¯Í«ÈÅÝ CTD - Pmda

2.6.4 薬物動態試験の概要文ソホスブビル

1

ソホスブビル

第 2 部 CTD の概要

2.6 非臨床試験の概要文及び概要表

2.6.4 薬物動態試験の概要文

ギリアド・サイエンシズ株式会社


2

目次頁

略号一覧表 ..................................................................................................................................................... 4 1 まとめ .................................................................................................................................................. 6 2 薬物動態学的薬物相互作用 .............................................................................................................. 8

2.1 トランスポーター阻害 ........................................................................................................... 8 2.2 トランスポーター基質 ........................................................................................................... 8 2.3 血漿タンパクとの結合置換 ................................................................................................... 9 2.4 組織との結合置換 ................................................................................................................. 10

3 考察及び結論 .................................................................................................................................... 12


3

表目次頁

表 1 非臨床薬物動態試験の要約 ......................................................................................................... 7 表 2 抗 HCV 薬によるアミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンの血漿タンパク結合

置換 ............................................................................................................................................... 10 表 3 10%ヒト心房組織ホモジネート中でのアミオダロン及びN-デスエチルアミオダロン

の結合に対する抗 HCV 薬の影響 ............................................................................................ 11 表 4 抗 HCV 薬によるアミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンのヒト心房組織との

結合置換 ....................................................................................................................................... 11


4

略号一覧表略号英語日本語

BCRP breast cancer resistance protein 乳癌耐性蛋白

BSA bovine serum albumin ウシ血清アルブミン

CHO Chinese hamster ovary チャイニーズハムスター卵巣

DAA direct acting anti-virals 直接作用型抗ウイルス薬

DCV daclatasvir（GS-432567）ダクラタスビル

DMSO dimethyl sulfoxide ジメチルスルホキシド

GLP Good Laboratory Practice 医薬品の安全性に関する非臨床試験

の実施の基準

HCV hepatitis C virus C 型肝炎ウイルス

IC50 concentration resulting in 50% inhibition 50%阻害濃度

LC-MS/MS high performance liquid

chromatography coupled to tandem mass

spectrometry

液体クロマトグラフィー・タンデム

質量分析法

LDV ledipasvir（GS-5885）レジパスビル

MDCKII Madin-Darbey canine kidney cells Madin-Darbey イヌ腎臓尿細管上皮細

胞

μM micromolar マイクロモル

nM nanomolar ナノモル

OATPxxx (1B1, 1B3) organic anion transporting polypeptide

xxx (1B1, 1B3)

有機アニオン輸送ポリペプチド

（1B1,1B3）

P-gp P-glycoprotein P 糖蛋白

PhA pheophorbide A フェオホルビド A

SD standard deviation 標準偏差

SMV simeprevir（GS-437727）シメプレビル

SOF sofosbuvir（GS-7977）ソホスブビル


5

注意事項本モジュールは、今回の承認事項一部変更承認申請を裏付ける情報を含む項のみで構成される。

したがって、提出すべき資料がない場合には、記載項目を設定していない。


6

1 まとめ

本文書は、本邦でのソバルディ®錠（ソホスブビル［SOF］、GS-7977）の効能追加のための承認

事項一部変更承認申請を裏付ける資料として提出するものである。ソホスブビルはヌクレオチド

誘導体非構造タンパク質（NS）5B ポリメラーゼ阻害薬であり、世界 70 ヵ国以上において他の薬

剤との併用投与により、成人 C 型慢性肝疾患の治療薬として承認されている。本邦においては、

リバビリンとの併用による 12 週間投与での、セログループ 2（ジェノタイプ 2）の C 型慢性肝炎

又は C 型代償性肝硬変におけるウイルス血症の改善の適応を有する。これまでに実施されたソホスブビルの包括的な非臨床プログラムについては、初回申請時に提

出した。本薬物動態試験の概要文は、ソホスブビルの初回申請時以降に得られた、ソホスブビル

の非臨床薬物動態試験の結果を示す。これらの試験の要約を表 1 に示す。ソホスブビル及びアミオダロンと他剤との薬物相互作用の可能性を評価するために、in vitro で

のトランスポーター試験、並びに血漿タンパク及び組織との結合置換試験を行った。その結果、

アミオダロン及びその代謝物である N-デスエチルアミオダロンは排出トランスポーター（P 糖蛋

白［P-gp］、乳癌耐性蛋白［BCRP］）及び肝取り込みトランスポーター（有機アニオン輸送ポリペ

プチド 1B1 及び 1B3［OATP1B1、OATP1B3］）の弱い阻害薬であることが示された。また、N-デスエチルアミオダロンは排出トランスポーター（P-gp、BCRP）を介して排出されることが確認さ

れた一方、アミオダロンはこれらの排出トランスポーターの基質ではなく、また、アミオダロン

及び N-デスエチルアミオダロンはいずれも OATP1B1 及び OATP1B3 の基質でなかった。したが

って、アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンがこれらのトランスポーターを介した薬物相

互作用により影響を受ける又は影響を及ぼす可能性は低いことが示された。また、ソホスブビル

及びそのヌクレオシド代謝物 GS-331007 を含む種々の抗 HCV 薬は、in vitro でのアミオダロン及

び N-デスエチルアミオダロンのヒト血漿タンパク及び心房組織との結合に対して、いくつかの条

件下でわずかに影響を及ぼしたが、その意義については明確でなかった。これらの結果から、ア

ミオダロン及びソホスブビルが、排出トランスポーターや肝取り込みトランスポーター、又は血

漿タンパク及び心房組織との結合置換を介して薬物相互作用を起こす可能性は低いと考えられる。


7

表 1 非臨床薬物動態試験の要約試験の種類試験系経路 GLP 被験物質試験番号

薬物動態学的薬物相互作用

トランスポーター阻害 In vitro In vitro N アミオダロン

N-デスエチルアミ

オダロン

AD-334-2028

[CTD 4.2.2.6.1]

トランスポーター基質 In vitro In vitro N アミオダロン

N-デスエチルアミ

オダロン

AD-334-2029

[CTD 4.2.2.6.2]

血漿タンパク結合置換 In vitro In vitro N ソホスブビル

GS-331007

AD-334-2030

[CTD 4.2.2.6.3]

組織との結合置換 In vitro In vitro N ソホスブビル

GS-331007

AD-334-2033

[CTD 4.2.2.6.4]


8

2 薬物動態学的薬物相互作用

2.1 トランスポーター阻害

● （試験番号 AD-334-2028、CTD 4.2.2.6.1、評価資料） ATP 結合カセット（ABC）排出トランスポーターである P-gp 及び BCRP、並びに溶質輸送体（SLC）

吸収トランスポーターである OATP1B1 及び OATP1B3 に対する、アミオダロン及びその代謝物

N-デスエチルアミオダロンの阻害能について、個々のトランスポーター及び蛍光モデル基質を遺

伝子導入した細胞株を用いて検討した（試験番号 AD-334-2028）。P-gp 及び BCRP の試験には

Madin-Darbey イヌ腎臓尿細管上皮細胞（MDCKII）を用い、OATP1B1 及び OATP1B3 の試験には

チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を用いた。アミオダロン（0.16～40 μM）及び N-デスエチルアミオダロン（0.08～20 μM）の各 6 濃度を用

いて、P-gp を介したカルセイン-AM の排出及び BCRP を介したフェオホルビド A（PhA）の排出

の用量依存的な阻害について検討した。P-gp アッセイでは、励起波長 494 nm、蛍光波長 517 nmでカルセイン蛍光を測定し、BCRP アッセイでは、励起波長 415 nm、蛍光波長 675 nm で PhA 蛍

光を測定した。OATP1B1 及び OATP1B3 を介した Fluo-3 輸送の用量依存的な阻害については、ア

ミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンの各 6 濃度（0.03～20 μM）を用いて検討した。アミオダロンは、P-gp 及び BCRP を介した輸送を一般的な非毒性濃度においてそれぞれ 33%及

び17%阻害した（IC50値 >13 μM）。N-デスエチルアミオダロンはP-gpを阻害し（IC50値11 ± 1.8 μM）、

BCRP を介した輸送を一般的な非毒性濃度において約 5%阻害した（IC50 値 > 6.7 μM）。OATP1B1及び OATP1B3 を介した輸送に関しては、アミオダロンは弱い阻害作用を示し、検討した最大濃

度（20 μM）でそれぞれを 57%及び 21%阻害した。N-デスエチルアミオダロンは OATP1B1 及び

OATP1B3 への用量依存的な阻害を示さなかった（IC50 値 > 20 μM）。これらの結果を CTD 2.6.5、2.1 項に示す。

2.2 トランスポーター基質

● （試験番号 AD-334-2029、CTD 4.2.2.6.2、評価資料）アミオダロン及びその代謝物 N-デスエチルアミオダロンが ABC 排出トランスポーターである

P-gp 及び BCRP、並びに SLC 吸収トランスポーターである OATP1B1 及び OATP1B3 の基質であ

る可能性について、個々のトランスポーターを遺伝子導入した細胞株を用いて検討した（試験番

号 AD-334-2029）。P-gp 及び BCRP の試験には野生型及び遺伝子導入した MDCKII 細胞を用い、

OATP1B1 及び OATP1B3 試験には CHO 細胞を用いた。アミオダロン及びその代謝物のP-gp及びBCRPに対する双方向性の経単層膜輸送能試験におい

ては、回収率が低かったこと及び半透膜との会合が認められたことにより、結論は得られなかっ

た。そこで、トランスポーターの過剰発現が細胞内蓄積に及ぼす影響を調べるために、オイルス

ピン法を用いた試験を実施した。その結果、アミオダロンの蓄積は、多剤耐性タンパク質（MDR1）発現 MDCKII 及び BCRP 発現 MDCKII 細胞内において野生型 MDCKII 細胞内と同程度であった

ことから、アミオダロンは P-gp 又は BCRP の基質ではないことが示された。N-デスエチルアミオ

ダロンについては、遺伝子導入細胞内での蓄積が P-gp 阻害薬に反応して減少したことから、P-gp


9

を介して排出されることが示された。既知の BCRP 阻害薬によってもこの作用は影響を受けなか

ったが、BCRP を過剰発現させた細胞における N-デスエチルアミオダロンの蓄積が減少したこと

から、N-デスエチルアミオダロンが BCRP の基質でもある可能性が一部示唆されたが、アミオダ

ロン及びN-デスエチルアミオダロンはOATP1B1又はOATP1B3の基質ではないことが示された。

両化合物は、緩衝液のみ及び 4% ウシ血清アルブミン（BSA）の添加条件下で、遺伝子導入して

いない CHO 細胞、並びに OATP1B1 及び OATP1B3 を過剰発現させた CHO 細胞への高い取り込

み率を示した。既知の OATP 阻害薬であるリファンピシンの添加によっても、取り込み率に大き

な影響はみられなかった。これらの結果を CTD 2.6.5、2.2 項に示す。

2.3 血漿タンパクとの結合置換

● （試験番号 AD-334-2030、CTD 4.2.2.6.3、評価資料）ソホスブビル及び他の HCV 直接作用型抗ウイルス薬（DAA）がアミオダロン及びその代謝物

N-デスエチルアミオダロンの血漿タンパク結合置換に与える影響について平衡透析法を用いて評

価した。 100%又は 50%ヒト血漿を用いて、37ºC で 24 及び 30 時間インキュベートした後のアミオダロ

ン及び N-デスエチルアミオダロンの血漿タンパク結合率を平衡透析法により測定し、このデータ

に基づき、50%ヒト血漿を用いた 24 時間インキュベーションによる血漿タンパク結合置換試験を

行った。10 μM アミオダロン及び 10 μM N-デスエチルアミオダロン存在下で、50%ヒト血漿とと

もに 37°C で 24 時間、平衡透析を行い、その後、抗 HCV 薬を添加して最終濃度 10 μM とし、透

析をさらに 1 時間実施した。得られた検体を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法

（LC-MS/MS）により分析した。 50%ヒト血漿を用いた 24 時間平衡透析後の遊離分画はアミオダロンが 0.039%、N-デスエチル

アミオダロンが 0.19%であった。抗 HCV 薬であるソホスブビル、そのヌクレオシド代謝物

GS-331007、レジパスビル、ダクラタスビル及びシメプレビルによる置換試験を行った結果、検

討した化合物のいずれにおいても、アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンの遊離分画に大

きな変化はなかった。これらの結果を CTD 2.6.5、2.3 項及び表 2 に示す。


10

表 2 抗 HCV 薬によるアミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンの血漿タンパク結合置換

Assay Conditions

Amiodarone

Free Fraction (%)

N-Desethylamiodarone

Free Fraction (%)

Preincubation conditions Interacting agent Replicate 1 Replicate 2 Replicate 1 Replicate 2

Co-incubation of 10 μM

Amiodarone +

10 μM

N-desethylamiodarone for

24 hours

Preincubation only 0.03 0.05 0.28 0.20

DMSO 0.04 0.05 0.21 0.20

10 μM SOF 0.05 0.05 0.24 0.21

10 μM GS-331007 0.04 0.05 0.23 0.19

10 μM LDV 0.03 0.03 0.13 0.19

10 μM DCV 0.05 0.06 0.24 0.26

10 μM SMV 0.04 0.05 0.28 0.24 DCV = daclatasvir, DMSO = dimethyl sulfoxide, LDV = ledipasvir, SMV = simeprevir, SOF = sofosbuvir Source: AD-334-2030

2.4 組織との結合置換

● （試験番号 AD-334-2033、CTD 4.2.2.6.4、評価資料）ソホスブビル及びその他のHCV DAAがアミオダロン及びその代謝物N-デスエチルアミオダロ

ンの心房組織との結合置換に与える影響について平衡透析法を用いて評価した。 10%（w/v）ヒト心房組織ホモジネートを用いて 20 μM アミオダロン及び 20 μM N-デスエチル

アミオダロンの混合物を、個々の抗 HCV 薬（10 μM）又はジメチルスルホキシド（DMSO、1%, v/v）存在下で、37°C で 6 時間平衡透析し、抗 HCV 薬がアミオダロン及び N-デスエチルアミオダロン

のヒト心房組織との結合に及ぼす影響について評価した。また、アミオダロン及び N-デスエチル

アミオダロンのヒト心房組織との結合置換試験を行った。10%ヒト心房組織ホモジネートととも

に 20 μM アミオダロン及び 20 μM N-デスエチルアミオダロンを 37°C で 6 時間、透析を行った後、

抗 HCV 薬を添加して、最終濃度 10 μM とし、透析をさらに 1 時間実施した。得られた検体を

LC-MS/MS 法により分析した。両試験ともに、検討した化合物のいずれも、アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンの遊

離分画に大きな影響を及ぼさなかった。これらの結果を CTD 2.6.5、2.4 項、表 3 及び表 4 に示

す。


11

表 3 10%ヒト心房組織ホモジネート中でのアミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンの

結合に対する抗 HCV 薬の影響

Assay Conditions

Free Fractiona (%) (mean ± SD, n = 3)

Amiodarone N-Desethylamiodarone

None 0.0005 ± 0.0001 0.0010 ± 0.0002

1% DMSO (v/v) 0.0007 ± 0.0003 0.0012 ± 0.0007

10 μM SOF 0.0008 ± 0.0004 0.0010 ± 0.0002

10 μM GS-331007 0.0004 ± 0.0001 0.0011 ± 0.0004

10 μM LDV 0.0007 ± 0.0001 0.0010 ± 0.0001

10 μM DCV 0.0008 ± 0.0003 0.0011 ± 0.0002

10 μM SMV 0.0008 ± 0.0003 0.0010 ± 0.0003 DCV = daclatasvir, DMSO = dimethyl sulfoxide, LDV = ledipasvir, SMV = simeprevir, SOF = sofosbuvir a Free fraction in 100% tissue calculated from free fraction in 10% (w/v) homogenate Source: AD-334-2033

表 4 抗 HCV 薬によるアミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンのヒト心房組織との結合

置換 Assay Conditions Free Fractiona (%) (mean ± SD, n = 3)

Preincubation conditions Interacting agent Amiodarone N-Desethylamiodarone

Co-incubation of 20 μM

Amiodarone + 20 μM

N-desethylamiodarone for

6 hours

Preincubation only 0.0005 ± 0.0001 0.0010 ± 0.0002

DMSO 0.0015 ± 0.0003 0.0017 ± 0.0009

10 μM SOF 0.0019 ± 0.0003 0.0012 ± 0.0004

10 μM GS-331007 0.0016 ± 0.0003 0.0009 ± 0.0001

10 μM LDV 0.0016 ± 0.0005 0.0014 ± 0.0005

10 μM DCV 0.0015 ± 0.0008 0.0012 ± 0.0005

10 μM SMV 0.0012 ± 0.0001 0.0009 ± 0.0002 DCV = daclatasvir, DMSO = dimethyl sulfoxide, LDV = ledipasvir, SMV = simeprevir, SOF = sofosbuvir a Free fraction in 100% tissue calculated from free fraction in 10% (w/v) homogenate Source: AD-334-2033


12

3 考察及び結論

In vitro トランスポーター試験の結果、アミオダロン及びその代謝物である N-デスエチルアミオ

ダロンは排出トランスポーター（P-gp、BCRP）及び肝取り込みトランスポーター（OATP1B1、OATP1B3）の弱い阻害薬であることが示された（試験番号 AD-334-2028）。N-デスエチルアミオ

ダロンは排出トランスポーター（P-gp、BCRP）を介して排出されることが確認された一方、アミ

オダロンはこれらの排出トランスポーターの基質ではなく、また、アミオダロン及び N-デスエチ

ルアミオダロンはいずれも OATP1B1 及び OATP1B3 の基質でなかった（試験番号 AD-334-2029）。したがって、アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンが、これらのトランスポーターを介し

た薬物相互作用により影響を受ける又は影響を及ぼす可能性は低い。技術的に難易度が高かったものの、アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンのヒト血漿タ

ンパク及び心房組織との結合置換を平衡透析法により評価した（試験番号 AD-334-2030、AD-334-2033）。アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンはいずれも血漿タンパク及び心房組

織に極めて強く結合（> 99%）した。これらの結合に対する HCV DAA の影響がいくつかの条件

下でわずかに認められたが、その意義については明確でなく、HCV DAA が血漿タンパク及び心

房組織との結合置換を介してアミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンの濃度を一過性に変

化させる可能性について明確なエビデンスは得られなかったことから、その可能性は低いと考え

られる。結論として、アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンの組織結合性は極めて高く、結果的

には、in vitro でタンパク結合置換を検討することは困難と考えられた。したがって、in vitro トラ

ンスポーター試験では、アミオダロンと HCV DAA との薬物相互作用の可能性について特定する

ことはできなかった。

2.6.5 薬物動態試験概要表ソホスブビル

1

ソホスブビル

第 2 部 CTD の概要

2.6 非臨床試験の概要文及び概要表

2.6.5 薬物動態試験概要表

ギリアド・サイエンシズ株式会社


2

目次頁

1 薬物動態試験：一覧表 ...................................................................................................................... 4 2 薬物動態試験：薬物相互作用 .......................................................................................................... 5

2.1 試験番号 AD-334-2028：アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンによるトラ

ンスポーター（ヒト P-gp、BCRP、OATP1B1、OATP1B3）の阻害能：In vitro ............ 5 2.2 試験番号 AD-334-2029：アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンのトランス

ポーター（ヒト P-gp、BCRP、OATP1B1、OATP1B3）による輸送能：In vitro............ 7 2.3 試験番号 AD-334-2030：アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンの血漿タン

パクとの結合置換：In vitro ................................................................................................. 10 2.4 試験番号 AD-334-2033：アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンのヒト心房

組織との結合置換：In vitro ................................................................................................. 12


3

注意事項本モジュールは、今回の承認事項一部変更承認申請を裏付ける情報を含む項のみで構成される。

したがって、提出すべき資料がない場合には、記載項目を設定していない。


4

1 薬物動態試験：一覧表

Test Article: Amiodarone and N-desethylamiodarone

Type of Study/Description GLPa Test System Method of

Administration Testing Facility Gilead Study No. (CRO Study No.)

Pharmacokinetic Drug Interactions

Transporter Transfected Cells Inhibition

No Human P-gp- or BCRP-overexpressing MDCKII cells and human OATP1B1- or

OATP1B3-overexpressing CHO cells

In Vitro Gilead Sciences, Inc. AD-334-2028 [CTD 4.2.2.6.1]

Transporter Transfected Cells Substrate

No Human P-gp- or BCRP-overexpressing MDCKII cells and human OATP1B1- or

OATP1B3-overexpressing CHO cells


Plasma Protein Binding Displacement No Human plasma In Vitro Gilead Sciences, Inc. AD-334-2030 [CTD 4.2.2.6.3]

Cardiac Atrial Tissue Binding Displacement

No Human cardiac atrial tissue homogenate


a An entry of "Yes" indicates that the study includes a GLP compliance statement.


5

2 薬物動態試験：薬物相互作用

2.1 試験番号 AD-334-2028：アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンによるトランスポーター（ヒト P-gp、BCRP、OATP1B1、OATP1B3）の阻害能：In vitro


Study No. AD-334-2028 Location in CTD: 4.2.2.6.1

Type of Study: Drug-drug interaction

Method: For the P-gp assay, amiodarone, N-desethylamiodarone, or a positive control (verapamil) was incubated for 1 hr with MDCKII cells in a medium containing 10 μM calcein AM in 96-well black cell culture plates with clear bottoms at a density of 5 x 104 cells/well. Following incubation and washing, the cells were lysed and each well was analyzed for calcein fluorescence at an excitation of 494 nm and an emission of 517 nm. For BCRP assay, amiodarone, N-desethylamiodarone, or a positive control (Fumitremorgin C (FTC)) was incubated for 18 hr with MDCKII-BCRP cells in a medium containing 1 μM pheophorbide a (PhA) in 96-well black cell culture plates with clear bottoms at a density of 2 x 104 cells/well. Following incubation and washing, the cells were lysed and each well was analyzed for PhA fluorescence at an excitation of 415 nm and an emission of 675 nm. The inhibition of the Solute Carrier influx transporters organic anion transporting polypeptides 1B1 and 1B3 (OATP1B1 and OATP1B3) by amiodarone and N-desethylamiodarone was assessed in vitro using Chinese hamster ovary cells transfected with the individual human transporters in 96 well black cell culture plates with clear bottoms at a density of 1 x 105 cells/well. Fluo-3 (2 μM) was the substrate and rifampicin was the positive control inhibitor. Wells were analyzed for Fluo-3 fluorescence at an excitation of 485 nm and emission of 530 nm.

Test Article Transporters IC50 (μM) % Inhibition at the highest non-cytotoxic concentration

Amiodarone

P-gp > 13 33 (13 μM)

BCRP > 13 17 (13 μM)

OATP1B1 19 57 (20 μM)

OATP1B3 > 20 21 (20 μM)


6




Test Article Transporters IC50 (μM) % Inhibition at the highest non-cytotoxic concentration

N-desethyamiodarone

P-gp 11 66 (20 μM)

BCRP > 6.7 4.9 (6.7 μM)

OATP1B1 > 20 No inhibition (20 μM)

OATP1B3 > 20 No inhibition (20 μM) BCRP = breast cancer resistance protein; OATP = organic anion-transporting polypeptide; P-gp = P-glycoprotein


7

2.2 試験番号AD-334-2029：アミオダロン及びN-デスエチルアミオダロンのトランスポーター（ヒトP-gp、BCRP、OATP1B1、OATP1B3）による輸送能：In vitro




Method: MDCKII cells were resuspended at 2 x 106 cells per mL and 0.5 μM of amiodarone/N-desethylamiodarone or 10 μM prazosin was dosed in presence or absence of various inhibitors. The cells were incubated for 60 minutes at 37 ºC and washed with ice-cold phosphate buffered saline. Cells were overlaid onto microcentrifuge tubes containing 100 μL of aqueous solution and100 μL of filtration oil (74.5:25.5 silicon oil:mineral oil mix) and centrifuged at 13,000 g for 30 sec. The samples were kept at -80ºC for 1 hour. The bottom layer was collected and samples were extracted with organic solvents for analysis by LC-MS/MS.

Test Article Cell Type Cellular Accumulation (pmol/million cells)

None +100 μM Verapamil +10 μM CsA + Verapamil and CsA

0.5 μM Amiodarone MDCKII-WT 29.3 20.9 28.9 26.4

MDCKII-MDR1 27.4 24.0 32.2 35.3

0.5 μM N-desethyamiodarone

MDCKII-WT 58.1 42.9 55.7 54.5

MDCKII-MDR1 34.6 33.0 47.2 49.4

10 μM Prazosin MDCKII-WT 4.80 5.05 6.50 7.30

MDCKII-MDR1 0.56 4.36 5.78 5.20


8




Test Article Cell Type Cellular Accumulation (pmol/million cells)

None +10 μM FTC +2 μM Ko143 +10 μM CsA

0.5 μM Amiodarone MDCKII-WT 21.8 28.9 31.6 28.8

MDCKII-MDR1 29.6 30.9 34.0 36.9

0.5 μM N-desethyamiodarone

MDCKII-WT 44.8 36.8 33.1 51.9

MDCKII-MDR1 27.7 27.8 30.3 33.3

10 μM Prazosin MDCKII-WT 11.4 14.9 12.4 14.6

MDCKII-MDR1 2.6 8.9 11.6 14.4 Experiments done in triplicate for amiodarone and N-desethylamiodarone and duplicate for prazosin; CsA = cyclosporin A; FTC = fumitremorgin C


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Method:

Chinese hamster ovary (CHO) cells, either wild type or transfected with the genes encoding human OATP1B1 and OATP1B3, were resuspended in 37 ºC assay buffer at 2 x 106 cells/mL and 100 μL of the cell suspension was aliquotted to each well on a 48 well plate for a 30 min pre-incubation at 37 ºC. The assay was started by adding 50 μL of 3x test compound solution to the 48-well plate containing cell suspension, mixed and incubated at 37ºC for 1 min. The entire reaction mixture was overlaid onto microcentrifuge tubes containing 100 μL of aqueous layer and 100 μL of filtration oil (74.5:25.5 silicon oil:mineral oil mix) and then centrifuged at 13,000 g for 30 sec. The samples were allowed to sit at room temperature for 2 hr and then put on dry ice for 1 hr or into -80ºC freezer overnight. The cell lysate was collected in a tube and samples were extracted with organic solvents for analysis by LC-MS/MS.

Test Article Inhibitor Uptake Rate (pmol/minute/million cells)

CHO-WT CHO-OATP1B1 CHO-OATP1B3

0.5 μM Amiodarone None 69 61 49

40 μM Rifampicin 55 52 41

0.5 μM N-desethyamiodarone None 221 223 194


0.5 μM Amiodarone + 4%BSA

None 27 28 24


0.5 μM N-desethyamiodarone + 4%BSA

None 128 116 110


0.1 μM Atorvastatin + 4%BSA

None 0.021 0.29 0.26

40 μM Rifampicin 0.020 0.028 0.024 Experiments done in triplicate; BSA = bovine serum albumin; CHO = Chinese hamster ovary; OATP = organic anion-transporting polypeptide


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2.3 試験番号 AD-334-2030：アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンの血漿タンパクとの結合置換：In vitro




Methods: Plasma protein binding of amiodarone and N-desethylamiodarone was determined by equilibrium dialysis following 24 and 30 hr incubation at 37 ºC using either 100% or 50% human plasma. Based on this data, the following displacement experiments were performed using 50% human plasma with 24 hr incubation. First, 10 μM amiodarone and 10 μM N-desethyamiodarone were subject to equilibrium dialysis with 50% human plasma for 24 hours. After this period, anti-HCV agents were added and the dialysis continued for 1 h. Samples were analyzed by LC-MS/MS.

Treatment Free Fraction (%) (mean, n = 2)

Amiodarone N-desethylamiodarone

Human plasma 24 h 0.028 —

30 h 0.042 —

50% Human plasma 24 h 0.039 0.19

30 h 0.035 0.22


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Assay Conditions Amiodarone Free Fraction (%) N-desethylamiodarone Free Fraction (%)

Preincubation conditions Interacting agent Replicate 1 Replicate 2 Replicate 1 Replicate 2

Co-incubation of 10 μM Amiodarone + 10 μM N-desethyamiodarone for 24 hours

Preincubation only 0.03 0.05 0.28 0.20

DMSO 0.04 0.05 0.21 0.20

10 μM Sofosbuvir 0.05 0.05 0.24 0.21

10 μM GS-331007 0.04 0.05 0.23 0.19

10 μM Ledipasvir 0.03 0.03 0.13 0.19

10 μM Daclatasvir 0.05 0.06 0.24 0.26

10 μM Simeprevir 0.04 0.05 0.28 0.24


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2.4 試験番号 AD-334-2033：アミオダロン及び N-デスエチルアミオダロンのヒト心房組織との結合置換：In vitro



Methods: Human cardiac atrial binding of amiodarone and N-desethylamiodarone was determined by equilibrium dialysis following 6 hr incubation at 37 ºC using 10% (w/v) human atrium tissue homogenate. The individual anti-HCV agent (10 μM) or DMSO (1%, v/v) were tested with a mixture of 20 μM amiodarone and 20 μM N-desethyamiodarone in 10% (w/v) human atrium tissue homogenate. Samples were analyzed by LC-MS/MS.

Assay Conditions Free Fractiona (%) (mean, n = 3)

Amiodarone N-desethylamiodarone

None 0.0005 ± 0.0001 0.0010 ± 0.0002

1% DMSO (v/v) 0.0007 ± 0.0003 0.0012 ± 0.0007

10 μM Sofosbuvir 0.0008 ± 0.0004 0.0010 ± 0.0002

10 μM GS-331007 0.0004 ± 0.0001 0.0011 ± 0.0004

10 μM Ledipasvir 0.0007 ± 0.0001 0.0010 ± 0.0001

10 μM Daclatasvir 0.0008 ± 0.0003 0.0011 ± 0.0002

10 μM Simeprevir 0.0008 ± 0.0003 0.0010 ± 0.0003 a Free fraction in 100% tissue calculated from free fraction in 10% (w/v) homogenate


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Methods: Human cardiac atrial tissue binding displacement experiments were performed using 10% (w/v) human atrium tissue homogenate. First, 20 μM amiodarone and 20 μM N-desethyamiodarone were subject to equilibrium dialysis with 10% (w/v) human atrium tissue homogenate for 6 hours. After this period, anti-HCV agents (10 μM) were added and the dialysis continued for 1 h. Samples were analyzed by LC-MS/MS.

Assay Conditions Free Fractiona (%) (mean ± SD, n = 3)

Preincubation conditions Interacting agent Amiodarone N-desethylamiodarone

Co-incubation of 20 μM Amiodarone + 20 μM N-desethyamiodarone for 6 hours

Preincubation only 0.0005 ± 0.0001 0.0010 ± 0.0002

DMSO 0.0015 ± 0.0003 0.0017 ± 0.0009

10 μM Sofosbuvir 0.0019 ± 0.0003 0.0012 ± 0.0004

10 μM GS-331007 0.0016 ± 0.0003 0.0009 ± 0.0001

10 μM Ledipasvir 0.0016 ± 0.0005 0.0014 ± 0.0005

10 μM Daclatasvir 0.0015 ± 0.0008 0.0012 ± 0.0005

10 μM Simeprevir 0.0012 ± 0.0001 0.0009 ± 0.0002 a Free fraction in 100% tissue calculated from free fraction in 10% (w/v) homogenate

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