ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ …elar.urfu.ru/bitstream/10995/1371/3/1325091_methodinst.pdf · Физические и химические

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального

образования «Уральский государственный университет им. А.М. Горького»

ИОНЦ «Физика в биологии и медицине»

Биологический факультет

Кафедра физиологии и биохимии растений

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ИЗУЧЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ

«ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

РАСТЕНИЙ»

Екатеринбург

2007

28

Введение

Современная биология – одна из наиболее быстро развивающихся

наук. Она является источником не только фундаментального знания, но и

прикладного. Постгеномный этап развития биологии, который наступил в

90-х годах 20 века, характеризуется глубоким проникновением в биологию

современных методов и технологий, разрабатываемых другими науками.

Исследование тончайших механизмов, лежащих в основе жизни, сегодня

возможно благодаря мощному методологическому, методическому,

приборному и технологическому оснащению биологии.

Наряду с традиционными направлениями в биологии сегодня

стремительно развиваются такие направления как геномика, протеомика,

метаболомика и другие. Их появление и стремительное развитие

невозможно представить без использования достижений других наук,

прежде всего, физики, химии, математики, информационных технологий.

Поэтому в программе подготовки бакалавров и магистров-биологов

большое внимание уделяется лабораторным практикумам, которые

предполагают овладение студентами большого арсенала методов

биологических исследований: физических, химических, молекулярно-

биологических, молекулярно-генетических, специфических

физиологических методов.

Дисциплина «Физико-химические методы исследования растений»

является частью большого специального практикума кафедры физиологии и

биохимии растений и предназначена для обучения студентов по

направлению Биология – 020200 по циклу СД/ДС дисциплин

государственного образовательного стандарта высшего профессионального

образования. Студенты осваивают ее в 8 семестре. Общая трудоемкость

дисциплины составляет 180 часов, в том числе, 140 часов лабораторных

занятий и 40 часов самостоятельной работы. Контроль за самостоятельной

работой студентов и ее оценка будут проводиться в ходе обсуждения

29

результатов лабораторных работ и во время собеседования на 4

коллоквиумах.

За время освоения данной дисциплины студенты должны выполнить

большой объем практических работ, научиться работать на лабораторном

оборудовании общего и специального назначения.

Цель дисциплины – освоение современных физико-химических

методов исследования растений.

Для успешного освоения данной дисциплины необходимо

использовать те знания, умения и навыки, которые студенты приобрели

при изучении таких дисциплин как общая биохимия, молекулярная

биология, физиология растений, цитология, химия, физика.

В результате освоения данной дисциплины студент должен усвоить

теоретические знания об используемых в современной биологии физико-

химических методах исследования; приобрести практические навыки

работы на лабораторном оборудовании общего и специального назначения;

освоить методы исследования химического состава растительных объектов;

научиться планировать экспериментальные исследования, обрабатывать и

представлять полученные результаты. В процессе освоения лабораторного

практикума у студентов формируются компетентности:

• личностные (лидерство, способность принимать решения и

подчиняться решению, способность распределить полномочия);

• профессиональные (приготовление реактивов, сред, работа с

приборами, устройствами, планирование эксперимента и

обработка данных, анализ результатов, обобщение материалов,

выявление тенденций и закономерностей, написание отчетов,

подготовка докладов, презентаций, работа с базами данных);

• социальные (умение работать в группе, коллегиальность,

ответственность, соблюдение требований техники безопасности

и т.д.).

30

Особенностью дисциплины является большой объем лабораторных

работ. Эти работы носят не только учебный, но и исследовательский

характер. Каждой лабораторной работе должно предшествовать знакомство

студентов с теоретическими основами тех методов, которые они будут

осваивать. В этом им помогут электронные мультимедийные презентации.

Кроме того, студентами предстоит решать творческие задачи в ходе

лабораторного практикума и самоподготовки.

Методики, используемые в рамках практикума, продолжительны по

времени, поэтому время одного занятия составляет 5 часов. Студент должен

уметь планировать время таким образом, чтобы успевать в течение одного

занятия выполнять все необходимые процедуры в нужной

последовательности. Он должен иметь представление о том, на каком этапе

работы анализируемые образцы можно хранить до следующего занятия.

Условия хранения на промежуточных этапах должны обеспечивать

сохранность материала, а их последующая обработка не должна давать

артефактов.

31

1. Разделы курса, комментарии к их освоению, вопросы для

повторения и вопросы к коллоквиумам

Тема 1. Введение

Приступая к освоению этого курса необходимо вспомнить материал,

изученный ранее. Прежде всего, это касается таких дисциплин, как общая и

неорганическая химия, аналитическая химия, органическая, физическая и

коллоидная химия, биохимия и молекулярная биология, цитология. Это

позволит привести в систему представления о методах исследования

биологических объектов. Кроме того, необходимо восстановить навыки

работы с лабораторным оборудованием общего назначения таким как весы,

сушильные шкафы, термостаты, муфельная печь, водяная баня,

фотоэлектрокалориметр, спектрофотометр, центрифуги, гомогенизаторы,

пипетки, бюретки и т.д.). Необходимо вспомнить способы приготовления

сред и растворов, расчетов концентрации.

Прежде, чем приступить к работе, необходимо пройти инструктаж по

технике безопасности.

Вопросы для повторения.

1. Классификация методов исследования биологических объектов.

Наблюдение и эксперимент. Физические и химические подходы в

исследованиях.

2. Способы выражения и расчета концентрации растворов:

Моляльность, молярность, нормальность, объемные и весовые

проценты. Правила хранения реактивов.

Тема 2. Характеристика основных групп соединений в растениях.

Теоретический материал по этой теме студент осваивает как в ходе

самостоятельной работы, так и на лекционных (спецкурс «Биохимия

растений») и лабораторных занятиях. К началу практических занятий

32

студент должен знать химическое строение основных групп органических

веществ растений, их химические и физические свойства, например,

растворимость в воде, неорганических или органических растворителях,

реакционоспособность, характерные качественные реакции на различные

группы соединений, термостабильность и т.д. В ходе лабораторных занятий

студент знакомиться с методами экстракции, фракционирования и очистки

разных групп соединений и отдельных веществ.

Оценка теоретических знаний осуществляется на коллоквиумах. Два

коллоквиума посвящены характеристике основных групп соединений в

растительной клетке.

Вопросы к коллоквиумам:

Коллоквиум 1. «Углеводы растений. Методы фракционирования и

исследования».

1. Общая характеристика углеводов и их классификация.

2. Выделение растворимых и нерастворимых углеводов из

растительных тканей.

3. Фракционирование углеводов.

4. Методы определения содержания свободных моносахаридов,

олигосахаридов, запасных и структурных полисахаридов.

Литература:

1. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений: В 2-х томах. Пер. с

англ. М.: Мир. 1986

2. Методы биохимического исследования растений / Ермаков А.И.,

Арасимович В.В., Ярош Н.П. и др.; Под ред. Ермакова А.И.. 3 изд.,

перераб. и доп. Л.: Агропромиздат. Ленинградское отделение. 1987.

430с.

3. Методы химии углеводов /Под ред. Кочеткова Н.К. М.: Мир. 1967. 512 с.

4. Практикум по биохимии растений /Щипарев С.М., Медведев С.С.,

Шарова Е.И., Танкелюн О.В.; Под ред. Полевого В.В., Щипарева С.М.

Изд-во СПб ун-та: С-Петербург. 1996. 200с.

33

5. Хроматография на бумаге /Под ред. Хайса Н.М. и Мацека К. Пер. с

чешского. Изд-во иностранной литературы. М.: 1962. 852 с.

Коллоквиум 2. «Вещества вторичного обмена. Структура, свойства,

методы изучения».

1. Характеристика и классификация флавоноидов. Свойства разных

групп флавоноидов.

2. Общая характеристика алкалоидов. Классификация. Свойства

разных групп алкалоидов.

3. Характеристика и классификация терпеноидов. Свойства

терпеноидов.



англ. М.: Мир. 1986




430с.






Тема 3. Пробоподготовка

Этот раздел исключительно важен, так как правильная подготовка

проб для анализа обеспечивает точность и объективность результатов

анализа. В связи с этим необходимо освоить способы формирования

выборки изучаемых объектов, приготовления усредненной пробы.

Необходимо понимать, что для анализа состава растительных тканей или

34

определения их функциональной активности растительный материал

должен быть подготовлен особым образом. Важно знать, в каких случаях

работают со свежим материалом, а в каких с фиксированным, как сохранять

материал, если его анализ осуществляется не сразу после отбора проб.

Особое внимание необходимо уделить вопросам контроля условий отбора

проб, фиксации материала, его анализа. Для этого важно знать допустимый

температурный режим, кислотность среды, ее буферные свойства и т.д. С

этими вопросами студент ознакомиться в ходе выполнения лабораторных

работ и консультаций с преподавателем.

Вопросы для повторения.

1. Правила отбора проб растительных тканей, органов, целых

растений.

2. Фиксация растительных тканей. Основные типы фиксаторов.

3. Криосохранение. Высушивание образцов.

4. Способы гомогенизации свежего и фиксированного растительного

материала. Гомогенизаторы, блендеры.

5. Озоление растительного материала.

Литература




430с.

2. Починок Х.Н. Методы биохимического анализа растений. Изд-во

Наукова Думка: Киев. 1976. 335 с.




4. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М.: Мир. 1980. 582 с.

35

Тема 4. Концентрирование растворов макромолекул

При изучении состава и функций растительных объектов часто

возникают проблемы, связанные с низкими концентрациями тех или иных

соединений в клетках и тканях, что усложняет получение результатов,

особенно в отсутствии высокочувствительных методов исследований. Для

преодоления этой проблемы прибегают к процедуре концентрирования

растворов веществ. Важно понимать, что в процессе концентрирования

необходимо соблюдать условия, обеспечивающие целостность соединений.

Так, многие вещества являются термолабильными, чувствительными к

свету, рН, различным реагентам, следовательно, в каждом случае

необходим точный подбор условий, методов и соответствующего

оборудования. В ходе теоретической самоподготовки, а также

лабораторных работ необходимо освоить следующие процедуры:

центрифугирование, высаливание белков с помощью сульфата аммония,

упаривание, высушивание, лиофилизация, диализ.





430с.







Тема 5. Микроскопия

Работе с микроскопом студенты-биологи обучаются с первого курса.

Микроскоп является основным прибором на лабораторных занятиях по

36

ботанике, зоологии, цитологии, гистологии, микробиологии, физиологии

растений. Поэтому у большинства студентов к 4 курсы сформированы

устойчивые навыки работы на микроскопе и имеется хорошая

теоретическая подготовка. Тем не менее, приступая к большому

спецпрактикуму мы рекомендуем еще раз вспомнить правила работы с

микроскопам, технологию подготовки препаратов для микроскопирования.

Выполняя лабораторную работу по изучению мезоструктуры

фотосинтетического аппарата растений, необходимо детально изучить

руководство к этой практической работе, выпущенное отдельной брошюрой

(Борзенкова Р.А., Храмцова Е.В. Изучение мезоструктуры

фотосинтетического аппарата листа. Руководство к практическим занятиям.

УрГУ, Екатеринбург. 2006). Эта работа также предполагает освоение

процедуры приготовления фиксированного материала, мацерации тканей,

работы со счетной камерой Горяева или Фукса-Розенталя, такого

устройства как микротом, цифровой микрофотосъемки, работы со

специальным программным обеспечением (SiamsMezoPlant), базой данных

по мезоструктуре, созданной на кафедре. Освоение этой темы проверяется

на коллоквиуме.

Вопросы к коллоквиуму:

Коллоквиум 3. «Комплексное исследование структуры и

функциональной активности фотосинтетического аппарата».

1. Определение понятия мезоструктура фотосинтетического

аппарата. Основные измеряемые и расчетные параметры.

2. Микроскопическое исследование организации фототрофных тканей.

Подсчет числа хлоропластов и клеток. Измерение объемов и

поверхностей микроскопических объектов.

3. Электронная микроскопия в исследованиях фотосинтетического

аппарата растений. Исследование ультраструктуры хлопропластов.

4. Методы исследования строения фотосистем и реакционных

центров.

37

5. Флуоресцентная микроскопия в исследовании фотосинтеза.

6. Методы изучения функциональной активности фотосинтетического

аппарата: спектрофотометрические, изотопные,

газоаналитические, полярографические, хроматографические и др.


1. Борзенкова Р.А., Храмцова Е.В. Изучение мезоструктуры

фотосинтетического аппарата листа. Руководство к практическим

занятиям. УрГУ, Екатеринбург. 2006.

2. Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В. Большой практикум по фотосинтезу

/Под ред. Ермакова И.П. М.: Издательский центр «Академия». 2003.

256 с.


англ. М.: Мир. 1986.

4. Мокроносов А.Т., Гавриленко В.Ф., Жиглова Т.В. Фотосинтез.

Физиолого-экологические и биохимические аспекты. М.: Издательский

центр «Академия». 2006. 448 с.




Тема 6. Электрометрия

Определение рН растворов – рутинная лабораторная процедура.

Однако от умения правильно определять кислотность среды и

корректировать ее зависит успешное выполнения всех без исключения

анализов. Поэтому и теоретические знания, и практические навыки,

полученные при освоении этой темы, являются важной компетентностью

которая должна быть сформирована у биолога. С необходимость

определять рН и корректировать ее можно будет столкнуться при

выполнении каждой лабораторной работы, так как любая из них требует

приготовления реактивов с заданной рН. Нужно будет вспомнить правила

38

работы на рН-метре, научиться настраивать его, калибровать. Кроме того,

для контроля рН в малых объемах можно будет использовать

индикаторную бумагу. В ходе практикума можно будет также

познакомится с использованием селективных электродов для измерения

концентрации отдельных ионов в экстрактах растений или расчета ряда

показателей минерального питания растений.

Помимо определения рН необходимо освоить такой

электрометрический метод как полярография, в частности, в целях оценки

выделения кислорода суспензией хлоропластов, культурой

микроводорослей или его поглощения митохондриями и

микроводорослями.

Электрометрию применяют также для характеристики состояния

мембран клеток, определения активности ряда ферментов, например,

карбоангидразы, характеристики активного транспорта веществ через

мембраны и т.д.



/Под ред. Ермакова И.П. М.: Издательский центр «Академия». 2003. 256

с.





Тема 7. Газоаналитические методы

Растительные объекты имеют интенсивный газообмен с окружающей

средой, осуществляя функции фотосинтеза и дыхания. Кроме того, вступая

в симбиотические отношения с бактериями, они участвуют в обмене таких

газов как азот, метан, водород. СО2, О2, этилен или N2 могут выступать в

качестве субстратов или продуктов ферментативных реакций. Поэтому об

39

интенсивности ряда процессов можно судить, определяя изменение

концентрации газов в среде обитания растений. В ходе самоподготовки

студент должен изучить теоретические основы газометрии, а на

лабораторных занятиях научиться работать на инфракрасном

газоанализаторе, определять концентрацию газов в воздушной фазе. Эти

приемы лежат в основе определения интенсивности фотосинтеза,

фотодыхания и темнового дыхания растений. Также газометрически можно

определять скорость азотфтксации и метаногенеза у бактерий, что

представляет большой интерес при изучении взаимодействия растений с

микроорганизмами-симбионтами.



/Под ред. Ермакова И. П. М.: Издательский центр «Академия». 2003.

256 с.


Тема 8. Метод «меченых» атомов

Кафедра физиологии растений имеет изотопную учебно-научную

лабораторию фотосинтеза, в которой студенты проходят часть большого

специального практикума. Основной изотоп, используемый в этой

лаборатории – 14С. Прежде, чаем приступить к работе, следует

ознакомиться с требованиями техники безопасности выполнения работ в

изотопной лаборатории. Преподаватель проверяет знание этих правил и

дает студенту допуск к работе, делая соответствующую запись в журнале

по ТБ. Студент обязан строго выполнять правила работы в изотопной

лаборатории и требования преподавателя! На работу в изотопной

лаборатории студент допускается только в специальном халате и

сменной обуви!

Изучая теоретические вопросы, следует ознакомиться с

характеристикой изотопов, используемых в физиологических

40

исследованиях растений а также с методами их введения в растительные

объекты и методами обнаружения. На практических занятиях будут

освоены методы:

• введения 14СО2 в отдельный лист или целое растение для изучения

транспорта и распределения фотоассимилятов в листе и целом

растении

• радиометрический метод определения интенсивности фотосинтеза

растений

• изотопный метод определения активности ферментов РУБИСКО и

ФЕП-карбоксилазы

• радиоавтография первичных продуктов фотосинтеза и

транспортных форм сахаров в растении.

Кроме того, в ходе выполнения лабораторных работ будут освоены

принципы и правила работы на счетчиках радиоактивности. Необходимо

будет ознакомиться с явлением самопоглощения и научится определять

коэффициент самопоглощения.

Вопросы к коллоквиуму

Коллоквиум 4. Изотопные методы исследования растений.

1. Характеристика основных изотопов, используемых для

исследования растений: 3H, 14С, 11С, 32P, 35S, 40K, 45Ca. Типы ядерных

распадов: α- β- γ. Период полураспада.

2. Использование метода меченых атомов в физиологии и биохимии

растений.

3. Авторадиография.

4. Явление изотопной дискриминации.




256 с.

41







Тема 9. Хроматография

Методы хроматографического разделения веществ будут

использованы в большом количестве работ лабораторного практикума,

главным образом, бумажная одномерная и двумерная, восходящая и

нисходящая хроматография, тонкослойная хроматография. Эти методы

будут применяться для разделения и идентификации фотосинтетических

пигментов, а в сочетании со специфическим окрашиванием и определением

Rf – для идентификации органических и аминокислот, сахаров, фенольных

соединений. Совместно с изотопными методами бумажная хроматография

позволит идентифицировать продукты фотосинтеза и транспортные формы

ассимлятов в растении.

Освоение гель-хроматографии позволить выполнить работы по

обессоливанию белков, разделению полимерных и низкомолекулярных

углеводов, определить молекулярную массу макромолекул.

В ходе практикума следует освоить способы подготовки

ионообменных колонок, научится применять разные ионообменники для

разделения заряженных и незаряженных веществ.




256 с.

2. Методы биохимического исследования растений /Ермаков А.И.,

Арасимович В.В., Ярош Н.П. и др.; Под ред. Ермакова А.И. 3 изд.,

42


430с.







Тема 10. Электрофорез

Электрофорез – один из эффективных методов разделения

макромолекул. В основе этого метода лежит неодинаковая способность

макромолекул к передвижению в электрическом поле в носителе разной

плотности. Макромолекулы разделяются в электрическом поле в

соответствии с их суммарным зарядом и молекулярной массой. В ходе

практикума будут освоены методы разделения белков в полиакриламидном

геле и методы разделения нуклеиновых кислот в агарозном геле. Эти

процедуры сопровождают все молекулярно-биологические и молекулярно-

генетические исследования. Электрофорез является важным приемом при

определении молекулярной массы белков, ДНК и РНК, олигонуклеотидов.

Он используется для идентификации продуктов полимеразной цепной

реакции, для разделения и идентификации изоферментов. В сочетании со

специфическим окрашиванием позволяет идентифицировать определенные

ферменты и изучать их активность.



2. Остерман Д. Электрофорез белков

3. Маурер Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в

полиакриламидном геле.- М.: Мир, 1971. 210 с.

43

Тема 11. Центрифугирование

Центрифугирование – один из самых распространенных методов в

физиологии и биохимии растений. Он позволяет разделить органоиды

клеток, выделить их изолированные культуры. Его используют для

осаждения нерастворимых комплексов веществ при фракционировании

соединений растительной клетки, для концентрирования растворов,

определения массы, плотности и формы макромолекул и т.д.

При выполнении лабораторных работ необходимо строго соблюдать

правила техники безопасности, так как центрифуги – приборы повышенной

опасности. Образцы, подвергаемые центрифугированию, должны быть

тщательно уравновешены, при необходимости центрифужные пробирки

закрывают крышками. Вынимать образцы из центрифуги можно только

полной остановки! Выполняя центрифугирование, нужно уметь правильно

выбрать тип центрифуги, режим центрифугирования, знать, как соотносятся

скорость вращения ротора и g, какой ротор выбрать для конкретной

процедуры и т.д.




256 с.




430с.





44

Тема 12. Спектроскопические методы

Также как и предыдущие методы, спектрофотометрия – это широко

применяемый в исследовании растений метод. В ходе практикума будут

освоены методы UV-VIS и флуоресцентной спектроскопии. Они позволять

определить концентрации неорганических соединений в растворах и

экстрактах растений, снять спектры поглощения фотосинтетических и

нефотосинтетических пигментов, определить содержание белков,

нуклеиновых кислот, витаминов, аминокислот, углеводов, активность

ферментов, фотохимическую активность хлоропластов, характеристики

флуоресценции хлорофилла и т.д. Будут сформированы такие умения как

работа на спектрофотометре и фотоэлектрокалориметре, настройка и

юстировка ФЭКов и спектрофотометров, работа на флуориметре и

флуоресцентном микроскопе, люминесцентные методы анализа соединений

и т.д.




256 с.




430с.





45

Тема 13. Ядерный магнитный резонанс и электронный

парамагнитный резонанс (ЯМР и ЭПР)

Этот раздел программы студенты осваивают теоретически в ходе

самостоятельной работы. Результатом этой работы должны стать знания

основ ЯМР и ЭПР, Фурье-спектроскопии и о возможностях использования

этих методов для изучения физиолого-биохимических и структурных

особенностей растительных клеток, органоидов, молекул.



Тема 14. Иммунологические методы

Для освоения данной темы необходима предварительная

теоретическая работа с литературой. В этом поможет курс «Иммунологии»,

а также соответствующая литература. Ознакомившись с теорией вопроса,

можно приступить к лабораторным работам по определению содержания

ауксинов, цитокининов и абсцизовой кислоты в растительном материале.

Предварительно необходимо правильно зафиксировать материал, так как

фитогормоны – неустойчивые соединения и при хранении растительного

материала метаболизируются. Фиксированный материал используется для

экстракции фитогормонов. Подробно с этими процедурами, а такде

собственно с иммунологическим методом можно в брошюре Борзенковой

Р.А. «Иммуноферментный метод определения фитогормонов. Руководство

к практическим занятиям», УрГУ, Екатеринбург. 2006.


1. Борзенкова Р.А. Иммуноферментный метод определения

фитогормонов. Руководство к практическим занятиям. УрГУ,

Екатеринбург. 2006.

2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и

применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. 589 с.


46

2. Лабораторные занятия

За время практикума необходимо выполнить практические работы, в

ходе которых будет использовано все разнообразие физико-химических

методов, заявленных в программе. Всего практикум включает 28

пятичасовых занятий. Этого времени вполне достаточно для освоения

необходимых методов. Для оптимизации временных затрат на проведение

лабораторных работ студенты объединяются в бригады по 2 человека. По

завершении каждой лабораторной работы бригады представляют отчет

преподавателю, в котором указана тема работы, ее цель, объекты

исследований, кратко описана методика работы, представлены результаты в

виде таблиц, графиков, рисунков, дано краткое обсуждение результатов, их

сопоставление с литературными данными и сделаны выводы.

Преподаватель оценивает отчет по каждой работе. Из 20 предлагаемых

лабораторных работ каждая бригада выполняет 5-7 работ разнообразных по

применяемым методам. Число работ зависит от их трудоемкости и

продолжительности анализов. Комплект работ формируется

преподавателем с учетом пожеланий студентов.

Темы лабораторных занятий

1) Техника безопасности работ в биохимической и изотопной

лабораториях.

2) Экстракция, хроматографическое разделение, идентификация и

определение содержания аминокислот в растительных тканях.

3) Хроматографическое разделение свободных сахаров и их

идентификация.

4) Экстракция и определение различных фракций углеводов.

5) Выделение органических кислот. Определение суммы

органических кислот.

47

6) Хроматографическое разделение ди- и трикарбоновых кислот.

Количественное определение.

7) Определение массы и основности золы, содержания

минеральных веществ в растении.

8) Определение содержания минеральных и органических форм

азота в растении.

9) Сравнительное исследование разных методов количественного

определения белков.

10) Определение содержания аскорбиновой кислоты и

восстановленного глутатиона. Сравнение разных методов.

11) Извлечение нуклеиновых кислот из растительных тканей.

Количественное определение ДНК и РНК.

12) Электрофорез белков.

13) Электрофорез нуклеиновых кислот.

14) Определение крахмала объемным методом.

15) Экстракция, разделение и идентификация фенольных

соединений в растении.

16) Методы получения и культивирования каллуса.

17) Изотопные и газометрические методы определения

интенсивности фотосинтеза.

18) Изучение мезоструктуры фотосинтетического аппарата

растений на свежем и фиксированном материале.

19) Иммуноферментный анализ содержания ауксинов, цитокининов

и абсцизовой кислоты в растительных тканях.

20) Определение содержания тяжелых металлов в растительных

тканях.

48

3. Вопросы и задания

для самостоятельной работы

1) Каковы основные группы органических веществ в растении?

2) Какова доля неорганических веществ в растительных тканях?

3) Какие принципы лежат в основе классификации органических

кислот?

4) Как подготовить ткани растений к химическому анализу?

5) Какие условия необходимо соблюдать при упаривании

растворов разных органических соединений? Почему?

6) В каких случаях используют диализ? Каковы условия его

проведения?

7) Какие преимущества дает лиофильная сушка в сравнении с

высушиванием растительных тканей в сухожарных сушильных

шкафах?

8) Какие экстрагенты используют для извлечения органических

кислот из растительных тканей?

9) Какие методы используют для разделения смеси органических

кислот?

10) На чем основаны принципы количественного определения

органических кислот?

11) Какие аминокислоты относят к протеиногенным? Какие к

непротеиногенным?

12) Каковы принципы классификации аминокислот?

13) Какие растворители используют для экстракции аминокислот?

14) Как можно разделить смесь аминокислот и идентифицировать

их?

15) Какие методы используют для количественного определения

аминокислот в растениях?

16) Дайте общую характеристику липидам.

49

17) Каковы принципы классификации липидов?

18) Как можно экстрагировать липиды из растительных тканей?

19) В чем преимущества извлечения липидов с использованием

вакуумного ротационного испарителя?

20) Как определить содержание липидов в растении?

21) Какие принципы лежат в основе классификации углеводов?

22) Дайте общую характеристику моносахарам.

23) В чём растворяются и чем экстрагируют свободные

моносахариды?

24) Какие экстрагенты используют для извлечения олигосахаридов?

25) В чем растворимы фруктаны? Как их экстрагируют?

26) Как экстрагируют крахмал из растительных тканей?

27) В чем особенности, достоинства и недостатки кислотного и

ферментативного гидролиза крахмала?

28) Какие способы извлечения структурных полисахаридов Вам

известны?

29) Каковы особенности экстракции гемицеллюлоз и целлюлозы?

30) Предложите схему фракционирования углеводов, выделенных

из Растительных тканей.

31) Для разделения смеси каких углеводов используют бумажную

или тонкослойную хроматографию?


свободных, запасных и структурных углеводов?

33) Какие способы классификации белков растений вы знаете? На

каких принципах они основаны?

34) Как экстрагируют растворимые и мембраносвязанные белки

растениий?

35) Какие способы фракционирования белков используют при их

выделении?

36) Какие свойства белков позволяют их фракционировать?

50

37) Какие соли обычно используют для осаждения белков?

Почему?

38) Какова последовательность этапов очистки белков?

39) Как можно очистить белки от низкомолекулярных соединений?

40) Гарантирует ли кристаллизация белка его чистоту?

41) В чем достоинства и недостатки разных методов

количественного определения белков в растительных тканях?

42) Дайте сравнительную характеристику ДНК и РНК.

43) В чем растворимы ДНК и РНК?

44) Какие физико-химические методы используют для выделения

нуклеиновых кислот?

45) Перечислите и охарактеризуйте основные этапы выделения и

очистки ДНК и РНК?

46) Какие условия необходимо соблюдать при выделении

нуклеиновых кислот?

47) Почему нуклеиновые кислоты и белки выделяют на холоду?

48) Как очистить нуклеиновые кислоты от белка и других

органических соединений?

49) Как можно проконтролировать степень чистоты препаратов

ДНК и РНК?


ДНК и РНК?

51) Какую процедуру позволяет осуществлять амплификатор?

52) Как осуществляется секвенирование ДНК?

53) Каков принцип действия секвенатора?

54) Что такое флавоноиды? Какими общими свойствами они

обладают?

55) Какие группы флавоноидв встречаются в растениях?

56) В чем растворимы флавоноиды?

51

57) Какие физико-химические методы используют для экстракции

и фракционирования флавоноидов?

58) Какие химические группы в молекулах флавоноидов

оуславливают их флуоресцентные свойства?

59) Как можно определить количество разных флавоноидов в

растении?

60) Какие особенности алкалоидов лежат в основе их

классификации?

61) Какие экстрагенты используют для извлечения алкалоидов из

растительного сырья?

62) На каких свойствах молекул алкалоидов основано их

количественное определение?

63) Какие свойства терпеноидов лежат в основе их классификации?

В чем особенности разных групп терпеноидов?

64) Как извлечь терпеноиды из растительных тканей?


терпеноидов?

66) Что такое зольность? Как она связана с содержанием

неорганических веществ в растительных тканях?

67) Что такое озоление? Какие способы озоления Вам известны?

68) Как определить содержание растворимых и нерастворимых

неорганических веществ в тканях растения?

69) Какие методы количественного определения С, N, H в

растительных тканях вам известны? На каких принципах они

основаны?

70) Какие методы используют для определения содержания

минерального азота в растениях?

71) Какие приборы и методы используют для определения

содержания К+, Na+, Ca2+, Mg2+, Fe3+ и других катионов?

52

72) Какие методы позволяют определить локализацию тяжелых

металлов в клетках и тканях?

73) Какие методы и приборы используют для количественной

оценки содержания тяжелых металлов в растении?

74) Какие виды центрифугирования используют для выделения

клеточных структур?

75) Какие вещества используют для создания градиента плотности

в центрифужных пробирках?

76) Что такое коэффициент седиментации?

77) Что означают единицы Сведберга?

78) В чем отличия аналитического и препаративного

центрифугирования?

79) Какие факторы влияют на седиментацию структур и

макромолекул?

80) Как определить плотность и массу структур и молекул при

центрифугировании?

81) Чем определяются особенности использования углового ротора

или ротора с подвесными стаканами?

82) В чем преимущества и недостатки разных видов световой

микроскопии?

83) Какие приемы позволяют минимизировать появление

артефактов при световой микроскопии?

84) В каких случаях эффективно использовать люминесцентную и

флуоресцентную микроскопию?

85) Какие возможности дает конфокальная микроскопия?

86) Какие приемы подготовки образцов для электронной

микроскопии Вам известны?

87) Какие способы контрастирования используют в электронной

микроскопии?

53

88) Каковы возможности трансмиссионной и сканирующей

электронной микроскопии?

89) Какие методы в сочетании с микроскопией позволяют изучать

локализацию веществ, отдельных реакций, ферментов в клетке

и тканях растений?

90) Дайте сравнительную характеристику цито-, гисто- и

иммунохимическим методам.

91) Как устроен рН-метр? Какие типы электродов используют для

измерения кислотности среды?

92) В чем достоинства и недостатки использования индикаторной

бумаги при измерении рН?

93) Что такое селективные электроды?

94) Какие типы селективных электродов вам известны? Для чего их

используют?

95) Какую технику используют для исследования мембранных

потенциалов?

96) Активность каких ферментов можно определять

электрометрически?

97) В каких случаях для определения интенсивности фотосинтеза

или дыхания используют полярографические методы?

98) Какие типы газоанализаторов используются в физиологии

растений? Для чего?

99) Какими свойствами обладает изотоп 14С?

100) Почему 14С широко используют в биохимических и

физиологических исследованиях?

101) Какие меры предосторожности необходимо предпринимать,

работая с радиоактивными изотопами?

102) Какие преимущества и недостатки имеет использование 3H, 32P, 35S в изучении метаболизма и функций растений?

103) Как определить коэффициент самопоглощения?

54

104) Сравните эффективность работы торцового и

сцинтилляционного счетчиков.

105) Сочетание каких двух методов лежит в основе

авторадиографии?

106) Какие открытия в физиологии и биохимии растений были

сделаны в результате использования авторадиографии?

107) В чем состоит явление изотопной дискриминации?

108) Приведите примеры изотопной дискриминации в биохимии

растений.

109) Сравните С3 и С4 растения по изотопной дискриминации.

110) Как измерить Rf?

111) В чем преимущества и недостатки восходящей и нисходящей

хроматографии?

112) Кто изобрел метод хроматографии?

113) В чем особенности и преимущества тонкослойной

хроматографии в сравнении с бумажной?

114) Какие ионообменные смолы вам известны?

115) В каких случаях используют ионообменники?

116) Что такое гель-фильтрация?

117) Какие вещества используют в качестве носителей для гель-

фильтрации?

118) Что представляет собой сефадекс? По какому принципу

различают разные типы сефадексов?

119) Каковы сферы использования гель-фильтрации?

120) Какой принцип лежит в основе разделения молекул при

электрофорезе?

121) Какие гели используют для электрофореза белков и

нуклеиновых кислот? Почему?

122) Для каких целей проводят процедуру электрофореза?

55

123) В чем особенности аналитического и препаративного

электрофореза?

124) Как зависит от напряжения качество электрофоретического

разделения веществ?

125) В каких случаях целесообразно использовать SDS-

электрофорез?

126) Что такое изоэлектрофокусирование?

127) В каких случаях применяют изоэлектрофокусирование?

128) В каких случаях используют нозерн-, а в каких саузерн-

гибридизацию?

129) Каков принцип работы спектрофотометра?

130) Что такое молярный коэффициент экстинкции?

131) Что такое оптическая плотность? Как ее измерить?

132) Приведите примеры использования спектрофотометрических

методов в физиологии и биохимии растений.

133) В чем причины флуоресценции хлорофилла в листе?

134) Какую информацию дает изучение флуоресценции

хлорофилла?

135) Какие флуоресцентные красители вам известны?

136) Как и для чего применяют флуоресцентные красители?

137) Как устроены флуориметры?

138) Как измерить флуоресценцию?

139) Какова связь между параметрами флуоресценции хлорофилла и

состоянием фотосинтетического аппарата?

140) Какие процессы лежат в основе ЯМР и ЭПР?

141) Какие возможности существуют для использования методов

ЯМР и ЭПР в физиологических исследованиях?

142) Определите понятия антиген, антитело, гаптен.

143) Как получают моноклональные антитела?

144) Что такое антисыворотка?

56

145) Опишите схемы иммуноферментного анализа фитогормонов.

146) В чем состоят особенности радиоиммунологического анализа?

147) Как при помощи иммунологических методов определить

локализацию белков в клетке?

148) Каковы достоинства и недостатки ИФА при обнаружении

патогенов растений?

149) Может ли использование приборов обеспечить объективность

результатов исследования биологических объектов?

150) Каковы источники артефактов при работе с приборами?

4. Вопросы для подготовки к зачету

1) Общая характеристика основных типов веществ в растительных

тканях.

2) Подготовка образцов растительных тканей для биохимического

и физиологического исследования.

3) Фиксация растительных тканей. Основные типы фиксаторов.

Криосохранение.

4) Способы гомогенизации свежего и фиксированного

растительного материала.

5) Микроскопия. Виды. Разрешающая способность разных типов

микроскопов.

6) Методы исследования структуры и функций ферментов.

7) Методы определения содержания растворимых и

мембраносвязанных белков.

8) Способы очистки белков.

9) Хроматографическое разделение веществ. Принципы. Виды

хроматографии.

10) Гель-фильтрация. Принцип метода. Сферы использования.

11) Методы изучения фотосинтетического метаболизма растений.

57

12) Основные подходы и методы определения активности

ферментов в растении.

13) Получение и анализ спектров поглощения фотосинтетических

пигментов растений.

14) Методы выделения и определения содержания

фотосинтетических пигментов. Основные экстрагенты.

15) Флуоресцентные методы изучения фотосинтеза.

16) Культуры клеточных органоидов. Методы изоляции и контроля

чистоты культур.

17) Методы исследования функциональной активности

изолированных хлоропластов и митохондрий.

18) Иммуноферментный анализ. Общая схема. ELIZA-метод

определения содержания фитогормонов в растениях.

19) Фракционирование углеводов растений.

20) ЯМР и ЭПР. Основы метода. Испрользование.

21) Спектрофотометрия. Основа метода. Виды спектрофотометрии.

22) Спектрофотометрические методы изучения активности

ферментов.

23) Методы исследования формы макромолекул.

24) Методы определения молекулярной массы макромолекул.

25) Ионообменная хроматография. Ионообменники. Использование

в физиологических исследованиях.

26) Центрифугирование. Виды центрифугирования. Использование

в биохимических исследованиях.

27) Электорофорез. Типы носителей. Устройства для проведения

электрофореза.

28) Электрофорез белков.

29) Электрофорез нуклеиновых кислот.

30) Физико-химические методы контроля условий проведения

физиолого-биохимических исследований.

58

31) Газометрия. Газоанализаторы. Использование в физиологии и

биохимии растений.

32) Поляризационные методы исследования функций растительных

клеток и тканей.

33) Изотопные методы в физиологии и биохимии растений.

Характеристика основных изотопов. Особенности применения.

34) Методы определения тяжелых металлов в растениях.

35) Выделение нуклеиновых кислот.

36) Амплификация олигонуклеотидных последовательностей.

37) Органические кислоты. Методы определения в растениях.

38) Аминокислоты. Методы выделения и идентификации.

Количесивенное определение.

39) Выделение и исследование растительных липидов.

40) Извлечение и определение минеральных веществ растительных

клеток и тканей.

59

III. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЧАСОВ КУРСА ПО ТЕМАМ И

ВИДАМ РАБОТ

Аудиторные занятия (час)

в том числе

№ п/п

Наименование разделов и тем

ВСЕГО(часов)

Лекции Лаборатор-ные работы

Самостоятельная работа

1. Введение. Характеристика основных групп соединений в растениях.

4 4

2. Пробоподготовка. Концентрирование растворов макромолекул.

4 4

3. Микроскопия 24 20 4

4. Электрометрия. 6 4 2

5. Газоаналитические методы

10 8 2

6. Метод меченых атомов

12 8 4

7. Хроматография 28 24 4

8. Электрофорез 20 16 4

9. Центрифугирование 20 16 4

10. Спектроскопия 22 20 2

11. ЯМР, ЭПР 8 8

12. Иммунологические методы

22 20 2

9. ИТОГО: 180 140 40

60

IV. ЗАЧЕТ

Формой отчетности по данной дисциплине является зачет. Допуск к

зачету осуществляется на основании выполнение и защиты лабораторных

работ и сдачи коллоквиумов. Студентам, не имеющим задолженности по

лабораторным работам и успешно сдавшим коллоквиумы, зачет может быть

поставлен автоматически. Студенты, имеющие задолженности по отчетам,

корректируют отчеты и предоставляют их преподавателю до зачета. В

случае задолженности по .лабораторным работам (пропуски занятий,

отсутствие результатов вследствие ошибок в исполнении методик) при

наличии возможностей лаборатории студенты отрабатывают пропущенные

занятия, выполняя работу полностью или ее часть. При отсутствии в

лаборатории возможностей для отработки студент сдает теоретический

материал, соответствующий пропущенной теме до зачета. При наличии

задолженности по коллоквиумам студент допускается к зачету, однако

получает дополнительный вопрос по несданной теме.

Зачет проходит в форме собеседования по билетам.

V. ЛИТЕРАТУРА

5. Борзенкова Р.А. Иммуноферментный метод определения

фитогормонов. Руководство к практическим занятиям. УрГУ,

Екатеринбург. 2006.

6. Борзенкова Р.А., Храмцова Е.В. Изучение мезоструктуры

фотосинтетического аппарата листа. Руководство к практическим

занятиям. УрГУ, Екатеринбург. 2006.


/ Под ред. Ермакова И.П. М.: Издательский центр «Академия». 2003.

256 с.

8. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и

применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. 589 с.

61

9. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений: В 2-х томах.

Пер. с англ. М.: Мир. 1986.

10. Землянухин А.А. Практикум по биохимии. Изд-во Воронежского

университета: Воронеж. 144 с.

11. Маурер Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в

полиакриламидном геле.- М.: Мир, 1971. 210 с.




430с.

13. Методы химии углеводов /Под ред. Кочеткова Н.К. М.: Мир. 1967.

512 с.

14. Остерман Д. Электрофорез белков









VI. РЕСУРСНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ

• Лаборатория физиологии и биохимии растений

• Изотопная лаборатория фотосинтеза

• Оборудование общего лабораторного назначения и

специальные приборы и установки: микроскопы, центрифуги,

фотоэлектрокалориметры, спектрофотометр, рН-метры,

иономеры, устройства для электрофореза, хроматографические

камеры и колонки, холодильники, сушильные шкафы,

62

термостаты, весы, цифровые камеры для микрофотосъемки,

дозаторы автоматические и т.д.

• Лабораторная посуда

• Расходные материалы: реактивы, фильтровальная и

хроматографическая бумага

• Водные и почвенные культуры высших растений, культуры

одноклеточных водорослей, фиксированный материал

растительных клеток и тканей.

• База данных по структуре фототрофных клеток листьев

растений, система анализа компьютерных изображений клеток

и тканей растений «SIAMS» в комплекте с цифровой

видеокамерой и компьютером.

• Мультимедийный проектор, ноутбук.

Documents

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ …elar.urfu.ru/bitstream/10995/1371/3/1325091_methodinst.pdf · Физические и химические