БИОТРАНСФОРМАЦИЯ НА БИОТРАНСФОРМАЦИЯ НА СЪЕДИНЕНИЯ С ЕСТРОГЕННА СЪЕДИНЕНИЯ С ЕСТРОГЕННА

АКТИВНОСТАКТИВНОСТ

Презентация на

Доц. Светлана Фоткова Георгиева, дф

Замърсяването на околната среда с ксенобиотици е един от най-съществените глобални проблеми на съвременната цивилизация.

Към групата на ксенобиотиците се отнасят и веществата с естрогенна активност (ендокринни деструктори).

Ендокринният деструктор е екзогенно вещество, което изменя функцията на ендокринната система и предизвиква здравословни проблеми в организмите, тяхното потомство и популация. Тези вещества имитират, блокират или променят ендогенните стероидни хормони и инхибират хормоно-регулираните физиологични процеси.

Групата на веществата с естрогенна активностобхваща различни класове химични съединения

включващи:

- натурални и синтетични хормони;- фитоестрогени;- пестициди;- повърхностно-активни съединения;- хлорфеноли;- полициклични ароматни съединения;- алкилфенолни полиетоксилати;- фармацевтични и козметични средства и

други.

Пътят по който достигат ендокринните Пътят по който достигат ендокринните деструктори до човешкия организам е следния:деструктори до човешкия организам е следния:

Човек

Хищници

Зоопланктон

Фитопланктон

Ендокринни деструктори от натурални източници или произведени от човешката

дейност, влизащи в трофичната и хранителна верига

Естрогенните вещества имат два видадействие:

1. Оказват антагонистичен ефект наендогенните хормони, тъй катонаподобяват по структура естрогените иандрогените.

2. Нарушават синтеза и метаболизма наендогенните хормони и хормоналнитерецептори.

Веществата с естрогенни свойства действат по Веществата с естрогенни свойства действат по различни механизми различни механизми

Един от важните фактори, който трябва да бъде определен е токсичността на веществото с

естрогенна активност. -Първият тип токсичност е тази, при която естрогенът от околната среда се свързва с естрогенния рецептор и води до естрогенен отговор.

-Втория тип токсичност е тази, при която самия естроген може да предизвика токсичност по-силна от първоначалната, която се очаква да показва.

-Третия тип токсичност може да доведе до небалансиран естрогенен отговор в атакуваната тъкан

Биологичните ефекти на веществата с естрогенна активност:

1.Канцерогенен ефект. Резултатите, получени от райони със силно замърсени води съдържащи полициклични ароматни въглеводороди, полихлорирани бифенили и ДДТ показват висок процент на чернодробни тумори (Meyers et al., 1994), дължащи се на токсичното им действие.

2.Репродуктивен ефект. Установени са необичайни промени в сексуалното развитие при влечуги и птици (Fry, 1995) както и феминизиране на мъжки риби подложени на въздействието на вещества с естрогенна активност (Jobling et al., 1995).

Биологичните ефекти на веществата с естрогенна активност:

3.Неврологични ефекти- полихлоринираните бифенили, диоксините, хлоросъдържащите пестициди и техните метаболити, някои метали, дитиокарбаматите, синтетичните стероиди, тамоксифена, фитоестрогените и триазиновите хербициди (Kavlock et al., 1996).

4.Имунологичен ефект- Има данни, че действието на полихлоринирани бифенили, карбамати, органохлориди, органометали, както и тежки метали върху човешкия и животинския организъм предизвикват имунна супресия или хиперфункция (Kavlock et al., 1996).

Пречистването на околната среда и Пречистването на околната среда и най - вече водите и почвата от най - вече водите и почвата от попадналите в нея естрогенно-попадналите в нея естрогенно-

действащи замърсители е въпрос от действащи замърсители е въпрос от особена важност!особена важност!

Съществена роля за решаването на този социален, научен, медицински и

технологичен проблем има използването на биологични агенти или тяхни съставки,

каквито са например микроорганизмите и ензимите за ефективна биотрансформация на

ксеноестрогените до безвредни за биосферата крайни метаболити.

Използването на имобилизирани ензими за пречистване има редица

предимства, които включват:

ефективно елиминиране на ниски концентрации на веществата с естрогенна активност;

стабилност и многократното използване на ензима и др.

Един от най-често използваните имобилизирани ензими за постигане

на посочените цели е лакказата продуцирана от Trametes versicolor

(ЕС 1.10.3.2, бензендиол: кислород оксидоредуктаза).

Активната част на лакказата се състои от четири медни атома от три типа: Тип I, Тип II и/или Тип III. Тип ІІІ съдържа 2 медни атома. Четирите медни атома се различават един от друг по сигнала на електрон-парамагнитния им резонанс (Gianfreda et al., 1999). Субстратите (феноли и ароматни или алифатни амини) се окисляват от медния йон (тип І) до получаване на радикали, които след това водят до образуването на димери, олигомери и полимери. Отделените електрони се прехвърлят, вероятно чрез трипептида His-Cys-His, до тип ІІ и ІІІ частта, където молекулният кислород се редуцира до вода (Messerschmidt, 1997).

Лакказно-катализиран редокси цикъл за субстрати окислени в присъствие ( а) или

отсъствие (б) на химичен медиатор.

Основни характеристики на изходната полипропиленовата мембрана

Дебелина на мембраната

150 μm

Ефективна пористост

90 %

Среден размер на порите

0.2 µm

Фиг. 1. Инфрачервени спектри на полипропиленовата мембрана- (а) преди провеждане на химическа

модификация; (b) след обработка с хромена киселина;

(c) след обработка с етилендиамин.

Относителна активност в % и количество свързан белтък в mg.cm-2 на имобилизирана лакказа от продуцентите Rhus vernicifera и Trametes versicolor при определените оптимални условия за имобилизация.

Продуцент на ензима лакказа

Оптимални условия за имобилизация

Количество

свързан белтък, mg.cm-2

Относителна

активност, %

Температура, оС

Време, часове

Концентрация на ензима, mg.mL-1

Rhus vernicifera

4 16 4 0.036 92

Trametes versicolor

4 14 0.1 0.036 95

Сравнение на основните характеристики на ензима лакказа от продуцентите Rhus vernicifera и Trametes versicolor имобилизиран върху

химически модифицирана полипропиленова мембрана.

Характеристики на имобилизираната лакказа Имобилизационен ефект наензима лакказа

Продуцент на ензима

Rhus vernicifera Trametesversicolor

Относителна активност, (%) 92 95

Количество свързан белтък, (mg.cm-2) 0.036 0.036

рНопт 7.5 5.5

рНстаб 7.5 5.5

Топт, (оС) 50 53

Тстаб след 390 min, (Активност, % от max) 15 25

Стабилност във времето след 30-тия ден, (Активност, % от max)

Съхранение при 4оС 49 70

Съхранение при 25оС 22 48

Степен на отстраняване на фенол на 30 min при изотермалниусловия, (%)

36 40

Km, (mM) 0.36 0.17

Vmax, (µmoles.min-1) 0.25 0.33

Операционна стабилност след 12-тия цикъл, (Активност, % от max) 21 45

Биореактор за провеждане на биотрансформация на фенол и фенолни производни с естрогенна активност

Принципна схема на неизотермален биореактор.

n-уплътнение; ПП1, ПП2- перисталтични помпи; С- събирателен съд; T1,T2- термостати.

а) б)

Разпределение на субстратния поток при изотермални (а) инеизотермални условия (б)

- При изотермални условия (а) единствено субстратът се движи чрез дифузия.- При неизотермални условия (б) температурният градиент формира двадопълнителни субстратни потока. Първият поток се нарича „термодифузионенсубстратен поток”, а вторият се нарича „преминал субстратен поток”. Тяхнатасума дава количеството преминал обем от субстрата от топлата към студенатачаст на работния обем на биореактора.

Биотрансформация на фенол в биореактор при изотермални условия чрез имобилизирана лакказа от

продуцентите Rhus vernicifera и Trametes versicolor

Таблица 4. Биотрансформация на фенол (BTs(t)) при изотермални условия,посредством имобилизирана лакказа от продуцентите Rhus vernicifera иTrametes versicolor (T= 25oC, ΔТ= 0оС, 50 µМ субстратен разтвор и реакционновреме 30 min).

Продуцент наИмобилизирана

лакказа

Време (min) BTs (t) (%) Среднареакционна

скорост(µmoles.min-1)

Rhus vernicifera 10 14 16

20 26

30 36

Trametesversicolor

10 18 21

20 30

30 40

Химически структури на фенол и фенолни производни.

Фенол 2-хлорофенол 3-хлорофенол 4-хлорофенол

2,4-дихлорофенол 3,5-диметил-4-хлорофенол 3-метоксифенол 4-ацетамидофенол

2-бензил-4-хлорофенол Бисфенол А (2,2-бис(4-хидроксифенол)пропан)

2-нонилфенол

OH

Cl

OH

Cl

OH

Cl

OH

Cl

Cl

OH

H3C CH3

Cl

OH

O

CH3

OH

CH3

O NH

HO

Cl

OH

HO OH

C

H3C CH3

OH

Степента на биоремедиация на изследванитеСтепента на биоремедиация на изследваните

фенол и заместени фенолни производни чрезфенол и заместени фенолни производни чрез

имобилизирана лакказа от продуцента имобилизирана лакказа от продуцента TrametesTrametes

versicolorversicolor при изотермални условия нараства в при изотермални условия нараства в

следния ред:следния ред:

парацетамол < хлороксиленол < 3-метоксифенол

< хлорофен < 2-нонилфенол ≈ фенол ≈

4-хлорофенол < 3-хлорофенол < 2-хлорофенол

< бисфенол А < 2,4-дихлорофенол.

Температура на биореактора отчетена от Температура на биореактора отчетена от термодвойкитетермодвойките при неизотермални условия и при неизотермални условия и

ТТavav= 25= 25ооС.С.

ΔТ, оС Тw, oC Tc,

oC Tav=(Tw+Tc)/2, oC

0 25 25 25

10 30 20 25

20 35 15 25

30 40 10 25

Таблица 8. Биотрансформация на фенол и фенолни производни при неизотермални условия при ΔТ=10, 20, 30оС, 50 µМ субстратен разтвор и реакционно време 30 min.

Субстрат Време(min)

∆T=10 °C ∆T=20 °C ∆T=30 °C

[S0-St]

(µM)

BTS (t)

(%)

[S0-St]

(µM)

BTS (t)

(%)

[S0-St]

(µM)

BTS (t)

(%)

Фенол 1030

1539

3078

2045

4090

2550

50100

2-хлорофенол 1030

1845

3690

2350

46100

2750

54100

3-хлорофенол 1030

1845

3690

1350

26100

1750

34100

4-хлорофенол 1030

1235

2470

1642

3284

1950

38100

2,4-дихлорофенол2,4-дихлорофенол 10103030

20205050

4040100100

24245050

4848100100

30305050

6060100100

3-метоксифенол 1030

1030

2060

1234

2468

1539

3078

Бисфенол А 1030

1646

3292

2250

44100

2550

50100

2-нонилфенол 1030

1235

2470

1533

3066

1850

36100

3,5-диметил-4-хлорофенол(хлороксиленол)

1030

721

1442

1027

2054

1131

2262

2-бензил-4-хлорофенол(хлорофен)

1030

932

1864

1238

2476

1545

3090

4-ацетамидофенол4-ацетамидофенол(парацетамол)(парацетамол)

10103030

661414

12122828

771717

14143434

882222

16164444

Стойности на времето за пълно субстратно окисление при ΔТ=0, 10, 20 и 30оС.

Субстрат τ0, ∆T=0°C

(min)

τ0, ∆T=10°C

(min)

τ0, ∆T=20°C

(min)

τ0, ∆T=30°C

(min)

Фенол 70.7 38.9 31.1 22,9

2-хлорофенол 62.5 32,9 25,7 19.7

3-хлорофенол 65.8 32.9 25.8 19.7

4-хлорофенол 71.4 41.9 34.0 26.3

2.4-дихлорофенол2.4-дихлорофенол 44.344.3 28.728.7 20.520.5 16,716,7

3-метоксифенол 80.5 50.0 43.7 37.6

Бисфенол А 56.9 32.4 23.6 20.0

2-нонилфенол 71.4 42.4 34.9 27.7

3,5-диметил-4-хлорофенол (хлороксиленол)

129.5 71.4 55.1 47.9

2-безил-4-хлорофенол (хлорофен)

73,7 47,6 39,8 33,3

4-ацетамидофенол 4-ацетамидофенол (парацетамол)(парацетамол)

250.0250.0 102.8102.8 83.383.3 71.471.4

Предвиждане и оценка на риска (устойчивост, биоакумулиране и хронична токсичност) на

бисфенол A (структура майка) и неговите микробни метаболити

(наблюдаван и прогнозиран) с помощта на моделите на QSAR в PBT Profiler и в допълнение

предскзване на естрогенна активност на основната структура и метаболитите на бисфенол А чрез

OECD (Q) SAR Application Toolbox.

Бисфенол А ( ВРА ) е промишлен химикал, който се използва при производството на поликарбонати и множество пластмасови

изделия, тъй като подобрява пластичността на суровините.

Последните изследвания показват, че той присъства в Последните изследвания показват, че той присъства в множество продукти , включително пластмасова множество продукти , включително пластмасова облицовка на кутии използвани за съхранение на облицовка на кутии използвани за съхранение на храни, бебешки бутилки, силиконови беберони и съдове храни, бебешки бутилки, силиконови беберони и съдове за хранене, влиза в състава на т.нар. бели пломби и за хранене, влиза в състава на т.нар. бели пломби и уплътнители използвани в стоматологията.уплътнители използвани в стоматологията.

Установено е, че дори и в много ниски концентрации (например ррв) Бисфенол А предизвика биологични

ефекти- може да имитира на женския полов хормон естроген.

Методи за предвиждане и оценка на риска (устойчивост, биоакумулиране и хронична

токсичност) на бисфенол A

1. PBT Profiler. PBT Profiler е инструмент за скрининг-ниво, който осигурява оценки за устойчивост, биоакумулиране и нивото на хронична токсичност при риби. Той е проектиран да се използва, когато няма налични данни.PBT Profiler автоматично идентифицира химичнитесъединения, които могат да бъдат устойчиви в околната среда и биоакумулират в хранителната верига. Химичните съединения се идентифицират посредством последователност от стъпки и процедури публикувани от Агенцията за опазване на околната среда (EPA).

Методи за предвиждане и оценка на риска (устойчивост, биоакумулиране и хронична

токсичност) на бисфенол A

2.Критерии за устойчивост (2.Критерии за устойчивост (PersistencePersistence criteriacriteria)).

PBT Profiler се комбинира с критериите персистиране във вода, почвата и седименти, като се изчислява полуживотът на химичното съединение. Ако резултата за персистиране е ≤ 2 месеца- химичното съединение се определя като лесно разградимо, респективно <6 месеца като устойчиво, а когато изчисленият полуживот е ≥ 6 месеца като много упорито.

Методи за предвиждане и оценка на риска (устойчивост, биоакумулиране и хронична

токсичност) на бисфенол A 3.Критерии за биоакумулиране (Bioaccumulation criteria). PBTProfiler се комбинира с биоакумулационните критериите и когато BCF ≥ 1 000 химичното вещество се характеризира като слабо биоакумулиращо, респективно когато BCF <5000- средно биоакумулииращо и както BCF ≥ 5000 като много биоакумулиращо.

4.Критерии за токсичност (Toxicity criteria).Тъй като повечето химични вещества могат да доведат до хронична токсичност при риби при комбинация с PBT Profiler са установени следните критерии :Fish ChV (хронична стойност)> 10 мг/л (ниска токсичност); Fish ChV = 0,1-10 мг/л (средна токсичност);Fish ChV <0.1 мг/л (висока токсичност).

Методи за предвиждане и оценка на риска (устойчивост, биоакумулиране и хронична

токсичност) на бисфенол A 5.OECD (Q) SAR application toolbox. OECD (Q)SA R Application Toolbox е софтуерна програма, използвана в регулаторната токсикология за попълване на пропуските в (еко) данни за токсичността. Тя включва различни модели SAR и R QSA за оценяване на (еко) токсикологичните крайни точки.

- [(Q) SARs] (Quantitative) Structure–Activity Relationships са методи за оценяване свойства на дадено химично вещество на база молекуляна структура и имат потенциала да осигурят информация за риска, като същевременно намаляват времето, паричните разходи и експериментите с опитни животни.

Методи за предвиждане и оценка на риска (устойчивост, биоакумулиране и хронична

токсичност) на бисфенол A

6.Observed microbial metabolism (Наблюдавано микробен метаболизъм). Пътищата на разграждане на 200 химични вещества до получаване на въглерод и енергия, посредством микроорганизми се съхраняват в специален файлов формат, който позволява чрез компютърна симулация да бъде получена информация за катаболитния микробен метаболизъм при новосинтезирани или още не проучени химични съединения.

7. Microbial metabolism simulator. Представлява CATABOL симулатор на микробния метаболизъм.

Бисфенол А е средно персистиращ но не е биоакумолативен. Токсичността на бисфенол

А е с умерена стойност Fish ChV ~ (0,1-10 мг/л).

Данни за метаболитите на Данни за метаболитите на Бисфенол А установениБисфенол А установеничрез чрез Observed microbial Observed microbial

metabolism metabolism и оценка на тяхната токсичност и оценка на тяхната токсичност

чрез чрез PBTPBT ProfilerProfiler

Данни за Данни за метаболитите на метаболитите на

Бисфенол А Бисфенол А установениустановени

чрез чрез Observed Observed microbial microbial

metabolism metabolism и оценка на тяхната и оценка на тяхната

токсичност токсичност чрез чрез PBTPBT ProfilerProfiler

Данни за метаболитите на Данни за метаболитите на Бисфенол А установени чрезБисфенол А установени чрез

[(Q) SARs] (Quantitative) [(Q) SARs] (Quantitative) Structure–Activity Relationships Structure–Activity Relationships и оценка на тяхната токсичност и оценка на тяхната токсичност

чрез чрез PBTPBT ProfilerProfiler

Данни за метаболитите на Бисфенол А установени чрез

[(Q) SARs] (Quantitative) Structure–Activity

Relationships и оценка на тяхната токсичност

чрез PBT Profiler

Данни за метаболитите на Бисфенол А установени чрез

[(Q) SARs] (Quantitative) Structure–Activity

Relationships и оценка на тяхната токсичност

чрез PBT Profiler

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:През последните 50 години са натрупани много данни върху вредния ефект на веществата с естрогенна активност. Ниската им концентрация в околната среда затруднява тяхното отстраняване чрез физични и химични методи за пречистване на води.

Използването на имобилизирани ензими за тяхната биотрансформация има редица предимства, като ефективно отстраняване на ниски концентрации на токсични вещества, многократното използване на ензима, лесната регенерация на носителя чрез последващо имобилизиране на пресен ензим и др.

Има недосатъчно експериментални данни за токсичността, биоакумулацията и метаболитите на веществата с естрогенна активност, което затруднява осъществяването на адекватната им рискова оценка.

Благодаря Ви за вниманието!

http://www.sterlitech.com/http://www.sterlitech.com/polypropylene-bibliographypolypropylene-bibliography