Референтная лаборатория по АЧСРеферентная лаборатория по АЧС

Тема:Тема: «И«Исследование факторов патогенности возбудителя АЧС, циркулирующего на территории

Российской Федерации, усовершенствование методов диагностики АЧС» в 2013 году

Научный руководительД.б.н. проф. Груздев К.Н.www.arriah.ruтeл./факс: 8(4922)-26-18-67; 45-37-96.

История лаборатории

Референтная лаборатория по африканской чуме свиней была создана 1 августа 2012 г.

В настоящее время лаборатория является структурным подразделением ФГБУ «ВНИИЗЖ», входит в состав лаборатории диагностики болезней сельскохозяйственных животных.

2

Штатный состав лаборатории• Заведующий лабораторией, к.б.н. А.С. Иголкин • Главный научный сотрудник, д.б.н. Н.Н. Власова • Ведущий научный сотрудник, к.в.н. А.А. Шевцов • Старший научный сотрудник, к.в.н. О.С. Пузанкова • Научный сотрудник, к.б.н. В.Л. Гаврилова • Младшие Научные сотрудники, С.Г. Ремыга и А.С. Першин • Ведущий ветеринарный врач, А.А. Варенцова • Ведущие биологи, И.В. Шевченко и И.Ю. Жуков • Техники-лаборанты, В.М. Зайнутдинова, Н.И. Камаева,

Т.В.Клочкова• Всего: 13 человек

3

Задачи лаборатории• Научно-исследовательская работа; • Анализ рисков и оценка развития ситуации по АЧС

на территории РФ и стран ТС ;• Научное обоснование планов мониторинга АЧС

утверждаемых Россельхознадзором;• Выполнение государственных заданий по

мониторингу и диагностике АЧС;• Подготовка нормативной и методической

документации по АЧС в соответствии с международными стандартами;

• Проведение сличительных лабораторных испытаний;

• Участие в международных научных проектах;• Образовательная деятельность.

4

Научно-исследовательская работа

• После утверждения Россельхознадзором 30.04.2013 г. темы НИР «Исследование факторов патогенности возбудителя африканской чумы свиней (АЧС), циркулирующего на территории Российской Федерации, усовершенствование методов диагностики АЧС» осуществляемая в рамках основного мероприятия «Предупреждение распространения и ликвидации африканской чумы свиней на территории РФ» Государственной программы «Развитие сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013-2020 годы» работа велась в соответствии с календарным планом по 6 этапам.

5

В настоящее время сотрудники лаборатории ведут работу по теме: «Исследование факторов патогенности возбудителя африканской чумы свиней (АЧС), циркулирующего на территории Российской Федерации, усовершенствование методов диагностики АЧС»в рамках Государственной программы «Развитие сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013-2020 годы».

6

Задачи лаборатории

Этап 1 Анализ существующих международных методов и подходов по проведению исследований для определения изменчивости вируса АЧС, установления критериев изменчивости вируса АЧС

Этап 2 Выделение не менее 5 изолятов вируса АЧСЭтап 3 Изучение культурально - биологических свойств

выделенных изолятов вируса АЧС, в т.ч. вирулентности, контагиозности для домашних свиней

Этап 4 Изучение молекулярно-биологических свойств выделенных изолятов вируса АЧС

Этап 5 Оптимизация условий хранения изолятов с подбором стабилизирующих сред и режима лиофилизации

Этап 6 Разработка и совершенствование методов диагностики АЧС 7

Результаты вирусовыделения ВАЧС на КК АМС№ Изолят ВАЧС Происхождение Титр вируса (lg

ГАдЕ/г )

1 ASFV RU 123080 S/12/1 Дом свинья 1,5

2 ASFV RU 123080 S/12/2 Дом свинья < 1,03 ASFV RU 190651 B/13 Павший кабан 2,0

4 ASFV RU 69601-B/13/1 Кабан отстрелянный 5,0

5 ASFV RU 36775-S/13/1 Домашняя свинья 5,0

6 ASFV RU 36775-S/13/2 Домашняя свинья 4,5

7 ASFV RU 33830-B/13/1 Павший кабан 6,08 ASFV RU 33830-B/13/2 Павший кабан 5,0

9 ASFV RU 67119-S/13/1 Дом свинья 5,0

10 ASFV RU 67119-S/13/2 Дом свинья 5,011 ASFV RU 69315-B/13/1 Отстрелянный кабан 1 год 4,5

12 ASFV RU 69315-B/13/2 Отстрелянный кабан 3 года 4,0

8

Изучение репродукции вируса АЧС (Российские изоляты) в перевиваемых культурах клеток

Изолят ВАЧС

A4C2 СПЭВ ППКНаличие

ЦПДГемадсо

рбцияНаличие

ЦПДГемадсорб

цияНаличие

ЦПДГемадсор

бция

ASFV RU 190651 B/13

2п + 3п + 3п -ASFV RU 69315-B/13/

1п + 1п + 3п -ASFV RU 67119-S/13

2п + 3п + 3п -ASFV RU 67119-S/13

2п + 1п + 1п -ASFV RU 69315-B/13

1п + 3п + 3п -ASFV RU 69315-B/13

1п + 3п + 3п -

9

Динамика изменений температуры тела поросят зараженных и/назально разными изолятами ВАЧС в дозе

5000 ГАдЕ

10

Динамика изменений температуры тела поросят зараженных и/назально разными изолятами ВАЧС в дозе

50 ГАдЕ

11

Динамика изменений температуры тела интактных поросят при их контактном содержании с животными, зараженными

разными изолятами ВАЧС

12

Течение заболевания на свиньях

13

Схема расположения подобранных для создания клонотеки генов на полноразмерном геноме вируса АЧС

14

• Сконструирована клонотека генов иммунозначимых белков вируса АЧС и проведен анализ нуклеотидных последовательнстей 8 генов изолята Краснодар 06/12.

• Проведение пиросеквенирования ДНК вируса АЧС изолята ASFV RU 69601-B/13 и сравнительный анализ изменений показали, что в сравнении с последовательностью изолята Грузия 2007/1 в геноме изолята ASFV RU 69601-B/13 обнаружены 52 единичные встройки, 12 делеций и 8 замен, что от 189398 нуклеотидов составляет ~0,0327% изменений.

15

16 стрелками указаны места мутаций в генах ДНК изолята ASFV RU 69601-B/13.Dixon, L.K., Abrams C.C., Bowick G., Goatley L.C., Kay-Jackson P.C., Chapman D., Liverani E., Nix R., Silk R., Zhang F. (2004) African swine fever virus proteins involved in evading host defence systems. / Vet. Immunol Immunopathol. 100:117-134.

Дальнейшие исследования

Для дальнейшего изучения основ патогенности и изменчивости вируса АЧС планируется:• Выделение, сравнительное изучение биологических свойств изолятов

вирусов АЧС, а также создания новых средств диагностики и специфической профилактики

• Формирование и пополнение коллекции штаммов вирусов АЧС• Определение изменений генома у изолятов вируса АЧС, различающихся по

биологическим свойствам• Совершенствование методов раннего выявления антител к вирусу АЧС в

сыворотке крови зараженных животных• Разработка методов индикации вируса АЧС в кормах и почве• Изучение возможности передачи вируса АЧС видами клещей

представленными на территории Российской Федерации

17

Международное сотрудничество по АЧС

• Развитие сотрудничества с референтными лабораториями МЭБ и ФАО по АЧС, стажировки научных сотрудников;

• Совместные работы по изучению биологических свойств вируса АЧС, циркулирующего на территории РФ;

• Участие в программах по вопросам профилактики распространения трансграничных болезней свиней в приграничных районах России с сопредельными странами;

• Участие в международных симпозиумах и конференциях

18

Для продуктивной работы референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «ВНИИЗЖ»

необходима научно-консультативная помощь:• Секвенирование генома (от пробоподготовки до

выполнения анализа и компьютерной обработки данных)• Рекомбинантные белки и антитела• Электронная микроскопия• Серодиагностика – иммуноферментный анализ,

иммуноблот, дот-блот, иммунофлуоресценция, гемадсорбция и др.

• Цитофлюориметрия• Энтомология клещей переносчиков вируса АЧС

21

Заключение

• Изучение культурально-биологических свойств изолятов вируса АЧС, выделенных на территории Российской Федерации в 2013 году, позволило установить изменение патогенности в сторону снижения вирулентности и увеличения длительности заболевания.

• Проведенное пиросеквенирование генома изолята ASFV RU 69601-B/13 выявило наличие мутаций в 3 генах, ответственных за вирулентность вируса африканской чумы свиней.

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !

22