ДОПОВІДЬ НА ТЕМУ:

РОЗРОБКА ТА ВАЛІДАЦІЯ МЕТОДИК РОЗРОБКА ТА ВАЛІДАЦІЯ МЕТОДИК

КОНТРОЛЮ ЯКОСТІ КОНТРОЛЮ ЯКОСТІ ВІТАМІННО-ВІТАМІННО-

МІНЕРАЛЬНОГО ПРЕПАРАТУМІНЕРАЛЬНОГО ПРЕПАРАТУ

Асистента кафедри медичної та біоорганічної хімії, кандидата фармацевтичних наук

Левашової Ольги Леонідівни

Листопад 2013

Актуальність темиКількість лікарських засобів, мультивітамінних препаратів, біологічно

активних та харчових добавок, з кожним роком збільшується. Зростаючі вимоги до безпеки, ефективності та якості лікарських препаратів, БАДів обумовлюють необхідність розробляти нові і удосконалювати існуючі методи їх аналізу.

Слід відзначити, що питання розробки, верифікації і валідації методик контролю якості мультивітамінних препаратів і БАДів практично не вивчалися в вітчизняній літературі.

Це пов’язано, передусім, зі значною складністю цих об’єктів – вони містять велику кількість мікроелементів, водо- і жиророзчинних вітамінів у низьких концентраціях, які є дуже чутливими до хімічних і фізичних чинників і умов зберігання.

Тому розробка та валідація селективних методик одночасного кількісного визначення МЕ, вітамінів, є актуальним завданням..

2

Мета та завдання дослідженняМета роботи - розробка та валідація методик аналітичного контролю вітамінно-мінеральних препаратів на вміст мікроелементів, водо- та

жиророзчинних вітамінів.

Завдання дослідження:

−провести аналіз стану валідації і верифікації аналітичних методик контролю

якості ліків, включаючи міжнародні програми і зарубіжні фармакопеї;

−розробити методики кількісного визначення мікроелементів методом ААС та

вітамінів методом ВЕРХ;

−провести дослідження та запропонувати підходи валідації методик кількісного

визначення МЕ методом ААС із застосуванням калібрувального графіку;

−запропонувати стандартизовану схему та оптимізувати процес валідації

аналітичних методик методом ААС;

−сформулювати єдині критерії прийнятності валідаційних характеристик;

−розробити документацію з валідації методик кількісного визначення МЕ.

Завдання дослідження:

−провести аналіз стану валідації і верифікації аналітичних методик контролю

якості ліків, включаючи міжнародні програми і зарубіжні фармакопеї;

−розробити методики кількісного визначення мікроелементів методом ААС та

вітамінів методом ВЕРХ;

−провести дослідження та запропонувати підходи валідації методик кількісного

визначення МЕ методом ААС із застосуванням калібрувального графіку;

−запропонувати стандартизовану схему та оптимізувати процес валідації

аналітичних методик методом ААС;

−сформулювати єдині критерії прийнятності валідаційних характеристик;

−розробити документацію з валідації методик кількісного визначення МЕ.

3

Склад вітамінно-мінеральних препаратів

4

Назва препарату Склад

Вітаміни Мікроелементи

Жестікер

(Keata Pharma Inc.)D3, Е, В1, В2, В3, В6, В9,

В12, С

Ca, Fe, Zn, К, J

Вітакап

(Mega Lifesciences)A, D3, E, B1, B2, B3, B5,

B6, B9, B12, C

Ca, Fe, Zn, K, Mg,

Mn, Cu

Вітирон Сускапс

(Mepha)A, D3, E, B1, B2, B3,B5,

B6,B9, B12, C

Ca, Fe, Zn, Cu, K, J,

P, Mn, Mg, Mo

В якості об'єктів аналізу були вітамінно-мінеральні препарати: Жестікер (Keata Pharma Inc.) Вітакап (Mega Lifesciences), Вітирон

Сускапс (Mepha) та їх активні інгредієнти/

Методи визначення

Метод визначення Інгредієнт

Атомно-абсорбційна

спектроскопіяФеррум, цинк, кальцій

Високоефективна рідинна

хроматографія Вітаміни

Метод титриметрії Аскорбінова кислота

5

Огляд літератури свідчить про доцільність розробки селективних методик аналізу таких складних багатокомпонентних лікарських препаратів та вітамінно-мінеральних комплексів.

Огляд літератури свідчить про доцільність розробки селективних методик аналізу таких складних багатокомпонентних лікарських препаратів та вітамінно-мінеральних комплексів.

Аналіз вітамінів і мікроелементів у вітамінно-мінеральних препаратах проводили розробленими нами і відвалідованими

аналітичними методиками

Пробопідготовка для визначення мікроелементів

Пробопідготовка для визначення заліза

Досліджуваний зразок (розтерті таблетки вітамінно-мінерального препарату) піддавали сухому озоленню, при якому відбуваються повне окислення і видалення органічної основи проби з подальшим відновленням у НСl та розбавленням.

6

Пробопідготовка для визначення Ca, Zn

При аналізі Ca та Zn використовувалась кислотна екстракція. Для уникнення інтерференції заліза і других мікроелементів використовували розчин хлориду лантану. При визначенні Са, що утворює важко дисоціюючі сполуки використовували також високотемпературне полум'я (3000-3200ºС), суміш N2О / ацетилен.

Концентрація, μг/мл 7

Вимірювання проводили на спектрометрі атомної абсорбції Varian 220 FS Double Beam AA, забезпеченому лампою з порожнистим катодом специфічною для відповідного елементу.

Умови визначення вмісту мікроелементів

МЕ Довжина

хвилі, нм

Ширина

щілини, нм

Тип полум'я

Fe 248.3 0,2повітря/

ацетилен

Zn 213.9 1,0повітря/

ацетилен

Са 422.7 0,5N2О/

ацетилен

Розробка та валідація методик визначення мікроелементів

Зміст методики1. Мета2. Відповідальність3. Визначення4. Матеріали і обладнання5. Частота визначення6. Особливості процедури7. Процедура7.1.Приготування розчинників7.2 Приготування стандартних розчинів7.3 Приготування зразка для кількісного визначення7.4 Послідовність вимірювань7.5 Критерії допуску7.6 Розрахунки

8

«Кількісне визначення вмісту заліза та проведення тесту розчинення» та «Кількісне визначення вмісту кальцію і цинку та проведення тесту розчинення» методом атомно-абсорбційної спектрометрії.

Наукова значимість методик відтворена в заявках на видачу патенту на корисну модель та винахід, і підтверджена актами впровадження в

аналітичних лабораторіях

Схема кількісного аналізу вмісту вітамінів у препаратах

Переваги:

Схема передбачає застосування методу ВЕРХ практично в усіх випадках. Виняток становить визначення вітаміну С, який зручніше і простіше визначати титриметричним методом.

Пропонована схема є сукупністю ВЕРХ-методик, в яких використовується однотипне обладнання і обмежений набір розчинників і реагентів для обробки аналізованих препаратів і приготування рухомих фаз (елюентів).

Може бути застосовна для аналізу будь-яких вітамінних препаратів без яких-небудь змін і дозволяє визначати в них вміст жиророзчинних вітамінів D3, Е, і водорозчинних вітамінів групи В.

9

Хроматограма вітамінів В3 и В6

Стандарт Зразок

10

Валідація аналітичних методик

11

Проблеми:

1. не зустрічається систематизованої процедури та науково

обґрунтованих критеріїв придатності валідаційних характеристик,

що пов’язані з вимогами до невизначеності результату аналізу

фармацевтичних випробувань.

2. у керівних документах надаються тільки загальні вимоги щодо

оцінки невизначеності результатів аналізу, які не стосуються

специфіки фармацевтичного аналізу.

3. в ДФУ відсутні валідаційні критерії прийнятності щодо методик ААС

з використанням калібрувального графіку.

Тому стає необхідним розробка критеріїв прийнятності для валідаційних характеристик кількісного визначення мікроелементів

методом ААС із застосуванням калібрувального графіку.

Статистичні критерії процесу валідації методики

Вміст заліза в препараті Жестікер складає 25.2-32.2 мг, що

відповідає (28 ± 3.5 мг) або 87.8% – 112.2% (100 ± 12.2)% від

номінального вмісту.

Повна невизначеність (ΔАs): max ΔАs = 0.32 · 12.2 = 3.90% (1)

Критерій статистичної незначущості (системна невизначеність):

max δ = 0.32 · max ΔАs = 0.32 · 3.90 = 1.25% (2)

∆кал = t (0.95, v = 5 – 2 = 3) • SD залиш = 2.35 • SD залиш (3)

∆As = ≤ max ∆As = 3.90 (4)

12

Валідації підлягали наступні валідаційні характеристики: лінійність, прецизійність, специфічність, діапазон застосування,

внутрішньолабораторна прецизійність, робасність.

Підходи для визначення критеріїв1. Незначність невизначеності калібрування.

Величина ∆кал повинна бути незначуща в порівнянні з гранично

допустимою повною невизначеністю аналізу ∆As, тобто,

Δкал ≤ 0.32 · max ΔАs = 0.32 · 3.90 = 1.25% (5)

У цьому випадку невизначеність калібрування Δкал не перевищує

максимально припустиму системну похибку.

Виходячи з цього одержуємо значення залишкового стандартного

відхилення 0.53% що відповідає SD залиш = 0.021ррм:

SD залиш ≤ Δкал / 2.35 = 1.25 / 2.35 = 0.53% (6)

Це співвідношення дозволяє одержати вимоги до коефіцієнту

кореляції Rc та його квадрату калібрувальної прямої:

Rc2 ≤ 1 – (SDзалиш / SDСо)2 = 1 – (0.53 / 39.53)2 = 0.99982 (7)

Rc ≤ 0.99991.

ΔАs ≈ ∆ зразка ≤ max ΔАs = 3.90 (8)

Підходи для визначення критеріїв2. Невизначеність калібрування рівна невизначеності аналізу зразкаМожна припустити, що невизначеність аналізу калібрувальних розчинів дорівнюється невизначеності аналізу самого зразка, тобто: ∆кал = ∆зраз В цьому випадку із рівняння (4) отримаємо:

∆ As ≤ √2 • ∆ кал = √2 • ∆ зраз = 3.90 (9)∆ кал = ∆ зраз = 2.76 %

Тоді отримаємо: SDзалиш ≤ ∆ кал / 2.35 = 2.76/2.35 = 1.17 % (10)Відзначимо, що SDзалиш = 1.17% ( 0.047 мкг/мл) від номінального значення (4 мкг/мл). Це співвідношення дозволяє отримати вимоги до коефіцієнта кореляції Rc і його квадрату калібрувальної прямої:

R2c ≤ 1 – (SDзалиш/SDСо)2 = 1 – (1.17/39.53)2 = 0.99912 (11)

Rc ≤ 0.99956Таким чином, для подальшого проведення валідації нами обрано значення ΔАs = 1.25%, як найбільш вимогливий критерій. Значення коефіцієнту кореляції

було обране із другого підходу тобто R2 = 0.99912. Даний підхід пред'являє значно ліберальніші вимоги до калібрування і представляється реальнішим на практиці.

Таким чином, для подальшого проведення валідації нами обрано значення ΔАs = 1.25%, як найбільш вимогливий критерій. Значення коефіцієнту кореляції

було обране із другого підходу тобто R2 = 0.99912. Даний підхід пред'являє значно ліберальніші вимоги до калібрування і представляється реальнішим на практиці.

Критерії прийнятності специфічності

Результати паралельних вимірювань Середнє Отрима

но∆, %

Розчин

плацебо 0.0009 -0.0003 0.0003 0.0007 0.0012 0.0006 -0.032 0.6022

Холостий

розчин 0.0006 -0.0005 -0.0001 -0.0005 0.0002 -0.0003 -0.067 -0.3011

У випадку наявності сигналу відповідного залізу отримана концентрація не повинна перевищувати 1,25% від номінального значення

Δ Аs х 0,32 = 3,9 х 0,32 = 1,25%. Абсорбція (бланк) = -0,0003; Абсорбція (плацебо) = 0,0006; середня Абсорбція (зразка100%)= 0,0946

Таким чином, внесок плацебо в сумарну величину фонового поглинання є незначущий і їм можна нехтувати.

У випадку наявності сигналу відповідного залізу отримана концентрація не повинна перевищувати 1,25% від номінального значення

Δ Аs х 0,32 = 3,9 х 0,32 = 1,25%. Абсорбція (бланк) = -0,0003; Абсорбція (плацебо) = 0,0006; середня Абсорбція (зразка100%)= 0,0946

Таким чином, внесок плацебо в сумарну величину фонового поглинання є незначущий і їм можна нехтувати.

15

Результати вимірювання поглинання розчину плацебо і холостого розчину

Критерії прийнятності лінійності Нами перевірялась коректність використання лінійної моделі калібрування.

Були розраховані та перевірені параметри лінійної залежності аналітичного сигналу від концентрації: - залишкове стандартне відхилення SD0 (SD0 ≤ 0.53 %)

- коефіцієнт кореляції R (Rc ≥ 0.99912)

Оцінку лінійної залежності проводили на всьому діапазоні використання методики

№ р-на

Паралельні вимірюванняС,

мг/лSD парал. вимірюв.

1 2 3 4 5 середнє

1 0,0499 0,0493 0,0502 0,0501 0,0498 0,0499 2 0.7

2 0,0729 0,0731 0,0723 0,0737 0,0722 0,0728 3 0.9

3 0,0962 0,0959 0,0951 0,0956 0,0949 0,0955 4 0.6

4 0,1190 0,1194 0,1190 0,1195 0,1195 0,1183 5 0.4

5 0.1406 0.1396 0.1412 0.1403 0.1407 0.1405 6 0.4

16

Розрахунок параметрів лінійності

Калібрувальні розчини Модельні розчини

Параметр Значення Параметр Значення

A -5.20705 A -2.89844

Sa 0.34581 Sa 0.01640

B1 1.04324 B2 1.02078

Sb 0.00325 Sb 0.00016

SD rest 0.24631 SD rest 0.01426

R2 0.99998 R2 117

Результати аналізу лінійності модельних розчинів фумарату заліза і

їх статистична обробка (1)№ мод. розчину X% =

100*Аi/АстдY розр. % Y введ. %

Найдено/ введено, %

100*Yрозр/Yввед

1 52.25 49.82 50.95 97.792 63.98 62.17 63.03 98.653 76.34 75.19 75.78 99.224 89.32 88.86 89.13 99.705 101.26 101.43 101.45 99.986 112.36 113.12 112.90 100.207 124.50 125.92 125.40 100.418 134.66 136.61 135.85 100.569 145.34 147.86 146.88 100.67

Середнє, Xcp % 99.69

18

Результати аналізу лінійності модельних розчинів заліза і їх

стат. обробка (2)Відносне стандартне відхилення, SD% 0.97

Довірчий інтервал , ΔAs% =t(95%,8)*SD=1,86*SD= 1.80

Критичне значення для збіжності результатів ΔAs % ≤ 3.90

Критичне значення систематичної похибки δ 1.25

Систематична похибка δ=│100 - Xср│ 0.31

Критерій незначущості систематичної похибки1) δ≤ Δ/3 = 1,80/3 = 0,60

2) якщо не виконується 1), то δ ≤ 1.25ВиконуєтьсяВиконується

Загальний висновок про методику Відповідає

19

Отже, при освоєнні процесу валідація методик, можна відзначити ряд позитивних ефектів:

по-перше, відпрацьована процедура, і ми приступили до етапу розумного скорочення об'єму експерименту і документації.

по-друге, ми знайшли упевненість в методиках, що позитивно позначилося як на роботі фармацевтичної аналітичної лабораторії.

Отже, при освоєнні процесу валідація методик, можна відзначити ряд позитивних ефектів:

по-перше, відпрацьована процедура, і ми приступили до етапу розумного скорочення об'єму експерименту і документації.

по-друге, ми знайшли упевненість в методиках, що позитивно позначилося як на роботі фармацевтичної аналітичної лабораторії.

Валідаційна документація

Зміст валідаційного звіту1. Заголовок2. Мета проведення валідації3. Посилання на протокол валідації4. Матеріали/реактиви, що використовуються5. Аналітичне обладнання6. Процедура аналітичної методики (умови виконання аналізу, настройка

приладів, інформація про реактиви і стандартні зразки, верифікація - перевірка придатності аналітичної системи).

7. Розрахункові формули і статистичні процедури.

8. Результати валідації (висновки).

20

За результатами валідації оформлені та впроваджені такі документи: план проведення валідації (мастер-план); протокол валідації та звіт.Валідаційний план описує загальні положення і містить в собі всі валідаційні характеристики, що визначаються.

Зміст валідаційного протоколу

1.Загальні положення:

– мета, предмет, сфера застосування.

2. Відповідальність персоналу, які беруть участь в процесі.

3. Основні вимоги з безпеки.

4. Опис процедури

(найбільш об'ємний розділ)

5. Порядок реєстрації даних.

6. Порядок перегляду даної процедури.

ВИСНОВКИ

1. Вперше запропонована стандартизована процедура валідації методики кількісного визначення заліза методом атомно-абсорбційної спектрометрії із застосуванням калібрувального графіку в умовах аналітичних лабораторій.

2. Вперше розраховані критерії прийнятності метрологічних характеристик для методик кількісного визначення заліза методом атомно-абсорбційної спектрометрії з використанням калібрувального графіку.

3. Вперше обґрунтовані та створені підходи до проведення валідації методики, яка одночасно придатна для випробувань кількісного визначення та розчинення мікроелементів методом атомної абсорбції відповідно до найширшого діапазону застосування та більш критичних вимог до максимально припустимої невизначеності методики аналізу.

4. На основі розроблених підходів здійснена валідація методики кількісного визначення та розчинення мікроелементів у вітамінно-мінеральних препаратах методом атомно-абсорбційної спектрометрії із застосуванням калібрувального графіку.

21

ВИСНОВКИ (2)5. Визначені оптимальні хроматографічні умови і запропонований алгоритм

методик визначення водорозчинних вітамінів в градієнтному режимі і в ізократичному – жиророзчинних вітамінів.

6. Розроблені та апробовані селективні методики визначення вітамінів в складних багатокомпонентних вітамінно-мінеральних комплексах. Перевагою запропонованих методик є можливість одночасного якісного і кількісного контролю водо- і жиророзчинних вітамінів, відсутність складного алгоритму пробопідготовки, точність і селективність, низька вартість серійних аналізів.

7. Розроблена методика кількісного визначення у складному вітамінно-мінеральному комплексі аскорбінової кислоти методом титрування із застосуванням реактиву Тільманса.

8. Розроблені та відвалідовані методики включені до АНД на вітамінно-мінеральний препарат та захищені заявками на видачу патенту на винахід та корисну модель.

9. Результати валідації підтверджують, що методики відповідають своєму призначенню щодо визначення якості вітамінно-мінеральних комплексів.

22

Дякую за увагу!Дякую

за увагу!

23