âðåì ÿ, ñ

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Èíò

åíñè

âíîñ

òü ã

åíåð

àöèè

ÀÔ

Ê,

óñë

. åä

.

-100

0

100

200

300

400

5001 - Êî í òðî ëü2 - ÒÃ-î ðòî , 10-6

3 - ÒÃ-î ðòî , 10-5

4 - ÒÃ-î ðòî , 10-4

5 - ÒÃ-î ðòî , 10-3

Õåì î òàêñè÷åñêèé ï åï òèäN-ô î ðì èë-Met-Leu-Phe50 ì êÌ 1

2

3

4

5

1

Âðåì ÿ, ñ

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Èíò

åíñè

âíîñ

òü ã

åíåð

àöèè

ÀÔ

Ê,

óñë

. åä

.

-100

0

100

200

300

400

5001 - Êî í òðî ëü2 - ÒÃ-î ðòî , 10-6

3 - ÒÃ-î ðòî , 10-5

4 - ÒÃ-î ðòî , 10-4

5 - ÒÃ-î ðòî , 10-3

Õåì î òàêñè÷åñêèé ï åï òèäN-ô î ðì èë-Met-Leu-Phe50 ì êÌ 1

2

3

4

5

1

Клетки были инкубированы с ТГ-орто в различных разведениях при 37оС в течение 30 мин, затем активированы 50 мкМ N-формил-Met-Leu-Phe, чтобы вызвать респираторный взрыв.

Влияние препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» Влияние препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» на опосредованную рецептором хемотаксического пептида на опосредованную рецептором хемотаксического пептида

продукцию АФК изолированными гранулоцитами крови человекапродукцию АФК изолированными гранулоцитами крови человека

Препарат ТГ-орто дозозависимо изменяет способность гранулоцитов продуцировать активные формы кислорода.

Ýô

ôåê

ò, %

0

20

40

60

80

100

120 Àì ï ëèòóäà î òâåòà í àN-ô î ðì èë-Met-Leu-Phe50 ì êÌ

Êî í òðî ëü

Ï ðåï àðàò ÒÃ-î ðò î 10-6

10-5

10-4

10-3

Ýô

ôåê

ò, %

0

20

40

60

80

100

120 Àì ï ëèòóäà î òâåòà í àN-ô î ðì èë-Met-Leu-Phe50 ì êÌ

Êî í òðî ëü

Ï ðåï àðàò ÒÃ-î ðò î 10-6

10-5

10-4

10-3

PDK

Участники передачи сигнала от рецептора fMLF

Рецептор fMLF

αiGiShc

Grb2

SOSGAP

ras

rafMAPKкаскад

PI3K

PKB/Akt

PI3P

PLC

Ca2+DAG

PKC

PAPLD

PA-AK

Кальмодулин

Ca2+-CK

Сигнальные пути, активируемые окислительным стрессом

HSF1HSF1HSF1HSF1

C-JunC-JunC-JunC-Jun

NF-kBNF-kBNF-kBNF-kB

STATSTATSTATSTAT

PLCPLCγγ11PLCPLCγγ11

PKCPKCPKCPKC

PI3KPI3KPKBPKB

PI3KPI3KPKBPKB JAKJAKJAKJAK

ERKERKJNKJNKp38p38

ERKERKJNKJNKp38p38

Gene expression Gene expression changeschanges

Gene expression Gene expression changeschanges

p53p53p53p53

АктивныеФормыКислорода

АктивныеФормыКислорода

(on J.L. Martindale & N.J. Holbrook, 2002, J.Cell.Physiol.)

DNA-PKDNA-PKDNA-PKDNA-PK

Оценка антиоксидантной активности Оценка антиоксидантной активности препарата препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ - орто»«ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ - орто» на модели на модели

супероксид-анион продуцирующей ферментативной реакциисупероксид-анион продуцирующей ферментативной реакции

Âðåì ÿ, ñ

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Èíò

åíñè

âíîñ

òü Õ

Ë, ó

ñë. å

ä.

0

10

20

30

40

50

60

Ñóï åðî êñèääèñì óòàçàÍ î âû é ëåêàðñòâåí í û éêî ì ï î í åí ò

Êñàí òèí + Êñàí òèí î êñèäàçà Ñóï åðî êñèä-àí èî í

Âðåì ÿ, ñ

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Èíò

åíñè

âíîñ

òü Õ

Ë, ó

ñë. å

ä.0

10

20

30

40

50

60

Ñóï åðî êñèääèñì óòàçàÍ î âû é ëåêàðñòâåí í û éêî ì ï î í åí ò

Êñàí òèí + Êñàí òèí î êñèäàçà Ñóï åðî êñèä-àí èî í

Препарат «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ - орто» дозозависимо ингибирует генерацию АФК в ферментативной бесклеточной реакции «ксантин – ксантиноксидаза».

В реакции «ксантин – ксантиноксидаза» продуцируется супероксид-анион радикал

Препарат

Âðåì ÿ, ñ

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300

Èí

òåí

ñèâí

îñò

ü ãå

íå

ðà

öè

è À

ÔÊ

, óñ

ë.

åä

.

0

20

40

60

80

1001 - Êî í òðî ëü

2 - ÒÃ - î ðòî , 10 -6

3 - 10-5

4 - 10-4

5 - 10-3

ÒÃ - î ðò î

3

4

5

Êñàí òèí

Êñàí òèí î êñèäàçà

2

.O2-

1

Âðåì ÿ, ñ

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300

Èí

òåí

ñèâí

îñò

ü ãå

íå

ðà

öè

è À

ÔÊ

, óñ

ë.

åä

.

0

20

40

60

80

1001 - Êî í òðî ëü

2 - ÒÃ - î ðòî , 10 -6

3 - 10-5

4 - 10-4

5 - 10-3

ÒÃ - î ðò î

3

4

5

Êñàí òèí

Êñàí òèí î êñèäàçà

2

.O2-

1

Выводы:• Антиоксидантная активность препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ –

орто» проявляется в цельной крови, на изолированных клетках и в ферментативной реакции.

• Препарат «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» обладает высокой антиоксидантной активностью в дозах, достигаемых при его разведении более чем в 100000 раз.

• Антиоксидантное действие исследуемого препарата направлено на супероксид-анион радикал, который является исходной формой активных интермедиатов кислорода.

Предполагается, что применение препарата может быть полезным при заболеваниях, сопровождающихся дисфункцией фагоцитов, связанной с избыточной нерегулируемой продукцией АФК.

Работа выполнена совместно с сотрудникамиЛаборатории клеточной нейробиологииИнститута Биофизики клетки Российской Академии Наукг. Пущино

Благодарности

Сафронова В.Г.Мальцева В.Н.Кротова Л.М.

Санталов Б.Ф.