红细胞免疫实验所选择的一些测定指标

主讲人 ： 万梅绪

一、红细胞免疫概述：

二、Ｅ花环率（红细胞的免疫吸附）测定

三、唾液酸（ＳＡ）测定

四、封闭度的测定

五、流动性的测定

六、带 3蛋白 (band3) 测定

红细胞免疫概述 近年来随着免疫学研究的逐步深入，人们已认识到红细胞（ＲＢＣ）不仅具有呼吸功能，而且像白细胞一样具有免疫功能。现发现红细胞具有识别、粘附、浓缩、杀伤抗原，清除免疫复合物(IC) 的能力，参与机体的免疫调控，并有完整的自我调控系统。而且在人体的血液系统中，红细胞比白细胞数量多、代谢快，所以在抗肿瘤免疫反应中，红细胞应该发挥着重要调控作用，形成抗肿瘤免疫调控网络，开辟综合治疗肿瘤的一条新的思路和机制。

而对于红细胞免疫检测的方法，从 1982 年开始，基本建立了红细胞 C3b 受体和免疫复合物花环实验、单克隆抗体 Coombs 试验、红细胞 SPA 花环试验、酵母多糖血凝法、调节因子活性测定及肿瘤血凝法等 10 余种经典的免疫监测方法。随着对红细胞免疫的进一步深入研究，国内外又建立了测定红细胞 C3b 受体活体发光法，红细胞膜促白细胞吞噬作用的化学发光法免疫金银染色法，肿瘤细胞血凝法和酶法及直向肿瘤红细胞花环试验等 10 余种新的方法。这些方法的建立大大促进了红细胞免疫的基础理论和临床研究的进展。

Ｅ花环率（红细胞的免疫吸附）

红细胞膜表面上有糖蛋白受体，因此 RBC 通过受体可免疫粘附各种肿瘤细胞，而且通过过氧化物酶等作用，对癌细胞具有效应细胞作用，可阻止癌细胞血行转移，并与肿瘤病人的病情疗效，转移密切相关 .而红细胞之所以能够黏附各种肿瘤细胞，主要是因为红细胞膜上有一些受体。如血循环中 95%的 C3b 受体 (CR)存在于经红细胞表面，因此红细胞 CR 是红细胞免疫粘附作用的关键部位，并在运送和清除 IC方面起着重要作用。判断红细胞免疫功能的主要指标为 CR 和 IC.

实验所需要的药品及仪器 :新鲜豚鼠或者人的新鲜血液 ; 0.25% 戊二醛 ,瑞士染色剂 ,载玻片 ,盖玻片 ,

高倍显微镜

测定方法：昆明种小鼠接种瘤株，接种次日开始给药，连续 7天，于停药第二天处死，取血，离心、洗涤制成红细胞悬液（ 1×108/ml）待用。

小鼠肝癌 H22 细胞接种于昆明种小鼠腹腔连续传代，实验时无菌抽取 7天龄腹腔肿瘤细胞以 Hankis 液洗涤 2遍，制成肿瘤细胞悬液（ 1×106/ml）。取此悬液 0.1ml 加等体积豚鼠（或人）新鲜血液， 37°C水浴 1小时，洗涤离心 2次，弃上清液，成为血清致敏癌细胞，加 0.05ml红细胞悬液 ,37°C水浴 30分钟，加 0.25% 戊二醛固定、涂片、瑞氏染色 .

肿瘤细胞兰色，红细胞红色，一个肿瘤细胞结合 3个以上红细胞为肿瘤红细胞花环。 计算花环率。

需要注意的问题： 1 小鼠取血前最好禁食不禁水 12h，才能取出较多的血。

2 人的新鲜血液一定要保持新鲜，才能成为血清致敏癌细胞。

3 瑞士染色剂最好在一个月以前就配置好，最好是保存三个月以上。

4 查Ｅ花环时一定要查准。

唾液酸（ＳＡ）

唾液酸（ SA ）是广泛存在于各种生物组织中的，构成细胞表面复合糖质的组成部分 ,是细胞膜上糖链末端的残基，是膜上负电荷的来源，对保持细胞的正常生理活动和功能十分重要，唾液酸增多影响细胞膜表面电荷特性，膜的物质转运过程。有关资料表明， SA具有明显的抗识别作用，许多癌化后的细胞，其表面富含唾液酸粘蛋白。

有研究表明，唾液酸转移酶与肿瘤转移密切相关。细胞膜表面唾液酸含量与肿瘤的恶性程度有关，发现随着肿瘤的生长，红细胞膜上的唾液酸含量增加。红细胞中的唾液酸主要存在红细胞膜上，唾液酸含量增多，可影响红细胞膜（ RBC ）表面电荷磁性，膜的转运物质过程、抗原决定簇的暴露、免疫应答细胞活性、膜表面受体功能等因素。

一些抗癌药物可抑制唾液酸转移酶活性，减少细胞表面唾液酸含量，显著降低肺癌转移的结节散，使小鼠的生存时间延长。在大鼠试验中，它们能抑制大肠癌的肝转移。其作用机制不是直接作用于癌细胞，而是通过抑制唾液酸转移酶，诱导细胞表面糖链结构改变，从而影响癌细胞与正常细胞的相互作用。综上所述，抑制唾液酸转移酶，降低癌细胞表面唾液酸含量，是某些抗转移药物的主要机制之一。

实验所需要的药品及仪器 :蛋白酶水解抑制剂对甲苯磺酰胺（ PMSF）（ Sigma公司）；考马斯亮蓝 CBBG250 （南京建成生物工程研究所）；蛋白标准品（南京建成生物工程研究所）；唾液酸标准品（浓度（南京建成生物工程研究所）； 5- 甲基苯二酚（南京建成生物工程研究所）。

仪器 :离心机（北京医用离心机厂）；低温高速离心机（ BECKMAN AvantiTM68 centrifuge）；电热恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）； 751分光光度计（上海第三仪器厂）

　　测定方法： 取全血离心 ,3000 转 / 分， 10分钟， 1:3生理盐水洗涤 2次， 1:1悬浮在生理盐水中制成红细胞悬液 ; 加入 5p 8.4 磷酸缓冲溶液 (1:30) 4℃ 1小时溶血使成为红细胞溶血液 .然后4℃下离心 ,12000g， 40分钟，弃上清液， 5p8.4 磷酸缓冲液洗涤 3次，最后悬浮在一定量5p8.4 磷酸缓冲液中。制成为影泡悬浮液。

膜蛋白定量 使用试剂盒：按要求处理完后混匀，静止 10分钟，于 595 nm波长处，空白管调零后，测各管吸光度。蛋白含量（ mg/ml） =（测定管 OD值 /标准管 OD值）×标准管浓度（ mg/ml）根据原始蛋白浓度值，将样品最终稀释至 1 mg/ml，放置低温冰箱备用。

SA 测定也按照试剂盒要求操作 , 然后混匀， 100℃水浴 15分钟，流水冷却后， 3000 转 / 分，离心 10分钟，取上清，于 560 nm波长处，空白管调零读取各管吸光度。

数据处理 用 SPSS11.0软件处理。各组数据以 ±s表示，样本比较采用方差检验。

　需要注意的问题：1 本实验的重点在于溶血步骤，一定要用生理盐水充分将红细胞洗干净，再用低渗溶液破膜。且最好过夜。

2 本实验要在低温离心机下进行。一定要注意始终保持 4℃左右的温度

3 本实验过程中的蛋白定量一定要作准，才有可能进行下面的实验。

封闭度正常红细胞在等渗溶液中能重新封闭起来，恢复对大分子和阳离子的通透屏障，形成封闭影泡。影泡在封闭状态时，大分子和阳离子不能透过细胞膜。因此膜内侧表面的酶不能和外加的底物接触发生反应，即酶对底物的可及性小。当制备的影泡加入表面活性剂后，消除了膜的通透屏障，则酶对底物充分接触，显示最大酶活性。即酶对底物的可及性越小，表示影泡的封闭度越大，反之，可及性越大，影泡封闭度越小。由于在癌症发病和抗癌药物的双重影响下，红细胞膜的结构和功能发生改变，尤其是膜蛋白质和脂质的过氧化，这些变化势必影响红细胞膜重新封闭的能力。

实验所需要的药品及仪器 :蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（ PMSF）（ Sigma ）；考马斯亮兰 CBBG250 （南京建成生物工程研究所）；白皂素 ; K3Fe（ CN） 6 。

751分光光度计；低速离心机（北京离心机厂）；低温高速离心机（ BECKMAN）；超净工作台 ;光学显微镜。

测定方法：红细胞封闭影泡的制备 ：先制备不封闭影泡，方法同前。然后用等渗磷酸缓冲液将不封闭影泡洗涤一次， 2000 转 / 分，离心 10分钟，接着将洗过的影泡放在等渗溶液中， 37℃保温 1小时即获得封闭影泡。

NADH－细胞色素 C 氧化还原酶活性的测定：取膜样品（膜液） 0.6ml于比色杯中，按要求加反应液，混匀后在波长 420nm处比色，以加入 NADH为起点，记录反应开始 6 分钟内的 OD 值（每隔 1分钟记录一次）。上述反应在室温（ 25℃）进行。比色对照，除不加 NADH 溶液外其他操作同上。

数据处理同上。需要注意的问题：加入 NADH 后 1min后需要马上测定，时间尽量计准。

另外 ,K3Fe（ CN） 6需要现配现用 ,否则容易失效。

红细胞膜的流动性

大量事实证明 , 许多疾病与生物膜脂的流动性变化有关 , 在细胞周期的不同时相、代谢过程中、疾病条件下以及药物作用后细胞膜都会有流动性的变化，而且发现许多疾病除实质性器官的细胞膜病变外，常伴有红细胞膜的异常。红细胞的正常功能也与红细胞膜的流变性质有很大关系，对细胞形态、物质运输、酶活性、抗原性及受体活性等均有影响。

红细胞膜流动性实际上是指膜质流动性，其中也包含膜中蛋白质的运动。红细胞膜质流动性对红细胞的形态结构、酶活性、受体活性及物质转运均有影响。膜流动性增大 , 微粘度下降 ,血流流速加快 ,红细胞免疫粘附肿瘤细胞的能力则会随之增强。

我们期望的目的是：与正常组相比，荷瘤小鼠红细胞微粘度升高，膜脂流动性下降，经过药物处理后，不同荷瘤小鼠机体内红细胞微粘度均有不同程度的下降，即膜脂流动性有所提高。

测定细胞膜流动性的方法很多 ,如差示扫描量热法 (DSC) 、 X 射线衍射法、电子自旋共振法（ ESR) 、核磁共振 (NMR) 及荧光偏振法等。

这里我们运用荧光偏振法选用荷瘤小鼠红细胞膜作为考察对象，观察红细胞膜流动性的变化。

实验所需要的药品及仪器 :

试剂与药物 蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（ PMSF）（ Sigma ）；考马斯亮蓝 CBBG250 （南京建成生物工程研究所）； DPH(Sigma公司生产 )；生理盐水 ;

荧光分光光度计 ,低速离心机 , 水浴箱 ,低温高速离心机（ AvantiTM68 centrifuge ， BECKMAN）。

测定方法：红细胞膜的制备同上。膜蛋白定量同上 .红细胞膜的荧光标记：膜蛋白定量后，取新配制的 2mmol/L DPH(Sigma公司生产 ) 四氢呋喃液 10μl分别加入 10.0ml RBC膜缓冲液 ( 膜蛋白总量 980μg/ml) 及 10.0ml瘤细胞悬液， 25℃ 温浴 30min，用 PBS液洗涤 1 次 , 最后将细胞悬浮于 4.0ml PBS液中，即得 DPH标记的细胞膜。

荧光偏振度的测定：细胞膜的流动性采用荧光偏振度 (P)和微粘度 (η)表示。

实验采用日立公司生产的 RF-540荧光分光光度计测荧光偏振度。 λex362nm,λem432nm,狭缝 10nm,测温 25 ,℃ 按公式计算 P 值和 η值。

数据处理同上注意事项 :在运送样品时尽量使样品处于低温下。

带 3蛋白 (band3) 测定带 3蛋白 (band3) 是红细胞 (RBC) 膜中含量较多的含糖内在蛋白，是一种典型的多次跨膜蛋白质 ,介导 Cl-、 HCO3-的跨膜交换过程 ,参与细胞内 pH酸碱平衡的调节 ,并与细胞增殖、凋亡和衰老相关。带 3蛋白的 14 次跨膜 (transmembrane, TM)结构是阴离子交换的活性部位 ,它可以不依赖于胞质域而独立发挥离子交换的作用。实验证明，带 3蛋白除了具有物质转运功能之外，还具有调节血红蛋白携氧能力，调节和保护糖酵解酶活性及稳定红细胞骨架的功能 。

试剂与药物 30%丙烯酰胺贮存液：称取丙烯酰胺 58g，甲叉双丙烯酰胺 2g，加蒸馏水溶解定溶至 200ml，装入棕色瓶 4℃保存；

1.5mol/L Tris·CI （ PH8.8 ）缓冲液： 4℃保存；

0.5mol/L Tris·CI （ PH6.8 ）缓冲液： 4℃保存；

10%SDS ：室温保存； 10%过硫酸铵（ APS ）： 4℃避光保存；四甲基乙二胺（ TEMED）：原液使用， 4℃避光保存。

电泳缓冲液：称取 Tris 15.15g，甘氨酸 72.05g，用蒸馏水溶解，定容至 5L后， 加 5gSDS溶解其中；

样品缓冲液： 1mol/L Tris·CI （ Ph6.8 ）缓冲液 25ml

10%SDS 80ml甘油 40ml 1%溴酚蓝 (BPB) 4mlβ-巯基乙醇 4ml荷瘤小鼠（ S180 、 H22）红细胞膜悬液（浓度为 1mg/ml）

电泳仪（美国， Bio-Rad ）；凝胶成像系统（美国， Bio-Rad Gel Doc1000 ）； 101A型电热鼓风干燥箱（吴江华盛烘箱厂）； HY-3型多功能调速振荡器

注意事项：电泳是一项需要高重复性和精密的实验，需要足够的耐心和细心才能顺利完成，如点样的准确性，胶板的聚合，电泳的正负极等都需要在实验前多熟悉 。还有：涉及到分子生物方面的试剂价格都比较贵，所以在设计实验的时候需要预算开支。

感 谢 各位老师、同学的

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