Einführung Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen Grundlagen Kryokonservierung Der Einfriervorgang Kryoprotektiva: „Frostschutzmittel“

Kryokonservierung humaner embryonaler

Stammzellen

SABT1 Masterstudiengang Biotechnologie

Hanna Lorig

Betreuerin: Julia Schulz (Fraunhofer IBMT)

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Überblick

Einführung Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen

Grundlagen Kryokonservierung Der Einfriervorgang Kryoprotektiva: „Frostschutzmittel“ Kryobanken: Lagerung der Zellen

Kryokonservierung von hESC Fallbeispiele Probleme

Ausblick

28.01.2011Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

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Einführung


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Stammzellen I

Embryonale Stammzellen (ESC) [1]

Besitzen mindestens zwei Eigenschaften:1. self renewal durch asymmetrische Zellteilung2. Pluripotenz

Fähigkeit, sich in alle Zellen der drei Keimblätter zu differenzieren (Ecto-, Endo- und Mesoderm)

Entdeckung murine ESC (1981), humane ESC (1998), Induzierte pluripotente Stammzellen (IPS) (2006/07)[2]

Gewinnung aus der inneren Zellmasse von Blastozysten

Regulierung der Forschung in Deutschland über das Embryonenschutzgesetz


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Stammzellen II

Adulte Stammzellen im Allgemeinen geringeres

Selbsterneuerungsvermögen eingeschränktes Differenzierungspotential

(Multipotenz) Während der gesamten Lebensdauer zu finden, v.a. in

Organen wie Knochenmark, Haut, Leber, Nabelschnur(blut), etc.

IPS – Induzierte pluripotente Stammzellen Adulte Stammzellen, die durch Reprogrammierung in

pluripotente Stammzellen umgewandelt wurden bis dato ist die absolute Übereinstimmung mit ESC nicht

eindeutig bestimmt28.01.2011Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

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Stammzellen III

28.01.2011Abb. 1: Überblick IPS/ Differenzierung [15]

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Gewinnung & Kultivierung ESC

Gewinnung aus der inneren Zellmasse der Blastozyste› Zerstörung der Trophoblasten

durch Laserstrahl/Antikörper

Kultivierung [3]:› Feederzellen Monolayer

(inaktivierte murine embryonale Fibroblasten)

› Koloniewachstum -> 3D Struktur


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Forschungsziele

Grundlagenforschung der molekularen Mechanismen (z.B. Differenzierung)

Klinische Forschung› Zell- und Gewebeersatz› Immunsystemaufbau (HIV)

Krankheits- und Patientenspezifische Behandlung

Zellmodell für toxikologische/ pharmakologische Untersuchungen

Lagerung und Bereitstellung von hESC


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Kryokonservierung


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Grundlagen

Verfahren für das Lagern (Einfrieren) von Zellen in lN2

Der Einfrierprozess Langsames vs. schnelles Einfrieren Zellschäden durch extra- und intrazelluläre

Eisbildung

Kryoprotektiva als Frostschutz (im)permeable Substanzen

Lagerung der Zellen in Kryobanken Vorschriften, Handling und Qualitätskontrolle


[16]

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Der Einfriervorgang

Zwei Einfriergeschwindigkeiten:

1. Langsam (Kristallisation)Wässrige Lösung gefriert unter Phasentrennung, wobei es zur Aufkonzentration der gelösten Stoffe kommt (Gefrierkonzentration) Eutektisches Verhalten

2. Schnell (Vitrifikation)a. Extrem schnelle Abkühlung, die zur sog. Glasbildung führt

z.B. direkter Kontakt mit lN2

Übersättigte Lösung

b. unkontrolliertes Einfrieren


Abb. 3: kristalline Mannitstruktur (links), amorphe Saccharosestruktur (rechts) [3]

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Kristallisation

Verhalten von Zellsuspensionen bei kristallinem Eis

dendritisches Wachstum der extrazellulärenWasserphase der Lösung Schädigungen der Zellen v.a. durch extrazelluläre Effekte


Extrazelluläre Schäden

Zelldeformationen aufgrund der Zelldichte in interdentritischen Kanälen

Mechanisch bedingte Schäden aufgrund von Zellschrumpfen

Osmotisch bedingte Schäden (solutions effects)

Membranporenbildung

[14]

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Vitrifikation

Zelleffekte bei Vitrifikation

Schnelles Abkühlen führt zu intrazellulärer Eisbildung (flash out Effekt)® Schädigungen der Zellen durch intrazelluläre Eisbildung

aufgrund von ice seeding durch Membranporen

Zwei-Faktor-Hypothese (Mazur et al.) [6]:


Abb. 4: Schema der 2-Faktor Hypthese von Mazur

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Kryoprotektiva

Stoffe, die positive Effekte auf die Überlebensrate während des Einfrieren ausüben Verbreiterung des optimalen Kühlratenbereichs


Permeable Stoffe Impermeable Stoffe

Kolligative Effekte Nicht-kolligative Effekte

Reduktion der Elektrolytkonzen-tration während des Einfrierens

Umstrukturierung der Wassermo-leküle

Verringerung der solution effects

Stabilisierung der Membranen und Proteine -> intrazelluläre Eisvermeidung

Toxisch in hohen Konzentrationen und bei RT

Im Allgemeinen geringere Wirkung

DMSO, Glycerin, Methanol Trehalose, Hydroxyethylstärke

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Kryobanken

Internationaler Forschungsfortschritt bedingt die Registrierung, Lagerung und Verwaltung von biologischem Material (UK Stem Cell Bank, HUES, …)

Ziel: metabolisch inaktiver Zustand, der Langzeitstabilität garantiert

Verschiedene Möglichkeiten der Konservierung [7]:


Material Lagerung Lagerzeit

versch. Bakterien, Hefen, Pilze

Gefriertrocknung 5 – 35 Jahre

Pflanzensamen lN2 > 10 Jahre

Stammzellen lN2 15 Jahre

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Kryokonservierungvon hESC


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Vorbereitung mechanische Dissoziation in Klumpen von 50-200

Zellen› Enzymatisches Ablösen der Zellen (hESC zusammen mit

Feederzellen)

10 – 20 Zellklumpen pro Kryosubstrat

Auswahl der geeigneten Abkühlrate

Resuspension der Zellen in geeignetem Kryomedium


[17][18]

18

Kryoprotokolle

1. Kontrolliertes EinfrierenProbe wird mithilfe eines Einfrierautomaten kontrolliert eingefroren

› Kühlrate variierbar› Schrittweises Abkühlen möglich› Reproduzierbare Protokolle

2. Unkontrolliertes EinfrierenProbe wird direkt in Gefrierschrank/ lN2 überführt

VitrifikationProbe wird direkt in LN2 gefroren


Controlled-rate freezing of hESC [8]

Kryomedium: 90% Kulturmedium + 10 % DMSOKryosubstrat: 0,25 ml Cassou StrawKontrolle: I) ohne Kryokonservierung (Probe A)

II) unkontrolliertes Einfrieren bei -80 °C (Probe B)

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Schritt

Probe Prozedur Zeit [min]

1 alle Äquilibrierung der Zellen in Kryomedium 15

2 alle Einfrieren bei -10 °C 1

3 D – F Ice seeding 5

4 C + D Abkühlen auf -33 °C 1 °C / min

4 E Abkühlen auf -33 °C 1,8 °C/ min

4 F Abkühlen auf -33 °C 2,7 °C /min

5 C - F Überführung in lN2 > 5 min

6 C - F Auftauen bei Raumtemperatur (RT)

Fall 1: Medium + 10 %DMSO

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Fall 1: Medium + 10 %DMSO

Vitalität

Kontrolliertes Einfrieren mit Ice seeding optimal Höhere Einfrierraten wirken sich negativ auf die Vitalität aus


Probe Einfrierrate Vitailität

Kontrolle (A) - 100 %

Kontrolle (B) direkt bei -80 °C 1 % ± 0,6

C 1 ° C / min 3,0 % ± 2,0

D (seeding) 1 °C / min 79 % ± 15

E (seeding) 1,8 °C / min 65 % ± 20

F (seeding) 2,7 °C / min 20 % ± 10

Improved cryopreservation of hESC with trehalose [4]

Kryomedium: 90% Knockout serum replacement + 10 % DMSO + 0,2 mol/ l Trehalose

Kryosubstrat: 0,5 ml Kryovial

Kühlrate: 1 °C / min auf – 80 °C, nach 12 h in lN2

Kontrolle: 90% Knockout serum replacement + 10 % DMSO

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Fall 2: Medium + Trehalose

Probe Kryomedium Auftaumedium

Kontrolle (A) - -

B mit Trehalose -

C - mit Trehalose

D mit Trehalose mit Trehalose

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Fall 2: Medium + Trehalose

Differenzierungsstatus:

n = 75 Kolonien Jüngere Passagen erholen sich besser nach der

Kryokonservierung


Prob

e

Undifferenzierte Kolonien [%]Passage 28

Undifferenzierte Kolonien [%]

Passage 38

A 16 13

B 41 35

C 43 44

D 51 45

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Problematik

3D-Struktur der hESC› Temperatur- & Kryoprotektivumgradienten› Verlust der Pluripotenz nach dem Auftauen› Dissoziation der Zellklumpen kann zu Zelltod führen› Zell-Zellkontakt unterbrochen durch extrazelluläre Eisbildung

Kryoprotektiva› Spezifische Auswahl wichtig› Toxizität bei Raumtemperatur

Proben & Arbeitsweisen› Verschiedene Zelllinien & Passagen› Unterschiedliche Handhabung der Kryokonservierung

die opt imale Kryokonservierung ist von vie len Faktoren abhängig


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Ausblick

hESC besitzen großes Potential als Forschungsobjekt:

› regenerative Medizin› Grundlagenforschung in der Embryonalentwicklung› Individuelles Testsystem für Pharmazeutika

Forschung nach besseren Kryoprotektiva ist weiterhin von großer Bedeutung

Kryokonserv ierung is t e in v ie lversprechender , aber te i lwe ise noch

unausgere i f ter Ansatz für d ie Lagerung b io log ischer Proben


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Dankeschön für die Aufmerksamkeit!


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Quellen[1]: Human embryonic stem cells, Pera M.F., Reubinoff B., Trounson A., J. Cell. Sci., 2007,

113: 5-10[2]: Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors,

Takahashi K. et al., Cell, 2007 Nov 30, 131 (5): 834-5[3]: Embryonic Stem Cell Lines Derives from Human Blastocysts, J.A. Thomson et al.,

Science, 1998, 282: 1145[4]: Improved cryopreservation of human embryonic stem cells with trehalose, Chun F. Wu

et al., Reproductive BioMedicine Online, 2005, 11, 6:733 - 739[5]: The Banking and Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cells, Charles J. Hunt,

Transfusion medicine Hemotherapy, 2007, 34: 293-304,[6]: A two-factor hypthesis of freezing injury: Evidence from Chinese hamster tissue-culture

cells, Mazur et al., Experimental Cell Research,1971, 71:345-355 [7]: Biobanking, John G. Day, Glyn N. Stacey, Mol. Biotechnol., 2008, 40:202 - 213[8]: Controlled-rate freezing of human ES cells, Carol B. Ware, Angelique M. Nelson,

Anthony Blau, BioTechniques, 2005, 38:879 - 883 [13]: Ein Mikro-Waageverfahren zur kontinuierlichen Bestimmung der

Sublimationsgeschwindigkeit während der Gefriertrocknung, Dissertation Claudia Roth, Universität Erlangen-Nürnberg, 2000

http://www2.chemie.uni-erlangen.de/services/dissonline/data/dissertation/ Claudia_Roth/html/ Dissertation-Roth.html

[14]: Cryosurgery, Boris Rubinsky, Annual review of Biomedical Engineering, 2000, Vol. 2:157-187

[15]:http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/life-science/stem-cell-biology/ipsc-pathway.Par.0001.Image.566.gif

[16]: http://www.sciencedaily.com/images/2008/09/080910090825-large.jpg[17]: Kryovial, http://www.fisher.co.uk/offers/fisherbrand/images/FB74401.jpg[18]: Kryo straws,

http://www.cryobiosystem-imv.com/Portals/3/produits/zooms/Z_CBS_straws.jpg


http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/life-science/stem-cell-biology/ipsc-pathway.Par.0001.Image.566.gif

http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/life-science/stem-cell-biology/ipsc-pathway.Par.0001.Image.566.gif

http://www.sciencedaily.com/images/2008/09/080910090825-large.jpg

http://www.fisher.co.uk/offers/fisherbrand/images/FB74401.jpg

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