第六讲 固定化酶技术

酶催化具有效率高、专一性强、速度快等优点。 但是，酶是蛋白质，分离纯化过程复杂、稳定性差，不能反复使用，价格较昂贵。

目前，酶主要在医药、食品及高附加值化工产品上广泛应用，其它领域则相对较少。

为扩大酶的应用范围并降低成本，有效的途径是实现酶的多次使用或直接使用细胞；固定化酶技术就是在这种思路下发展起来的。

自上世纪 60年代初就有人研究过固定化酶，最初是以色列人以木炭、骨髓等吸附酶，

然后是日本的千佃一郎领导的制药公司，首先将氨基酰化酶固定于葡聚糖凝胶中，用于拆分 DL-

氨基酸； 接着召开了两次固定化酶的国际酶工程年会。

R CH COOH

NH CO R¡®

DL-õ£»¯°±»ùËá

H2OR CH COOH

NH CO R¡®

R CH COOH

NH2

++

°±»ùËáõ£»¯Ã¸

L-°±»ùËá N-õ£»¯-D-°±»ùËá

Íâ Ïû Ðý×÷ÓÃ

¹Ì ¶¨»¯°±»ùËáõ£»¯Ã¸²ð ·Ö°±»ùËá

至今已经有许多种固定化酶获得大规模的工业应用，例如固定化青霉素酰化酶生产 -6-氨基青霉烷酸（ 6-APA）。

R C NH

N

CH

CH COOH

C(CH3)2

O S

CO

12

34

56

7

CH

H2N

N

CH

CH COOH

C(CH3)2

S

CO

12

34

56

7

CH

¹Ì ¶¨»¯ÇàùËØõ£»¯Ã¸R C

O

OH

H

6-°±»ùÇàùÍéËá

ÇàùËØÀà

H2O

葡萄糖异构酶生产高果糖浆

H

OH

H

H OH

HO H

O

H

HOHO

O

H

HO

H

HO

H

H

OHHOH

OH

¹Ì ¶¨»¯ÆÏÌÑÌÇÒì¹¹ ø

上世纪 70年代出现固定化细胞技术。利用固定化大肠杆菌生产 L-天冬氨酸

COOH

C O

CH2

COOH

COOH

CH

CH2

COOH

NH3+H2N

¹Ì ¶¨ »¯Ìì ¶¬°±Ëá°±»¯Ã¸

一、制备固定化酶的基本策略 ⒈固定酶时，必须尽量保证其活性部位的氨基酸残基不发生变化；

⒉避免导致酶蛋白高级结构破坏的操作（如高温、强酸，强碱等）；

⒊尽量在温和条件下、使酶被其底物或抑制剂饱和或抑制下进行。

二、固定化酶的优缺点 ⒈优点

容易与底物或产物分离，降低分离成本；可以在较长时间内、反复分批或连续反应；稳定性较好；反应受严格控制；可组合进行多酶反应。

⒉缺点

固定化时活力损失较大；传质阻力增加，反应速率下降；只能用于溶解性底物和小分子。

三、酶的固定化方法 固定化酶的方法可分为下列三大类 载体结合法 交联法 包埋法

1. 载体结合法 该法将酶与水不溶性载体结合形成固定化酶 根据结合的形式不同，可分为： ⑴物理吸附法 ⑵离子结合法 ⑶共价结合法

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΢½ºÄÒ°üÂñ·¨

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⑴物理吸附法使酶与载体通过物理吸附形成结合。

可供选择的载体很多；无机载体有活性炭、多孔玻璃、酸性白土、氧化铝、硅胶、羟基磷灰石、金属氧化物等；

天然高分子载体有淀粉、多糖、谷蛋白等；

人工合成载体有大孔径吸附树脂、人工陶瓷、疏水载体等。

•吸附法利用载体表面分子内聚力不均匀的特点吸附酶，该法不破坏酶的活性中心和高级结构。因此，固定的酶活力回收高；

•载体与酶的结合力是物理吸附，结合力弱，酶易脱落，半衰期短。

•⑵离子结合法•通过形成离子键固定化酶

•载体有多糖类离子交换剂（ DEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖、 CM纤维素）；合成高分子离子交换树脂，例如Amberlite IRA-系列。

N+O + -OOC E N+O-OOC

(C2H3)2C2H3 (C2H3)2C2H3

特点；操作简单，处理条件温和，高级结构不被破坏，能得到酶活力收率较高的固定化酶；缺点和吸附法相似，受电解质浓度影响极大。

已有工业化成功实例

DEAE纤维素及 DEAE葡聚糖固定化氨基酸酰化酶用于拆分 DL外消旋氨基酸。

⑶共价结合法 利用酶与载体形成共价键固定酶 此法载体与酶结合牢固、半衰期长。 形成共价键的反应剧烈，常常引起酶蛋白高级结构发生变化，因此酶活力回收一般较低。

共价结合法使用的载体主要有： 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素及其衍生物、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸（或醇）共聚物、多孔玻璃等。

• 酶蛋白中，可用于共价固定酶的功能基有氨基

（ Lys-ε-NH2 和 N-末端 α-氨基）；羧基

（ Asp 、 Glu 、 C-末端 α-羧基）；酪氨酸的酚羟基；半胱氨酸的巯基；羟基（ Ser 、 Thr 、 Tyr ）； His咪唑基； Trp

的吲哚基等，其中以氨基和羧基最常用。

• 共价固定酶的主要化学反应有；酰化反应、芳化和烷基化反应、溴化氰反应、重氮化反应以及硅烷化反应等。

①酰化反应

酶蛋白上的氨基与含酰化基团，如酰化叠氮、酸酐等的聚合物发生反应。

上述反应的 pH通常在 7.5—8.5 之间，反应温度在 4℃左右。

C

O

HN NH2

NaNO2HCl C

O

N3

H2N øC

O

HN ø

õ£肼»¯ºÏ Îï õ£»¯µþµª »¯ºÏ Îï

(a)øÓëõ£»¯µþµª ¾ÛºÏ Îï µÄżÁª

C

C

O

O

O + H2N øC

C

O

O

OH

NH ø

(b)øÓ뺬Ëáôû¾ÛºÏ Îï µÄżÁª

º¬Ëáôû¾ÛºÏ Îï

②芳化和烷基化反应 氨基与含有卤代芳环或卤代杂环的载体作用实现偶联。 例如用氯化三嗪活化载体，即将其连接于载体上而活化； 多糖类可与氯化三嗪连接，例如琼脂，纤维素及葡聚糖等。 该反应的速度比酰化反应慢，且要求未质子化的亲核试剂，与反应的

pH关系很大。通常在 pH8.5 ～ 9.0下进行。

OH +

N

N

N

Cl

Cl

X

O

N

N

N

Cl

X

N

N

N

HN

X

E

O

H2N-E

③溴化氰反应

在碱性条件下（ pH10—11.5 ），溴化氰活化多糖的羟基成环化的亚氨基碳酸盐，然后与酶蛋白中的氨基形成共价键，使酶固定。

该类反应通常产生三种不同的结构，即在 N 位与酶连接的氨基甲酸酯；在 N 位与酶连接的亚氨基碳酸酯；在 N 位与酶连接的异脲。

ROH

OH

O

C

NH

ROC N

OH

ROCONH2

OHR

O

OC=NH

RO

OH

NH E CR

O

OH

NH ERO

OC=N E

°±»ù¼×ËáÑÜÉúÎï ÑÇ°±Ì¼Ëáõ¥ÑÜÉúÎï

ÑÇ°±Ì¼Ëáõ¥ÑÜÉúÎïÒìëåÐÍÑÜÉúÎï °±»ù¼×Ëáõ¥ÑÜÉúÎï

ä廯Çè·¨

CNBr

对于纤维素载体等多糖 直接在糖环上固定酶可能导致固定和传质阻力大； 在碱性条件下可接枝一个柔性手臂进行改善； 与 β-硫酸酯乙砜基苯胺 (SESA)反应，生成对氨基苯

磺酰乙基纤维素（ ABSE-纤维素），再重氮化偶联。 接枝氨基酸的交联壳聚糖微球与酶反应，接入亲水柔性

手臂。

OH HO S

O

CH2CH2O NH2

O

O S

O

O

+

O CH2CH2O NH2S

O

O

O CH2CH2O NS

O

O

N+ Cl-

O CH2CH2O NS

O

O

N E

HNO2

H2N E

OCH2OH

H

OH

H

H

NH2

H

OH

OCH2OH

H

OH

H

H

NH2

H

HO

n

CHO(CH2)3CHOO

CH2OHH

OH

H

H

NH

OH

OCH2OH

H

OH

H

H

NH2

H

HO

n

CH(CH2)3CH

N Chitosan residue

OCH2OH

H

OH

H

H

NH

OH

OCH2OH

H

OH

H

HH

HO

n

CH(CH2)3CH

NChitosan residue

Step 2

NH2(CH2)4CHCOOH

NH2

DCC / Ethanol

NH

C O

CH NH2

(CH2)4

NH2LMCCR

CSCCR

CCR

OCH2OH

H

OH

H

H

NH

OH

OCH2OH

H

OH

H

H

NH2

H

HO

n

CH(CH2)3CH

N Chitosan residue

N C

O

CH

CH2

CH2

CH2

CH2

NH2

NH2H

N C

O

CH

CH2

CH2

CH2

CH2

NH

NHH co Cat

CO GOD 葡萄糖

CHO

葡萄糖酸

H2O2 O2

+H2O+

COO- 分离

④重氮化反应 带有芳香氨基侧链的聚合物用 HNO2处理 , 得到重

氮化的芳香族活性载体。 在 pH8 ～ 9 时，该载体与酶蛋白上 Tyr的酚羟基、His上的咪唑基发生偶联反应，使酶固定。

偶联的结果增加了固定化酶的疏水性，不利于在水环境发挥催化作用，但似乎有利于在疏水环境下催化。若要在水环境中催化，可用多糖作偶联剂抵消疏水作用。

NH2 N N+HNO2

HCl pH9

HO E

H

ENN

H

除 Tyr 、 His以外，蛋白质 N 末端上 α-

氨基和赖氨酸上 ε-氨基也能与活化载体偶联，形成双偶氮化合物；此外， Arg胍基，Trp吲哚基也能发生重氮化偶联。

NH2 N N+ N N E

HNO2

HCl

H2N E

pH9

⑤硅烷化反应

无机含硅载体，例如多孔玻璃或多孔陶瓷，其来源丰富，价格低廉，机械强度高而又耐有机溶剂，是固定化酶的良好载体。

将无机载体与有机硅化合物（包括硅烷偶联剂）作用，实现硅烷基化

接下来使烷基活化，最后与酶的氨基反应。

Si

O

OH

Si OH

Si

O

O

Si O

H2N CH2 3£¨ £©Si£¨

£¨ ÈýÑõÒÒ»ù±û»ù°· £©

»î »¯

CH2£¨ £©3 NH2

CH2£¨ £©3 NH2

Cl CS Cl

Si

O

O

Si O

CH2£¨ £©3 NCS

CH2£¨ £©3 NCS

Si

O

O

Si O

CH2£¨ £©3 NHC

CH2£¨ £©3 NHC

H2N EHN E

HN E

S

S

¦Ã-°±»ù±û»ù乙Ñõ»ù¹è Íé

¹è Íé »¯¹Ì ¶¨»¯Ã¸

OC2H5 )3

(6)活性酯法

该方法对于具有游离羧基的载体适用

COOH

N

O

OH

O+ CO N

O

O

O

DCC H2N E

HN EC

O

COOHCH2SOCl2 COClCH2

H2N E

pH8-9CONHCH2 E

COOHCH2 COOMeCH2

H2N EE

MeOHHCl

NH2NH2

CON3CH2

COONHNH2CH2

NaNO2HCl CONHCH2

该方法对于巯基载体适用

NS S

N

SH +

S SN

S S E

H2N E

2. 交联法 利用双功能基团试剂制备固定化酶的方法。

常用的试剂有戊二醛、碳化二亚胺、重氮联苯胺和马来酸酐共聚物等。

⑴戊二醛

戊二醛使赖氨酸残基上 ε-氨基参与交联。

OHC CH2nH2C

H2C CHO

-nH2O

CH CH2C

H2C C

HC

CHO

H2C

H2C C

HC

CHO

H2C

H2C

¦Á,¦Â-²» ±¥ºÍ Æë¾ÛÎï

+ H2N ø

CH CH

H2C

H2C C

HC

CHO

H2C

H2C

HC C

H

CHO

H2C

H2C

NH ø HN ø

ø N CH CH2CH2 N øCH2 CH

+

NH2 + C (CH2)3 CN N EOHC (CH2)3 CHO + H2N E

⑵异氰酸

⑶重氮联苯胺

N N ø N

N

N

N

N N ø N N

N

N

N N ø N N N N ø N N

N

N

N

N

双重氮联苯胺 -HCl

N NN NClCl + H2N E

⑷碳化二亚胺

COOH +NH E

+ H2N ER RN=C=C=N

pH4.75-5.25

C

O

⑸二环氧化物

用两末端都含有环氧基团的化合物 , 如 1,4-丁二醇二缩水甘油醚，二环氧辛烷，与具有亲核性的基团，如羟基、伯氨基或巯基作用（与羟基作用在高 pH、氨基在弱碱性）

R OHO O

R'

OH OH

R'+

E OH

OR O R

R OHO O

R'

OH OH

R'+

OR O E

R OHO O

R'

OH O

R'+ OR

E NH2

NH E

二乙烯砜

二乙烯砜是一种高活性的化学试剂，一般在碱性水溶液中进行反应。反应温度为室温

R OH + E NH2

NH E

H2C HC S

O

O

CH

H2C HC S

O

O

CH CH2R O

+CH2

3. 包埋法将酶包裹于凝胶或聚合物半透膜或微胶囊中的方法叫包埋法。该法条件温和，酶不参与反应，活力回收较高。但是，包埋法受限于底物和产物分子体积。

用于包埋的试剂多为多糖，如海藻酸盐， K-角叉菜、琼脂、乙基纤维素及聚丙烯酰胺凝胶等。

方法有微胶囊、相分离、乳化、脂质体等。

值得注意的是聚丙烯酰胺凝胶，其聚合反应如下

控制交联剂及单体用量可以控制其网格大小。 此外，还有光诱导聚合固定化酶等方面的技术。

H2C CH

CONH2

+ H2C CH

CO

NH

CH2

CO

CHH2C

+ ø¹ý ÁòËá¼Ø

¦Â-¶þ¼×°±»ù±ûëæ

CH CH2

CO

H2C CH CH2 CH CH2 CH CH2

NH

CONH2

CH2

NH

CO

CH

CONH2 CO

NH

CH2

NH

CO

CHH2C CH2 CH CH2 H2C CHHC

CONH2 CO CO

NH NH

固定化酶的性质

活力变化 在多数情况下，比活力低于天然酶，少数提高。例如羧甲基纤维素固定的胰蛋白酶活力仅为原酶的 30%（水解酪蛋白），这主要是固定化使酶活动空间、底物、产物扩散受限所致。

稳定性 大部分酶固定化后稳定性提高，少数下降 热稳定性，提高最适温度，一般是 10℃以上 对有机溶剂的稳定性及酶抑制剂的稳定性提高。 pH稳定性，明显优于游离酶。一般而言，用带负电荷载

体制备的固定化酶，其最适 pH值比游离酶高；用带正电荷载体制备的固定化酶，其最适 pH值比游离酶低；主要是吸附相反电荷离子的电荷平衡造成的。

固定化酶的反应动力学 酶固定化后，结构改变，位阻效应、分配效应及扩散效应

均发生改变，对催化活性有显著影响。 位阻效应（屏蔽效应）：指由于载体内微孔孔穴过小，或者固定化造成的酶与底物结合障碍。

分配效应：指固定化酶与固定化载体间亲疏水性及静电作用差异所造成的底物或产物浓度与溶液主体浓度的差异。

扩散效应 底物、产物在固定化酶、载体及主体溶液间扩散速率存在的差异

以上是影响固定化酶反应动力学的主要因素，其中酶结构的改变及位阻效应的影响可以通过校正动力学参数（如 Km 和 Vm）来体现。

分配效应则可以利用相平衡理论来描述，例如用液固界面内外侧的底物浓度比（分配系数） Kp来定量表示

Kp=[Sg]r=R/[SS]

[Sg]r=R为紧靠固液界面内侧底物的浓度， [SS] 是紧

靠外侧底物的浓度。

扩散效应可用传质理论来进行数学描述。引入有效因子来阐述传质对反应的影响。

有效因子 Η=（有扩散影响时的实际反应速率 / 无扩散影

响时的实际反应速率）

基质入口

产品出口

固定化酶或细胞

灭菌空气入口

空气出口

恒流搅拌反应器

基质入口

固定化酶或细胞

灭菌空气入口

空气出口

恒流搅拌-超滤反应器

产品出口

超滤单元

固定化酶或细胞再循环

基质入口

产品出口

固定化酶或细胞床

灭菌空气入口

空气出口

填充床反应器

再循环

基质入口

产品出口

灭菌空气入口

空气出口

流化床反应器

空气及基质入口

产品及空气出口

空心-纤维反应器

固定化酶或细胞的中空纤维管

反应类型 种类 应用

氧化还原

转化

水解

分解

异构化

L-氨基酸氧化酶酪氨酸酶

D-氨基酸L-多巴

磷酸化酶转化酶聚核苷酸磷酸化酶氨基酸甲酸激酶氨基酸蔗糖酶精氨酸脱氨酶氨基酸乙酰转移酶

葡聚糖转化糖浆聚核苷酸ATP含果糖的葡聚糖瓜氨酸氨基酸

氨基酸酰化酶�淀粉酶葡萄糖淀粉酶纤维素酶羧肽酶亮氨酸氨肽酶青霉素酰化酶木瓜蛋白酶AMP氨基酶蛋白水解酶

氨基酸光学拆分葡萄糖葡萄糖葡萄糖氨基酸光学拆分6-APA水解酪蛋白生产5‘ -肌苷酸水解蛋白质

天冬氨酸酶半乳糖苷酶单宁酶

L-天冬氨酸分解乳糖除单宁酸

葡萄糖异构酶延胡索酸酶

果葡糖浆L-苹果酸

固定化酶在传感器方面的应用 酶传感器是由固定化酶与能量转换器 ( 电极、场效应管、离子选择场效应等）密切结合而成

已经广泛应用于临床诊断、工业发酵控制、环境监测等。目前研究、应用最多的是酶电极

酶电极用于组分分析，特点是快速、方便、灵敏、精确 目前，酶电极已经用于各种糖、抗生素、氨基酸、甾体、有机酸、脂肪、醇类、胺类、尿素及无机酸等分析

固定化酶或细胞在食品工业中的应用 糖类转化 例如葡萄糖异构酶，转化糖生产，乳糖分解 氨基酸生产 例如 L-天冬氨酸、 L-谷氨酸、 L-瓜氨酸等 12种 醇（酒）类生产 例如乙醇、异丙醇、正丁醇等

固定化细胞在工业上的应用 有机酸的生产 例如乙酸、柠檬酸、乳酸、赤藓酸、泛酸、水杨酸、苹果酸、多种氨基酸等

有机物降解 酚、尿素、青霉素、链霉素等 合成药物 类固醇氢化可的松等 酶及代谢物 α-淀粉酶、谷胱甘肽、 NADP+、磷酸吡哆醇、葡萄糖 -6-磷酸 分析 BOD、测定、乙酸分析、烟酸分析

固定化酶（细胞）的应用趋势 碳水化合物氧化

例如丙烯酸氧化、生产 H2

固氮作用 污水处理 例如反硝化作用、生成甲烷 其它方面 蛋白质亲和层析、燃料电池、生物发光、制乙烯、光学拆分、亚铁氧化等