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实验十一 中药提取成分对于肿瘤细胞生长的影响分析. 指导教师：唐颖. 1. 实验目的. 此综合性实验是通过细胞传代、绘制细胞生长曲线等基础实验来初步检验中药中的某活性成分的抗肿瘤活性。. 2. 实验原理. MTT 比色法的主要原理是； MTT 被活细胞中线粒体琥珀酸脱氢酶还原后，生成暗蓝色甲躜，甲躜被助溶剂溶解后，可在酶标仪上读取光吸收值 (OD) ，在一定范围内光吸收值 (OD) 与活细胞数量呈线性关系。所以可以通过测量 OD 值，间接测量活细胞数量。 其他见细胞的传代培养、细胞的生长曲线的绘制等实验内容. 3. 实验材料、用品. - PowerPoint PPT Presentation
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大连理工大学 环境与生命学院
实验十一 中药提取成分对于肿瘤细实验十一 中药提取成分对于肿瘤细胞生长的影响分析胞生长的影响分析
指导教师：唐颖
大连理工大学 环境与生命学院
1.1. 实验目的实验目的
• 此综合性实验是通过细胞传代、绘制细胞此综合性实验是通过细胞传代、绘制细胞生长曲线等基础实验来初步检验中药中的生长曲线等基础实验来初步检验中药中的某活性成分的抗肿瘤活性。某活性成分的抗肿瘤活性。
大连理工大学 环境与生命学院
2.2. 实验原理实验原理
• MTTMTT 比色法的主要原理是；比色法的主要原理是； MTTMTT 被活细胞中线粒体琥珀酸被活细胞中线粒体琥珀酸脱氢酶还原后，生成暗蓝色甲躜，甲躜被助溶剂溶解后，脱氢酶还原后，生成暗蓝色甲躜，甲躜被助溶剂溶解后，可在酶标仪上读取光吸收值可在酶标仪上读取光吸收值 (OD)(OD) ，在一定范围内光吸收，在一定范围内光吸收值值 (OD)(OD) 与活细胞数量呈线性关系。所以可以通过测量与活细胞数量呈线性关系。所以可以通过测量 ODOD值，间接测量活细胞数量。值，间接测量活细胞数量。
• 其他见细胞的传代培养、细胞的生长曲线的绘制等实验内其他见细胞的传代培养、细胞的生长曲线的绘制等实验内容容
大连理工大学 环境与生命学院3.3. 实验材料、用品实验材料、用品• 实验材料：实验材料： HelaHela 细胞，细胞， HL-60HL-60 细胞等多种肿瘤细胞及原代培养细胞等多种肿瘤细胞及原代培养
的正常细胞。的正常细胞。
• 实验用品：实验用品：试剂：试剂：不同浓度梯度的重要某活性成分溶液。不同浓度梯度的重要某活性成分溶液。 MTTMTT （四甲基偶（四甲基偶氮唑盐，氮唑盐， 5 mg/ml5 mg/ml 溶于溶于 PBSPBS ），）， SDSSDS 脱色液：脱色液： 0.01 mol/L HCl0.01 mol/L HCl ，，10%SDS10%SDS 或或 DTWDTW 脱色液：脱色液： 11 份份 Triton X—100Triton X—100 溶于溶于 33 份份 DMFDMF （（ N, N, N-N- 二甲基甲酰胺）中，摇匀，然后加二甲基甲酰胺）中，摇匀，然后加 22 份去离子水，加柠檬酸份去离子水，加柠檬酸至终浓度至终浓度 0.2mol/L0.2mol/L ，调，调 pHpH 至至 55 ～～ 66 。。
其他：其他：见细胞的传代培养、细胞的生长曲线的绘制等实验内容。见细胞的传代培养、细胞的生长曲线的绘制等实验内容。
大连理工大学 环境与生命学院4.4. 实验步骤实验步骤• 中药活性成分的分离、提取剂鉴定；中药活性成分的分离、提取剂鉴定；
• 细胞的传代培养。细胞的传代培养。
• 检测不同浓度梯度的重要活性成分对肿瘤细胞及正常细胞的生长曲线的影检测不同浓度梯度的重要活性成分对肿瘤细胞及正常细胞的生长曲线的影响（与未加药物组作对照）。响（与未加药物组作对照）。方法：方法： MTTMTT 法绘制生长曲线。法绘制生长曲线。
a a 制备制备 1 ml1 ml 细胞悬液。空白对照以细胞悬液。空白对照以 1 ml1 ml 培养基代替细胞悬液。加入培养基代替细胞悬液。加入 0.1 0.1 ml MTT ml MTT 于于 37℃37℃ 孵育孵育 4 h4 h ，使，使 MTTMTT 还原为蓝紫色甲脯结晶。还原为蓝紫色甲脯结晶。
b b 加加 1 ml DTW1 ml DTW 脱色液，脱色液， 37℃37℃ 至少静置至少静置 30min30min （甚至过夜），使甲脯颗粒（甚至过夜），使甲脯颗粒充分溶解。充分溶解。
c c 吸取吸取 200μl200μl 该溶解液至该溶解液至 9696 孔板孔中，在酶标仪上读取孔板孔中，在酶标仪上读取 ODOD 值，检测波长值，检测波长570nm570nm ，参考波长，参考波长 630nm630nm 。。
d d 每隔每隔 24h24h 测量一个点，每个点为测量一个点，每个点为 33 个平行样品的平均值。 个平行样品的平均值。
大连理工大学 环境与生命学院5.5. 注意事项注意事项• 每一样本组实验应重复三次。每一样本组实验应重复三次。
• MTTMTT 法的原理是测定细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的活性。此法从根本上法的原理是测定细胞线粒体琥珀酸脱氢酶的活性。此法从根本上看是反映细胞的代谢和增殖活力，而非细胞数量。如果想用看是反映细胞的代谢和增殖活力，而非细胞数量。如果想用 MTTMTT 法间法间接测量细胞数量，必须先用接测量细胞数量，必须先用 MTTMTT 法作出细胞数量和法作出细胞数量和 ODOD 值相互关系的值相互关系的趋势线，在线性相关的范围内可间接测量细胞数量。在需要确知细胞趋势线，在线性相关的范围内可间接测量细胞数量。在需要确知细胞数量的场合不宜用数量的场合不宜用 MTTMTT 法。法。
• 可结合科研，将课题组项目中研究的一些抑癌活性物质作为研究对象可结合科研，将课题组项目中研究的一些抑癌活性物质作为研究对象进行分析。浓度根据研究对象的不同，通过预实验来设定。进行分析。浓度根据研究对象的不同，通过预实验来设定。
大连理工大学 环境与生命学院6. 6. 思考题思考题
• 分析实验结果，该中药成分对于肿瘤细胞分析实验结果，该中药成分对于肿瘤细胞的生长是否有作用？请设想一下怎样进一的生长是否有作用？请设想一下怎样进一步验证其结果？ 步验证其结果？
