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聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction. 上海第二医科大学 检验系 樊绮诗. PCR 技术. 由美国 Cetus 公司 K.Mullis 于 1983 年建立 能在体外复制已知序列的 DNA 片段 具有扩增效率高和特异性强的特点 为生命科学领域的研究开创了崭新时代. 5’. 3’. 5’. 3’. 3’. 3’. 3’. 3’. 3’. 3’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 5’. 3’. 3’. 3’. 3’. 3’. - PowerPoint PPT Presentation
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聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction
上海第二医科大学 检验系
樊绮诗
PCR 技术 由美国 Cetus 公司 K.Mullis 于 1983 年建立 能在体外复制已知序列的 DNA 片段 具有扩增效率高和特异性强的特点 为生命科学领域的研究开创了崭新时代
PCR 原理
5’5’3’
3’
d.NTPs
耐热 DNA 聚合酶引物
5’3’
5’
3’
5’
3’
5’3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’5’
3’
添加反应混合液及样本
变性
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’3’
5’
3’5’
3’
退火
加入试管中
延伸
5’ 3’
5’3’5’ 3’
5’3’
继续延伸
5’ 3’
5’3’5’
5’
Taq
Taq
3’
5’3’
Taq
Taq5’
5’
循环
PCR 原理
5’3’5’ 3’
5’3’5’
3’
5’5’3’
3’
5’3’5’ 3’ 第二个循环
4 个拷贝
第三个循环8 个拷贝
5’3’5’
3’
5’3’5’ 3’
5’3’5’ 3’
5’3’5’ 3’
5’3’5’ 3’
5’3’3’5’
5’3’5’ 3’
5’3’5’ 3’
第 n 个循环2n 个拷贝
PCR 原理
PCR 的反应体系
参与 PCR 反应的主要成份 :
模板、引物、 dNTP 、 Taq DNA 聚合酶和缓冲液等。
PCR 的反应条件
反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（ PCR 效率及产物量）
变性温度和时间
模板 DNA 充分变性是 PCR 顺利进行的前 提。在 PCR 扩增开始的第一次变性时， 应给 予足够的时间和温度，使基因组 DNA 充分变 性。一般在 940C 变性 5 ～ 10 min 。进入循环反 应后以 94℃变性 30 ～ 40s, 足以使模板 DNA 双 链变性。
退火温度和时间 PCR 反应的特异性取决于退火时引物 模板的特异结合。退火温度一般低于引物 Tm50C 左右，退火温度越高，产物的特异 性也越高；被扩增片段越大，退火所需时 间也相应延长。
延伸温度与时间
延伸温度设为 72℃， 因为 Taq DNA 聚合酶在 72℃时具较高的酶促活性，有利于 DNA
的复制。延伸时间视产物长度而异，时间过长易导致非特异性扩增。
模 板 (template)
模板就是将要被复制的核酸片段（包括基 因 组 DNA 和 RNA 、 质 粒 DNA 和 线 粒 体
DNA
等） 模板 DNA 须有较高的纯度 模板加入量影响 PCR 效率和产物的特异性
引 物（ Primers)
化学合成的寡核苷酸 能与模板特异地结合 引物决定产物的特异性和长度 引物设计时必须遵循一些原则
引物设计基本原则 PCR 反应的引物需要二条，分别设在被 扩增目的片段的二端，并分别与模板正 负链序列互补 引物的长度一般以 18~25 个核苷酸为宜 二条引物之间（尤其在 3’ 端）的序列不 可有互补，以免形成引物二聚体 引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、 嘧啶碱基堆积
引物设计基本原则
引物的 3’ 端尤其要避免重复的 CG 碱基序列
二条引物的 Tm 值不能差别太大 ℃ Tm=2 （ A+T ） +4 （ C+G ）
合成引物时在其 5’ 端可以加修饰成份 设计引物最好用电脑软件进行分析
脱氧核苷三磷酸（ dNTP ）
是 dATP 、 dCTP 、 dGTP 和 dTTP4 种脱氧 核苷三磷酸的混合物 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异 性扩增也随之增加
DNA 聚合酶 从一种生活在热泉（ 80℃~90℃）中的水栖 噬热菌（ Thermus aquaticus, Taq ）中提取， 有很高的耐热稳定性 Taq 酶的作用 :
催化 DNA 合成。即在模板指导下，以 dNTP
为原料，在引物 3’-OH 末端加上脱氧单核苷 酸，形成 3’, 5’ - 磷酸二酯键，使 DNA 链沿 5’→3’方向延伸
镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高 Taq 酶的活性十
分重要
虽然 Taq 酶的活性只与游离的 Mg2+ 浓度有关， 但 PCR 反应体系中 dNTP 、引物、模板 DNA
及 鳌合剂的存在均可与 Mg2+ 结合而降低游离 Mg2+ 的浓度从而影响酶的活性。
配制 PCR 反应体系（例）
PCR 反应体系 (25l) 试剂浓度 体积 (l) 终浓度去离子水 15.8
正向引物 10 mol/L
1.0 0.4mol/L
反向引物 10 mol/L
1.0 0.4mol/L
10×PCR 反应缓冲液 10× 2.5 1×镁离子 25
mmol/L2.5 2.5mmol/L
dNTP 25 mmol/L
0.2 200mol/L
Taq DNA 聚合酶 1U/l 1.0 0.04U/l
模板 DNA 100ng/l 1.0 4.0ng/l
其它反应因素 pH 应保持在酶反应所需的最适 pH盐浓度（引物与模板杂交率、杂交体稳定性 及聚合酶的活性）二甲亚砜（ DMSO）能破坏模板的二级结构
牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护 Taq 酶 的活性
循环次数 重复次数一般设为 25 ～ 35 个循环 35 个循环以后由于反应体系中各种反应组分的消耗和反应副产物的产生，此时扩增产物量不再随
循环次数的增加而呈指数增长，即反应已处于平 台期
指数增长期 线形增长期 平台期
循环数 #
理论值
实际值Lo
g 产
物D
NA
PCR 过程的实时监测
相对定量 PCR
设计相对定量 PCR实验方案时须注意： 预先确定最佳模板量和 PCR 循环数，使所 采用的各反应参数在扩增指数范围内，避 免平台效应。 “管家基因”与靶基因同管扩增，扩增产
物 的长度应有所不同，以保证电泳能将两者 分离开。
理论值
实际值
Log
产物
DN
A
绝对定量 PCR
1.外参照系统的设置
2.内参照系统的设置
实时定量 PCR
对核酸扩增反应进行直接和动态的监测， 实现对靶基因的实时定量分析
TaqManTM
5’
5’
3’
3’
d.NTPs
Thermal Stable DNA Polymerase
Primers5’
3’5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’5’
3’
Add Master Mix and Sample
Denaturation
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’5’
3’
Annealing
Reaction Tube
Taq
5’ 3’
R Q
Probe
5’ 3’
R Q
5’ 3’
5’3’
TaqManTM
Extension Step
5’ 3’
1. Strand DisplacementTaq3’
Q
R
5’
5’ 3’3’
Q Taq
R
5’ 2. Cleavage
3. PolymerizationComplete5’ 3’
QTaqR
3’ 5’
4. Detection5’ 3’
3’
QTaqR
5’
R
5’3’RQ
PCR 产物的检测凝胶电泳分析： 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 酶切分析 分子杂交 Southern印迹杂交、斑点杂交 核酸序列分析
DNA突变的 PCR 检测技术
PCR-限制性片段长度多态性（ PCR-RFLP ） 等位基因特异性寡核苷酸 （ allele specific oligonucleotide, ASO ） 单链构象多态性（ single strand conformation
polymorphism, SSCP ） 变性梯度凝胶电泳（ DGGE ） 融点曲线分析（ melting curve analysis ） PCR 产物的序列分析
PCR-SSCP
单链 DNA 分子具有特定的二级空间构象，取决于该分子本身的碱基组成。突变 DNA 的 PCR 产物经变性后产生与正常 DNA空间构象不同的两条单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的 DNA
不同顺序 不同构象 不同电泳行为
SSCP 技术检测 DNA 突变
s
Southern 印迹杂交
DGGE 是一种筛选单碱基突变及多态性的方法。 DGGE 检测突变的原理是基于给定DNA 双链的解链温度因存在突变而发生改变加以测定。 DGGE 的突变检出率可达90% ～ 100% 。
变性梯度凝胶电泳 (DGGE)
DGGE 检测 DNA 突变
PCR 产物的序列分析 主要见于分子克隆时对于目的基因扩 增片段的序列鉴定以及对致病基因检测时 分析扩增片段中点突变的位置和性质。
可将产物纯化后作为模板直接测序， 也可将 PCR 产物克隆入载体后再测序，后 者测序的效果更好 ，常用 T-A克隆。
PCR 反应的特点 特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长，从 pg (10-12) 可扩增至 g (10-6) 水平 简便、快速 2 ～ 4 小时完成扩增对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总 RNA均可作为扩增模板
PCR技术的质量控制实验室的规范化设置： 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 PCR技术的质量保证： 基因扩增检验的全过程的质量保证 室内质量控制和室间质量评价 PCR实验系统中的污染源及防污染措施
以 PCR 为基础的相关技术逆转录 PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 定量 PCR (quantitative PCR )多重 PCR (multiplex PCR) 免疫 PCR 差异显示 PCR (differential display PCR, DD-PCR) PCR诱导定点突变 原位 PCR (in situ PCR)
图例 差异显示 RT-PCR(Differential display RT-PCR)
PCR技术在分子诊断中的应用
感染性疾病中病原微生物核酸的检测 单基因遗传性疾病的基因诊断多基因病相关基因的检测肿瘤相关基因的检测移植配型和法医学上的应用
遗传性疾病的基因诊断 （例：血红蛋白病中的地中海贫血）
1 2 3 4
1. 正常内对照2.Bart’s 水肿标本3. 反应体系故障扩增失败4. 分子量标准
PCR 用于 α- 地贫 Bart’s 水肿产前诊断
血友病的分子诊断 X染色体连锁隐性遗传 FⅧ 基因和 FⅨ 基因发生突变 血浆凝
血因子Ⅷ 和Ⅸ的合成量和（或）质的异常 患者反复自发性出血 SSCP 、 DGGE 等检测技术
DMD 的分子诊断 X染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病，发病率 为 1/3 500 个男孩 DMD 基因位于 Xp21.2-21.3 ，全长 2500Kb
DMD 基因的突变导致 dystrophin缺陷 检测 DMD 基因的技术： Southern印迹、多重 PCR
PCR 在移植配型上的应用 二十世纪 80 年代后期，分子生物学技术被引入HLA 领域，人们在 PCR 基础上发展了各种 DNA 分型技术检测 I类和 II类抗原位点的等位基因 PCR-RFLP 序列特异性寡核苷酸探针技术 （ PCR-sequence specific oligonucleotide probe, SSO
P ） 序列特异性引物扩增技术 （ PCR-sequence specific primer, SSP ）
PCR技术在法医学上的应用
个人认识亲子鉴定 性别鉴定
PCR技术在分子生物学中的其它应用
DNA克隆 引入点突变、缺失或插入 重组 PCR DNA 序列的测定 基因定量
