ЛЕКЦИЯ 3

ГЕНОМ МИТОХОНДРИЙ РАСТЕНИЙ

1. Организация молекул митохондриальной ДНК растений разных систематических групп 2.Изменчивость структуры молекул митохондриальной ДНК 3.Митохондриальные плазмиды 4.Гены митохондрий

5.Интроны митохондриальных генов. Гены интронов

6.Ядерные и пластидные ДНК-последовательности в митохондриальном геноме растений 7.Репликация митохондриального генома растений

• Электронно-микроскопический метод: нити, дающие окрашивание с ДНК-красителями

которые разрушались нуклеазами, увидеть в митохондриях удалось в начале 60-х годов

Оказалось, что мтДНК основных систематических групп эукариот:

простейших,

растений, грибов животных значительно отличаются друг от друга по структуре

Обнаружение митохондриальной ДНК в клетках

Параметры мтДНК растений

• Мт ДНК высших растений – менее 1% от всей ДНК клетки, очень редко достигает 10-15% (гипокотиль дыни).

• Плавучая плотность ДНК мт растений колеблется незначительно: 1,705-1,707, что соответствует 48% ГЦ-пар.

• Размеры мт геномов колеблются очень сильно: 180-2500 тпн.

В семействе тыквенных (Сucurbitaceae) 330 тпн 2500 тпн

дыня арбуз

Виды молекул митохондриальной ДНК:

• большие «геномные» кольца (крайне редко)

• система меньших колец разных длин • линейные молекулы • катенированные кольца • розеткообразные молекулы: до 50

петель с одним ДНК центром (подобие нуклеоидов пластид)

(a) кольцо 3 kb, хвост 28 kb; (b) кольцо 4.4 kb, хвост 9 kb; (c) кольцо 6.5 kb, хвост 0.2 kb; (d) кольцо 7.4 kb, хвост 6.2 kb; (e) кольцо 8.9 kb, хвост 0.5 kb; (f) кольцо 11.6 kb, хвост 7.9 kb; (g) кольцо 20 kb, хвост 65.5 kb; (h) кольцо 51 kb, хвост 26.9 kb; (i) кольцо 61.1 kb, хвост 6.1 kb; (j) кольцо 128 kb, хвост 36.5 kb.

Стрелки указывают места соединения кольца и хвоста

10 сигма-подобных структур мтДНК Chenopodium album

Сигма-подобные структуры мтДНК Chenopodium album

х10

Размерные классы, обнаруженные при анализе 8,000 молекул мтДНК Chenopodium album

Проанализирована 291 сигма-подобная молекула

Большие рекомбинационные повторы

- особенность митохондриальной ДНК растений

218 kb 135 kb 83 kb

Модель структуры митохондриального генома Brassica campestris

полный геном – большое кольцо

два малых кольца –результат рекомбинациипо двум повторам основного кольца

   Recombination in mtDNA of Arabidopsis thaliana. The mtDNA contains a direct repeat (I) and an inverse repeat (II).

Рекомбинационные повторы обнаружены почти во всех

изученных митохондриальных геномах

У пшеницы их 10 (!), у кукурузы - 5 прямых и

1 инвертированный

При таком количестве повторов число субгеномных колец может быть

огромным.

[A]: образование изомера –рекомбинация по инвертированному повтору ( IR ) copy-1 и соpy -2. [B] и [C]: образование двух комплементарных субгеномных молекул при рекомбинации по прямому повтору ( DR ) Copy-2 и -3, and и две копии R5 [D]: образование аберрантной молекулы MC, имеющей лишнюю копию кластера Copy-3/2 и R5 повтора при рекомбинации по повтору R6

D

A

BC

Рекомбинация молекул

мтДНК пшеницы

Не все повторяющиеся последовательности способны

рекомбинировать

Собственных ферментов-рекомбиназ Собственных ферментов-рекомбиназ эти последовательности не кодируютэти последовательности не кодируют

??? Чем отличаются рекомбинирующие повторы от нерекомбинирующих, неясно

Размеры больших повторов

Для большинства повторов:

– от 1000 пн до 10000пн.

Наименьший из известных больших повторов - 266 пн.

Необычно большие повторы:

– у ЦМС- формы петунии 252 000 пн

- у F- ревертанта ЦМС-Т кукурузы 165 000 пн.

Малые повторы в митохондриальных ДНК растений

•Размер – от 6-7 до нескольких сот нуклеотидов

??? Происхождение малых повторов неясно

Малые повторы участвуют в редких рекомбинациях, что иногда приводит к образованию больших

повторов

Показано, что при изменении внешних условий и при культивировании в пробирке, митохондрии могут дестабилизироваться, часть генома при этом утрачивается или преобразуется, что может иметь адаптационный смысл

Модель образования большого повтора с помощью малых

повторов в мтДНК растений

R1, R2 – малые повторы

большие повторыНовая молекула

с большим рекомб. повтором и большой делецией

Исходнаяосновная

кольцеваямолекула

А

В

D

R1

R1

R1

С

R1

R1

R1

R1

R2

R2

R2R2

R2

R2

R2

R2I

II

III

Модель рекомбинации мтДНК табака

Две субгеномные молекулы, C и D, образуются в результате рекомбинации по повторам (в черных участках P кольца).

SacI фрагменты:

P: 19- и 5.4-kb

rec1

C и D: 11.8- и 12.6-kb.

Светло-серые фрагменты – 3 повторяющиеся последовательности

CMSII мт геном содержит только C молекулы

.

Митохондриальные плазмиды –

малые линейные и кольцевые ДНК- и РНК- молекулы, не гомологичные геномной

мтДНК.

Размер мт плазмид колеблется от 1000 до 30000пн.

Митохондриальная плазмида mp1 of Chenopodium album – разные структурные модификации

(a - g) Типичные сигма-подобные структуры mp1. (a) Двунитчатый кольцевой мономер (1.3 kb) с однонитевым хвостом (170 пн); (b) Двунитчатый кольцевой мономер с однонитевым хвостом 400 п.о.; (c - g) двунитчатые кольца 1.3 kb с двунитевым хвостом длиной 0.1 kb (c), 0.6 kb (d), 0.9 kb (e), 1.2 kb (f), and 3.4 kb (g).

Электронные фото различных молекул митохондриальных плазмид ( mp1 ) Chenopodium

album

Плазмиды в митохондриях найдены у многих культурных

растений – кукурузы, сорго, бобов и др.

плазмиды, скорее всего, произошли

из других клеточных геномов и, возможно,

из других организмов ???

Три основные категории плазмид в митохондриях

растений :

кольцевые ДНК-плазмиды

линейные ДНК- плазмиды,

РНК-плазмиды.

Плазмиды могут утрачиваться без каких-то видимых последствий для растений

ДНК

кукурузафасоль

свекла сорго

рис

подсолнечник

Плазмид у одного вида может быть несколько типов – у риса их

четыре

Кольцевые плазмидоподобные молекулы в митохондриальном геноме риса

Имеют высокий процентАТ-пар и терминальные инвертированные повторы

У кукурузы – два типа линейных плазмид (S, R)

Линейные плазмиды способны интегрироваться в митохондриальный геном

! Некоторые последовательности линейных плазмид гомологичны вирусным РНК-

полимеразам.

Линейные ДНК-плазмиды– уникальная группа репликонов

РНК-плазмиды - наименее изученная группа

Обнаружены у риса, кукурузы, Brassica, сахарной свеклы.

Самые крупные (18 тпн)

Четыре типа РНК-плазмид найдено у кукурузы

– два типа двунитчатых и два типа однонитчатых.

Репликация РНК-плазмид не подавлялась актиномицином Д, что указывает на участие в процессе РНК-полимеразы вирусного типа

??? Происхождение РНК-плазмид неясно.

Возможно, они являются реликтами прошлых инфекций, в результате чего сохранился геном

патогена

Размеры секвенированных митохондриальных геномов

растений• Marchantia polymorpha 186609 п.н. 66 генов (94 ORF)• Beta vulgaris 368801 «» 59 генов• Arabidopsis thaliana 366924 «» 57 генов• Oryza sativa 490520 «»• Brassica napus 221 853 «» 54 гена • Zea mays 569630 «» 58 генов (121

ORF)• Triticum aestivum 452528 «» 55 генов• Nicotiana tabacum 430597 «» 60 генов

Самые большие ДНК молекулы - не самые генетически насыщенные

Митохондриальные геномы низших растений имеют меньшие размеры, чем у покрытосеменных

105340 п.н мох Physcomitrella patens 67737 п.н. харовые водоросли Chara vulgaris 42424 п.н пресноводные жгутиковые Mesostigma viride

Все зеленые растения принадлежат к одной из двух ветвей: Streptophyta (наземные растения и харовые водоросли) и Chlorophyta (зеленые водоросли)

Chlorophyta

Streptophyta

С выходом растений на сушу произошло увеличение размера митохондриальных геномов, в основном за счет межгенных участков

белок-кодирующиегены

рекомбинационныеповторы

ядерно-мтгомологичнпоследоват.

Митохондриальный геном ArabidopsisНеустановленные последовательности не имеют явного сходства ни с одной идентифицированной последовательностью в базах данных. Интроны - исключительно группы II.

тРНК не установлена

функция

пластиднаяДНК

1.2%ядерная

ДНК

4%Интроны

9%другие повторы

3.9%

ОРС >100 п.н.

10.2%рРНК0.4%

49%1.3%

16.1%

2.9%

2.2%

Гены митохондрий составляют меньшую часть мтДНК молекулы, они консервативны между

родственными видами

Большая часть генома изменчива, не кодирует белков и часто уникальна для определенного вида растений

Митохондриальная ДНК рапса

К началу 2009 года в базе GOBASE http://megasun.bch.umontreal.ca/ogmp/projects/other/mtcomp.html представлены полные сиквенсы 13-ти митохондриальных геномов высших растений, относящихся к 8 видам

Всего полных сиквенсов органельных ДНК на начало 2009 года - 1898

Общее число видов, для которых эти сиквенсы получены - 1283

Классификация последовательностей мтДНК пшеницы

Категория Кол-во Общий размер (bp)

Пропорция(%)

Полный геном — 452 528 100.0

Гены, включая интроны 76 71 848 15.9

ORFs (более 300 bp), включая входящие в повторы

179 75 465 16.7

Повторяющиеся пос-ти размером более 100 bp

26 68 960 15.2

Хлоропластные последовательности 47 13 455 3.0

Ретро элементы 5 805 0.2

Уникальные (более 100 bp), которых нет у риса и кукурузы

277 257 762 57.0

Практически все уникальные последовательности мтДНК пшеницы относятся к некодирующим областям

Рибосомальные РНК гены: 26S, 18S и 5S, у кукурузы еще 4,5S. 18-5S сцеплены в один кластер и

удалены от 26S.

Ген 5s у грибов и животных в митохондриальном геноме отсутствует

Рибосомы митохондрий крупнее рибосом пластид:

78S (60S + 44S) 70S (50S + 30S)

Источник Marchantia polymorpha Arabidopsis thaliana

Solanumtuberosum

Viciafaba

Helianthusannuus

Petuniahybrida

Triticumaestivum

Zea mays

Митохондрии 29 12 25 н.о. 11 12 9 10

Хлоропласт 0 6 5 н.о. 6 5 6 6

Ядро 2 13 11 >8 н.о. н.о. >3 н.о.

Набор тРНК, кодируемых митохондриальным геномом, значительно различается у разных видов растений

Около трети митохондриально кодируемых тРНК генов в действительности произошли из хлоропластных генов, интегрированных в митохондриальный геном. н.о.= не определялось.

Каков механизм импорта тРНК молекул через мембрану?

Почему одни молекулы проходят, другие нет?

Кто выполняет роль переносчиков?

???

Трансляционный аппарат Гены

рибосомальная РНК rrn5, rrn18, rrn26

рибосомальные белки

малая субъединица rps1, rps3, rps4, rps7, rps8, rps12, rps13, rps14, rps19

большая субъединица rpl2, rpl5, rpl6, rp116

транспортные РНК не менее 16

Субъединицы комплекса дыхательной цепи

NADH-дегидрогеназа (компл. I) nad1, nad2, nad3, nad4, nad4l, nad5, nad6, nad7, nad9

cукцинатдегидрогеназа (компл. II) sdh2b, sdh3c, sdh4

цитохром b (компл. III)

cytb

цитохром c оксидаза (компл. IV) cox1, cox2, cox3

ATФ синтаза atp1, atp6, atp 8, atp9

биогенез цитохрома с ccb206,ccb256 , ссb453, ccb 382, ccb203

постоянные по составу открытые рамки считывания

orf25, mat-rd

Генов рибосомальных белков в митохондриальной ДНК намного меньше, чем в хлоропластной В мтДНК маршанции их 16, у арабидопсиса – 8.

Гены субъединиц комплекса дыхат. цепи:

и 25 у маршанции, 18 у арабидопсиса

Выделенные жирным шрифтом гены найдены и у маршанции, и у арабидопсиса

В митохондриальном геноме арабидопсиса обнаружено

более 150 ORF, состоящих из 100 и более пар

нуклеотидов

Часть из них – «обломки» генов, другая часть – гены, функция которых пока не

установлена

Псевдогены

2 типа:

1 Дегенерировавшие копии генов, не имеющие интактной копии в мт геноме – например ген ФЕН тРНК.

2 Дегенерировавшие копии генов, имеющие полноценные копии в мт геноме (химерные гены при ЦМС)

Интроны митохондриальных генов растений

К 2000 году в мтДНК разных растений найдено 100 интронов

Интроны составляют от 9% до 20% геномной последовательности мтДНК

В мт ДНК арабидопсиса их 23

Длина их колеблется от 485 до 4000 пн

Самый маленький интрон в митохондриальной ДНК – 389 пн.

Вторичная структура интрона coxII у пшеницы

Интроны группы II осуществляют самосплайсинг (рибозимы)

они вероятно могут выполнять роль мобильных генетических элементов

Новые интроны появляются скорее всего дупликацией существующих

и их внедрением в новые участки генома

Поэтому столь велико сходство между интронами в разных генах

Некоторым интронам более 400млн лет!

Они сформировались еще до разделения растений на высшие и низшие 25% всех интронов содержит ОRF ( ген mat-r)

Он отличается неканоническим инициирующим кодоном – GGG.

Функция матураз - вырезание интрона из пре-мРНК.

Ядерные и пластидные последовательности в митохондриальном геноме

У арабидопсиса 15 тпн (5% от всего генома мт) - ядерные

Большая часть этих последовательностей – мобильные генетические элементы, в основном

ретротранспозоны.Также имеются последовательности, сходные с транспозонами бактерий и животных

(межвидовой перенос генетических элементов??? ). Мало данных, так нет полных сиквенсов ядерных геномов

растений.Арабидопсис: 1,2% мтДНК – пластидные последовательностиПшеница – 3% мтДНК -пластидные последовательностиУ кукурузы в мтДНК интегрирован фрагмент пластидной

ДНК размером 12тпн. В митохондриях растений функционируют перенесенные из пластид гены тРНК

Вирусные последовательности в митохондриальном геноме

арабидопсис – две ORF весьма похожи на РНК-зависимые РНК-полимеразы, типичные для РНК- вирусов. Особенно они похожи на РНК полимеразы грибов, патогенных для растений. По-видимому, именно таков был путь переноса: вирусы грибы растения –хозяева.

Механизм интеграции: ??? Cкорее всего, через обратную транскрипцию образуется ДНК-копия

Итак, митохондриальный геном растений:

• содержит 50-60 генов

• крайне изменчив по структуре,

• белок-кодирующие гены и РНК гены составляют менее 20%

• имеет много не идентифицированных ORF

• функция половины мтДНК молекулы не выяснена

• необычно большие молекулы мтДНК за счет интронов, повторяющихся последовательностей, ядерных, пластидных и вирусных фрагментов

• некодирующие участки достигают длины 57 тпн.

• гены, обеспечивающие транскрипцию, процессинг и трансляцию мт генома, локализованы в ядре

9%

ОРС >100 п.н.