人类染色体标本的制备及 G 显带核型分析

安徽医科大学基础医学院生物学教研室

[ 目的和要求 ]

1. 掌握染色体标本的制备方法和 G 显带技术。2. 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及 G 显带 染色体的核型分析技术。

[ 实验原理 ]

染色体作为细胞遗传信息的载体，出现于有丝分裂期。用于人类染色体标本制备的材料可为骨髓细胞、外周血淋巴细胞、绒毛细胞、羊水细胞等。其中最简便的就是抽取少量外周静脉血进行短期培养，经秋水仙素处理（秋水仙素可阻断有丝分裂期细胞中微管的聚集，使纺锤体不能形成，从而使有丝分裂停滞在中期时相，此时染色体具有最典型的形态），再经低渗、固定等处理，获得更多的中期分裂相以用于核型分析。

染色体的带纹是染色体标本经过特殊处理后，每条染色体上沿纵轴显示出的一定数量、着色程度不同、宽窄不等的横纹。染色体带是染色体固有的、稳定的特征。染色体 G显带是多种显带技术中的一种，是将染色体标本经胰蛋白酶处理后再用吉姆萨（ Giemsa ）染液染色。 G显带技术因其方法简便，重复性好，带纹清晰且可长期保存而应用最为广泛。

核型是指一个体细胞有丝分裂中期的所有染色体，并按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。每一个体细胞含有两组同样的染色体，用 2n表示。

染色体核型分析是细胞遗传学的重要研究手段，在临床多种疾病如染色体病、白血病、肿瘤等的诊断及研究中具有重要意义。

人类体细胞的正常核型人类体细胞的正常核型

组 染色体号 主要特征A 组

B 组

C 组

D 组

E 组

F 组

G 组

12

3 亚中着丝粒染色体中央着丝粒染色体

4 ———— 5 亚中着丝粒染色体、无随体

6 ———— 12 、 X 亚中着丝粒染色体

大

小

13 ———— 15 近端着丝粒染色体、有随体1617 18 亚中着丝粒染色体

中央着丝粒染色体

19 ———— 20 中央着丝粒染色体

21———— 22 、 Y近端着丝粒染色体、有随体

Y 染色体略大、长臂平行伸展、无随体

基因组与核型基因组与核型

基因组：生物体内单倍体染色体组成叫做生物体的基基因组：生物体内单倍体染色体组成叫做生物体的基因组因组 (genome)(genome) ，它代表了一个生物体染色体中储存，它代表了一个生物体染色体中储存的全部遗传信息。的全部遗传信息。

显带染色体：

p

q

3

2

11

2

3

4

6

4321

5

21312

1

2

123 5

4

12132

4

用特殊的染色方法使用特殊的染色方法使染色体沿其长轴显示染色体沿其长轴显示出明暗交替或染色深出明暗交替或染色深浅不同的横纹——带。浅不同的横纹——带。

正常男性： 46 ， XY

正常女性： 46 ， XX

正常人体细胞染色体带型模式图

[ 实验用品 ]

1 ．器具：采血器具、超净工作台、培养瓶、恒温 培养箱、恒温水浴锅、 10 ml 刻度离心管、低 速离心机、量筒、载玻片、托盘天平、光学 显微镜、染缸、电吹风、酒精灯、剪刀、胶水。 2 ．材料：人外周静脉血。 3．试剂： RPMI-1640 培养液、小牛血清、肝素、植 物血凝素（ PHA）、秋水仙素 (20μg/ml) 、 0.075 mol/L 氯化钾低渗液、 0.85%生理盐水、 固定液（甲醇 :冰醋酸 =3:1 ，现配现用）、 Giemsa原液、 0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲 液。

[ 实验步骤 ] ( 一 ) 人类外周血染色体标本的制备 1．采集人外周静脉血 1ml，迅速与适量肝素混匀抗凝。 2. 超净工作台内将抗凝血加入 RPMI-1640培养液中，每 瓶加 0.3～ 0.5 ml 全血。轻轻混匀。 3. 37℃恒温培养箱静置培养 72 h左右（培养24 h后水平 轻摇培养瓶一次，以悬浮混匀血细胞）。 4. 培养至68～ 72 h（即终止培养前 2～4 h），每瓶加秋 水仙素 (20 μg/ml)至终浓度0.1～ 0.2 μg/ml，轻摇 培养瓶混匀，继续培养2～4 h。 5. 终止培养，将培养物吹打混匀后转移到 10 ml玻璃离 心管，配平，1800 rpm 离心6 min 。

6. 低渗 弃上清。加入37℃预温的 0.075 mol/L 氯化钾 8 ml ，吸管轻轻吹打混匀， 37℃低渗处理 20 min。 7. 预固定 加入 1ml 新鲜配制的固定液（甲醇 :冰醋酸 =3:1 ），轻轻混匀，1800 rpm 离心6 min 。 8. 固定：弃上清，加入上述新鲜固定液 8 ml ，轻轻混 匀，室温下静置固定20 min。 9. 弃上清，重复固定 1次。 10.弃上清，根据沉淀量多少加入适量滴数新鲜固定 液，轻轻混匀，制成磨砂状悬液。 11.制片：取上述悬液 1～ 2滴，滴至沾有冰水或干燥的 洁净载玻片上，吹散，过火，空气干燥。 12.37℃温箱放置3～ 4天或 70℃烘烤 2 h进行老化处 理，以备显带分析用。

【实验方法和步骤】

1 、预处理：实验前 3---4小时，取健康小鼠，每只　　　　　　腹腔注射 0． 01 ％ 秋水仙素 0． 3---　　　　　　　 0． 4ml。注意不要伤及内脏。2、取股骨：用一只手的拇指和食指按住小鼠　　　　　　的头部，另一只手 拉住它的尾巴，用　　　　　　力向后拉断其颈椎。处死后立即用剪　　　　　　　刀剪 开后腿上的皮毛，取出小鼠的股　　　　　　骨，剔除上面的肌肉，洗净。

( 二 ) 人类染色体的 G 显带1.胰蛋白酶准备：在盛有 45 ml 0.85%生理盐水的染缸 中加 3 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，调节 pH 值至 6.8 ～ 7.2 ，置 37℃恒温水浴锅中预温。2.胰蛋白酶消化处理：将经老化处理的标本片放入胰

蛋 白酶溶液中处理 2～ 3 min ，不断轻摇载玻片以保证 作用均匀充分。3. 漂洗：迅速用 0.85%生理盐水漂洗，以终止胰蛋白

酶 的作用。4.染色：用吉姆萨工作液染色 10～ 15 min 。5. 冲洗干燥：用缓流自来水冲洗载玻片，空气干燥或电 吹风吹干。6. 镜检：光学显微镜下观察分析核型。

( 三 ) G 显带的核型分析 1. 选取染色体分散良好、长度适中染色体 G显带核型 照片，首先进行计数，然后将每条染色体剪下。 2. 配对：同源染色体形态相同，带型一样；非同源染

色体的大小，形态等带型各异，根据这个原理，按照染色体的大小、形态、着丝粒的位置，随体的有无和 G显带带型等特征将 46条染色体配成 23 对。

3.染色体排列：将配成 23 对的染色体按大小次序排列，一对性染色体排在最后，并把排列好的 23 对染色体分组贴附于实验报告纸上。这样，经过剪贴配对好的正常人体染色体图即为正常人体核型图，可写成

46,XX 或 46,XY。

正常男性染色体 G-显带核型

人类染色体 G- 显带特征口诀：

一秃二蛇三蝶飘 四鞭炮五黑腰六号是个小白脸 七上八下九苗条十号长臂近带好 十一低来十二高十三四十五 下、中、上十六 q2缢痕大 十七长臂带脚镣十八人小肚皮大 十九一点腰二十头重又脚轻 二十一象个葫芦瓢二十二头带小黑帽 X一担挑， Y是黑脚

[ 注意事项 ]

1. 染色体标本制备中的关键因素包括秋水仙素的用量和作用时间、低渗和固定的处理。其中低渗时间很重要，处理时间过长则细胞膜过早破裂导致染色体丢失，处理时间不足则致染色体分散不好，不利于计数分析。

2. G 显带过程中的关键因素包括胰蛋白酶的作用时间、温度、 pH等。其中胰蛋白酶溶液应 37℃充分预热，溶液 pH应维持在 6.8 ～ 7.2 ，以保证酶活性的发挥。另外消化要适度，消化不足则带纹不清晰或不显示，消化过度则带纹模糊甚至损失。

[ 作业与思考题 ]

1.简述人类染色体制备的操作过程和基本原理。 2. 总结人类染色体制备过程中的关键步骤及注意 事项。 3.制作人的 G显带正常核型配对分析图。