11

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ Кафедра біотехнології мікробного синтезу

Розробка технології інтерферонів І типу з використанням конструктивно оформленої індукторної системи багаторазової дії

к.т.н., доц. Пенчук Ю.М.,

Київ 2007

22

Мета дослідження Метою роботи є розробка нової технології отримання препаратів ІФН І типу з використанням комплексної індукторної системи дріжджова РНК-гідрохлорид тилорону, іммобілізованої на нерозчинному носії.

Задачі дослідження:

1.конструювання штучних конструкцій для здійснення процесу індукції ІФН І типу (α/β-ІФН) в умовах in vitro на основі молекулярних комплексів дріжджової РНК, яка ковалентно приєднана до нерозчинних гранулярних матриць, з гідрохлоридом тилорону (ІММК);

2.дослідне визначення кількісних та часових параметрів синтезу ІФН клітинами-продуцентами під дією контактів з гранулами ІММК в середовищі культивування;

3.розробка та конструювання установки для отримання ІФН в умовах in vitro з використанням моношарових та суспензійних клітинних культур, індукованих за допомогою ІММК;

4.експериментальна оцінка ефективності інтерфероногенезу в культурах обох типів під дією ІММК за різних технологічних умов, оптимізація параметрів біосинтезу ІФН в дослідній установці, як прототипі промислової апаратури, з застосуванням ІММК у якості інтерфероногену.

33

СХЕМА КОНСТРУЮВАННЯ ІНТЕРФЕРОНІНДУКУЮЧИХ МОЛЕКУЛЯРНИХ КОМПЛЕКСІВ

А - утворення інтерфероногенних дволанцюгових ділянок у складі одноланцюгової РНК під дією зв’язування з тилороном;

Б - конструювання часток ІММК

А

Б

А

Б

44

ВМІСТ РИБОПОЛІНУКЛЕОТИДІВ У ПРЕПАРАТАХ ІММК,

СТВОРЕНИХ НА ОСНОВІ РІЗНИХ ГРАНУЛЯРНИХ НОСІЇВ

НосійРозмір часток (мкм)

Ридостинмкг/г

poly(I)-poly(С)мкг/г

Дріжджова РНК,мкг/г

Сефадекс G-50

50-150 22,2 21,7 24,6

Сефароза 4В 60-140 27,1 26,8 29,3

Сферон 300 63-100 30,0 28,7 31,8

55

0

3,5

7

Сферон дріжджоваРНК

РНК-сферон РНК-сферон+ тилорон(ІММК)

РНК-тилорон

Тилорон Інтактнілейкоцити

Титр

ІФН,

log

2

ІНТЕРФЕРОНОГЕННА ДІЯ ІММК НА ОСНОВІ СФЕРОНУ, А ТАКОЖ ЙОГО ОКРЕМИХ КОМПОНЕНТІВ, НА ЛЕЙКОЦИТИ КРОВІ ЛЮДИНИ

66

ІНТЕРФЕРОНОГЕННА ДІЯ РІЗНИХ ІММК НА МОНОШАРОВІ КУЛЬТУРИ КЛІТИН

Тип ІММКТитри індукованого ІФН, МО/106

клітин

ПТП L-41 L-929

Сефадекс G-50+ РНК-тилорон 195 143 100

Сефадекс G-50+ ридостин 195 50 5

Сефадекс G-50+ poly(I)-poly(С) 300 200 125

Сефароза 4В+ РНК-тилорон 195 100 97

Сефароза 4В+ ридостин 26 17 20

Сефароза 4В+ poly(I)-poly(С) 250 136 130

Сферон 300+ РНК-тилорон 550 317 390

Сферон 300+ ридостин 275 234 170

Сферон 300+ poly(I)-poly(С) 456 290 230

77

РІВНІ ІНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗУ В МОНОШАРОВИХ КУЛЬТУРАХ КЛІТИН ПІД ДІЄЮ РОЗЧИННИХ ТА ІММОБІЛІЗОВАНИХ ІНДУКТОРІВ

Індуктори

Титри індукованого ІФН, (log2)

L929 L41 ПТП

Ридостин 3,8 3,3 4,8

poly(I)-poly(С) 3,7 4,6 3,5

Дріжджова РНК-тилорон

4,0 3,6 3,6

Ридостин іммоб. 4,8 3,5 4,9

рoly(I)-poly(С) іммоб. 2,8 3,2 3,8

Дріжджова РНК-тилорон іммоб.

2,23 2,7 3,5

Контроль 0,16 0,15 0,17

88

0

1

2

3

4

0 3 6 9 12 15 18

Час культивування, год

Ти

тр і

нте

рфер

ону,

log

2

1

2

3

КІНЕТИКА НАКОПИЧЕННЯ ІФН ПІД ІНДУКТОРНОЮ ДІЄЮ ІММК МОНОШАРОВИМИ КЛІТИННИМИ КУЛЬТУРАМИ: 1 – ПТП; 2 – L41; 3 – L929

99

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4

Цикли регенерації

Інд

укто

рн

а ак

тивн

ість

(%

)

0

20

40

60

80

100

Вм

іст

РН

К (

%)1

2

ЗМІНА ПАРАМЕТРІВ ІММК НА БАЗІ СФЕРОНУ У ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД КІЛЬКОСТІ ЦИКЛІВ РЕГЕНЕРАЦІЇ.

1 – ІНДУКТОРНА АКТИВНІСТЬ ІММК; 2 – ВМІСТ РНК

1010

ІНТЕРФЕРОНОГЕННА ДІЯ РІЗНИХ ІММК В УМОВАХ СУСПЕНЗІЙНОГО КУЛЬТИВУВАННЯ ЛЕЙКОЦИТІВ КРОВІ ЛЮДИНИ

Тип ІММККількість індукованого

ІФН, МО/мл

Лейкоцити

Сефадекс G-50 + РНК-тилорон 677

Сефадекс G-50 + ридостин 540

Сефадекс G-50 + poly(I)-poly(С) 989

Сефароза 4В + РНК-тилорон 344

Сефароза 4В + ридостин 100

Сефароза 4В + poly(I)-poly(С) 550

Сферон 300 + РНК-тилорон 1800

Сферон 300 + ридостин 780

Сферон 300 + poly(I)-poly(С) 2000

1111

РІВНІ ІНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗУ В СУСПЕНЗІЙНІЙ КУЛЬТУРІ ЛЕЙКОЦИТІВ КРОВІ ЛЮДИНИ ПІД ДІЄЮ РОЗЧИННИХ ТА

ІММОБІЛІЗОВАНИХ НА СФЕРОНІ 300 ІНДУКТОРІВ ПОЛІНУКЛЕОТИДНОЇ ПРИРОДИ

ІндукториТитри індукованого ІФН,

(log2)

Ридостин 3,7

poly(I)-poly(С) 5,7

Дріжджова РНК-тилорон 6,4

Ридостин іммоб. 3,4

рoly(I)-poly(С) іммоб. 5,9

Дріжджова РНК-тилорон іммоб.

5,25

Контроль 0,17

1212

0

1000

2000

0 6 12 18

Час культивування, год

Кіл

ькіс

ть ін

терф

ерон

а, М

О/м

л

КІНЕТИКА НАКОПИЧЕННЯ ІФН СУСПЕНЗІЙНОЮ КУЛЬТУРОЮ

ЛЕЙКОЦИТІВ КРОВІ ЛЮДИНИ ЗА ІНДУКТОРНОЇ ДІЇ ІММК

1313

ЗАГАЛЬНИЙ ВИГЛЯД УСТАНОВКИ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ

1414

ємність для культивування клітин

фіксаторгумова кришка

КРІПЛЕННЯ ЄМНОСТІ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ

СХЕМА ДОСЛІДНОЇ УСТАНОВКИ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН ТА БІОСИНТЕЗУ ІНТЕРФЕРОНУ

1515

0

0,5

1

0 4 8

Час культивування, год

Кіл

ькіс

ть ж

ивих

клі

тин,

мл

н./м

л 2

1

ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ КЛІТИН В

СУСПЕНЗІЙНІЙ КУЛЬТУРІ

0

0,5

1

1,5

2

0 4 8

Час культивування, год

Кіл

ькіс

ть ж

ивих

клі

тин,

мл

н./ м

л

1

2

ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА ЖИТТЄЗДАТНІСТЬ КЛІТИН В МОНОШАРОВІЙ КУЛЬТУРІ ПТП

1 – стаціонарні умови2 – культивування в дослідній установці

1616

0

900

1800

Cуспензійнакультура

МоношаровакультураК

ільк

ість

інте

рфер

ону,

МО

/мл

ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ КЛІТИН-ПРОДУЦЕНТІВ ІФН З ІММК КІЛЬКІСТЬ СИНТЕЗОВАНОГО ІФН

- культивування в дослідній установці;

- стаціонарні умови культивування

1717

– ПТП; – L41; – L929.

ЗАЛЕЖНІСТЬ РІВНІВ ІНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗУ МОНОШАРОВИМИ

КУЛЬТУРАМИ ВІД ПОЧАТКОВОЇ КОНЦЕНТРАЦІЇ КЛІТИН

0

350

700

10^5 5×10 10^6 5×10^6 10^7 5×10^7

Концентрація клітин-продуцентів, кл/мл

Кіл

ькіс

ть ін

терф

ерон

у, М

О/м

л

105 5×105 106 5×106 107 5×107

1818

0

1000

2000

3000

10^5 5×10^5 10^6 5×10^6 10^7 5×10^7

Концентрація клітин-продуцентів, кл/мл

Кіль

кіст

ь інт

ерфе

рону

, МО/

мл

5×105105 106 5×106 107 5×107

ЗАЛЕЖНІСТЬ РІВНІВ ІНТЕРФЕРОНОГЕНЕЗУ ЛЕЙКОЦИТАМИ

ВІД ПОЧАТКОВОЇ КОНЦЕНТРАЦІЇ КЛІТИН

1919

0

50

100

10/1 1/1 1/10 1/100 1/1000

Відношення часточок індуктору до клітин

Вижи

ваєм

ість к

літи

н, %

ЗАЛЕЖНІСТЬ ЖИТТЄЗДАТНОСТІ КЛІТИН ВІД СПІВВІДНОШЕННЯ ЧАСТОК ІММК ДО КЛІТИН

0

5

10

10/1 1/1 1/10 1/100 1/1000

Відношення часточок ІММК до клітин

Титр

ІФН,

log

2

ЗАЛЕЖНІСТЬ ВИХОДУ СИНТЕЗОВАНОГО ІФН ВІД СПІВВІДНОШЕННЯ ЧАСТОК ІММК

ДО КЛІТИН

– суспензійна культура,

– моношарова культура (ПТП)

2020

АПАРАТУРНА СХЕМА ОТРИМАННЯ ІНТЕРФЕРОНУ І ТИПУ З ВИКОРИСТАННЯМ ІММОБІЛІЗОВАНОЇ ІНДУКТОРНОЇ СИСТЕМИ

БАГАТОРАЗОВОЇ ДІЇ

1 - З ЛЕЙКОЦИТІВ 2 - З КУЛЬТУР КЛІТИН

2121

ВИСНОВКИ1.Розроблено технологію одержання препаратів інтерферону І типу з використанням імобілізованого

молекулярного комплексу (ІММК) у якості індуктору, яка дає змогу використовувати ІММК впродовж шести циклів інтерфероногенезу.

2.Сконструйовано штучні конструкції для здійснення процесу індукції ІФН І типу (α/β-ІФН) в умовах in vitro на основі молекулярних комплексів дріжджової РНК, яка ковалентно приєднана до нерозчинних гранулярних матриць, з гідрохлоридом тилорону. Показана інтерфероногенна здатність таких конструкцій, вивчена динаміка синтезу індукованого ними ІФН і доведена його належить до ІФН І типу (α/β-ІФН).

3.Досліджено значення величин ζ-потенціалів індукторних систем на основі Сферону 300 та лейкоцитів: (-3,9 mV) – Сферон 300-РНК; (-4,6 mV) – Сферон 300-ридостин; (-5,2 mV) – Сферон 300-poli(I)-poli(C); лейкоцити (-13,5 mV)

4.Встановлено, що вміст іммобілізованих рибополінуклеотидів в отриманих індукторних системах становить (мкг/г): на основі Сферону 300 (РНК – 31,8±2,6, ридостин – 30±2, poli(I)-poli(C) – 28,7±3); на основі Сефадексу G-50 (РНК – 24,6±1,2, ридостин – 22,2±1,6, poli(I)-poli(C) – 21,7±3,9); на основі Сефарози 4В (РНК – 29,3±2, ридостин – 27,1±3, poli(I)-poli(C) – 26,8±3,9).

5.Визначено кількісні та часові параметри синтезу ІФН клітинами-продуцентами суспензійної та моношарових культур під дією контактів з гранулами ІММК в середовищі культивування. Встановлено, що найвищого рівня продукція ІФН лейкоцитами крові людини досягає на 10 год, ПТП – через 4 год, L-41 – через 3 год, а L-929 – через 5 год.

6.Розроблено і сконструйовано дослідну установку, яка може слугувати прототипом промислової апаратури при одержанні ІФН в умовах in vitro індукованого за допомогою ІММК з застосуванням моношарових та суспензійних клітинних культур.

7.Експериментально оцінено ефективність та проведено підбір технологічних параметрів інтерфероногенезу в культурах обох типів під дією ІММК. Встановлено, що оптимальними параметрами інтерфероногенезу є швидкість обертів валу 5 об/год, вміст сироватки великої рогатої худоби 17 %, співвідношення клітин-продудентів до часточок індуктору 100 до 1.

8.Розроблено апаратурно-технологічну схему отримання інтерферону І типу для обох типів досліджених культур з використанням іммобілізованої індукторної системи багаторазової дії.

2222

ДякуюДякую за увагу!за увагу!