乳汁中含有人生长激素的转基因牛 ( 阿根廷 )

转鱼抗寒基因的番茄

转基因抗虫棉

抗虫棉

普通棉

DNA 重组技术的基本工具

基因工程的概念基因工程的概念基因工程又叫做基因拼接技术或 DNA 重组技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。

基因工程的别名基因工程的别名

操作环境操作环境

操作对象操作对象

操作水平操作水平

基本过程基本过程实质实质

结果结果

基因拼接技术或基因拼接技术或 DNADNA 重组技重组技术术生物体外生物体外

基因基因

DNADNA 分子水平分子水平

人类需要的基因产物人类需要的基因产物

剪切剪切 → → 拼接拼接 → → 导入导入→ → 表达表达基因重组基因重组

基因工程的概念基因工程的概念

• 基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：

普通棉花普通棉花 (( 无抗虫特无抗虫特性性 ))

苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取

抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体 DNADNA 拼拼

接接

导入导入

棉花细胞棉花细胞 (( 含含抗虫基抗虫基因因 ))

棉花植株棉花植株 (( 有有抗虫特抗虫特性性 ))

• 上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？

• 基因工程培育抗虫棉的关键步骤：基因工程培育抗虫棉的关键步骤：

关键步骤一：关键步骤一： 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内细胞内提取出来提取出来

关键步骤二：关键步骤二： 抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体 DNADNA 连连接接

关键步骤三：关键步骤三： 抗虫基因抗虫基因导入受体导入受体 (( 棉花棉花 )) 细细胞胞

• 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？

关键步骤一的工具：关键步骤一的工具：

关键步骤二的工具：关键步骤二的工具：

关键步骤三的工具：关键步骤三的工具：

基因的基因的剪刀剪刀————限制酶限制酶

基因的基因的针线针线———— DNADNA 连接酶连接酶

基因的基因的运载工具运载工具————运载体运载体

DNA 重组技术的基本工具本节知识内容

§1 DNA 重组技术的基本工具

专题一 基因工程

“ 分子手术刀” ──限制酶 “ 分子缝合针” ── DNA 连接酶

“ 分子运输车” ── 基因进入受体细胞的载体

识别双链识别双链 DNA DNA 分子的某种分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中，并且使每一条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。断开。

主要是从主要是从原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来的一的一种酶。能将外来的种酶。能将外来的 DNADNA 切断切断，由于这，由于这种切割作用是在种切割作用是在 DNADNA 分子内部进行的，分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。故名限制性核酸内切酶。

40004000 种。种。

11 、来源： 、来源：

22 、种类：、种类：

33 、作用：、作用：

44 、结果：、结果：形成两种末端形成两种末端

一、 “分子手术刀” ——限制性核酸内切酶一、 “分子手术刀” ——限制性核酸内切酶

粘性末端平末端

大肠杆菌大肠杆菌 (E.coli)(E.coli) 的一种限制酶的一种限制酶能识别能识别GAATTCGAATTC 序列序列，并在，并在 GG 和和 AA 之间切开。之间切开。

限制酶限制酶

什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？

限制限制酶酶

• 什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？

• 什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？

被限制酶切开的被限制酶切开的 DNADNA 两条单链的切两条单链的切口，带有几个口，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，他们之间正，他们之间正好好互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。。

什么叫平末端？什么叫平末端？ 当限制酶从识别序列的中心轴线处切当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的开时，切开的 DNADNA 两条单链的切口，是两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平整的，这样的切口叫平末端平末端。。

限制酶所识别的序列有什么特点？ 限制酶所识别的序列，无论是 6 个碱基还是

4 个碱基，都可以找到一条中心轴线 , 中轴线两侧的双链 DNA 上的碱基是反向对称重复排列的。

图 1-1 限制酶识别序列的中心轴线

二、 “分子缝合针” —— 二、 “分子缝合针” —— DNADNA 连接酶连接酶

1 、种类：

2 、作用部位：

两类 E·coli DNA 连接酶

T4 DNA 连接酶 磷酸二酯键

DNADNA 连接酶连接酶可把黏性末端可把黏性末端之间的缝隙之间的缝隙““缝合缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的接起来，这样一个重组的 DNADNA 分子就形成分子就形成了。了。

DNADNA 连接酶与连接酶与 DNADNA 聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？

（（ 11 ）） DNADNA 聚合酶只能将单个核苷酸加到已聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯键；而而 DNADNA 连接酶是在两个连接酶是在两个 DNADNA 片段之间形成片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与 DNADNA 片段片段之间形成磷酸二酯键。之间形成磷酸二酯键。

（（ 22 ）） DNADNA 聚合酶是以一条聚合酶是以一条 DNADNA 链为模板，链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的板链互补的 DNADNA 链；而链；而 DNADNA 连接酶是将连接酶是将DNADNA 双链上的两个缺口同时连接起来。因此双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNADNA 连接酶不需要模板。连接酶不需要模板。

此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。组成和性质各不相同。

三、 “分子运输车” —基因进入受体细胞的载体：三、 “分子运输车” —基因进入受体细胞的载体：

练习答案

2 和 7 能连接形成… ACGT…

              …TGCA… ；4 和 8 能连接形成… GAATTC…

             …CTTAAG… ；3 和 6 能连接形成… GCGC…

             …CGCG… ；1 和 5 能连接形成… CTGCAG…

             …GACGTC… 。

迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断 DNA 上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身 DNA ，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的 DNA 可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其 DNA 分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的 DNA 被切断，并且可以防止外源 DNA 的入侵

基因工程中作为载体使用的 DNA 分子很多都是质粒（ plasmid ），即独立于细菌拟核处染色体 DNA 之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的 DNA 分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。

（ 1 ） 载体 DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。

（ 2 ） 载体 DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体 DNA 上随染色体 DNA 的复制而同步复制。

（ 3 ） 载体 DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。

（ 4 ） 载体 DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。

（ 5 ） 载体 DNA 分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。

实际上自然存在的质粒 DNA 分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

课本知识回顾

基因工程又叫做 或 。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 提取出来，加

以 ，然后放到另一种生物的细胞里， 改造生物的遗传性状。

基因拼接技术DNA 重组技术

基因

修饰改造定向地

DNA 重组技术的基本工具

“ 分子手术刀” ──“ 分子缝合针” ──

“ 分子运输车” ──

限制酶

DNA 连接酶

基因进入受体细胞的载体

限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶

主要是从 的一种酶。主要是从 的一种酶。 识别双链识别双链 DNA DNA 分子的某种 ，并分子的某种 ，并

且使每一条链中且使每一条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的 的两个核苷酸之间的 断开。 断开。

形成两种末端形成两种末端

原核生物中分离纯化出来特定的核苷酸序列

磷酸二酯键粘性末端

平末端

二、 “分子缝合针” —— 二、 “分子缝合针” —— DNADNA 连接酶连接酶

1 、种类：

2 、作用部位：

两类E·coli DNA 连接酶

T4 DNA 连接酶

磷酸二酯键

基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体

通常有三种 :

在进行基因工程操作中 , 真正被用作载体的质粒都是在 基础上进行过

的

质粒

λ 噬菌体衍生物

动植物病毒

天然质粒

人工改造