БиолошкеБиолошке мембранемембране иитранспорттранспорт

МилошМилош МојовићМојовић

ОсобинеОсобине ћелијећелије ии функцијафункцијабиолошкихбиолошких мембранамембрана

ЋелијаЋелија -- основаоснова грађеграђе свихсвих биљакабиљака ии животињаживотиња. . ДаДа биби сесе нештонешто могломогло назватиназвати ""ћелијомћелијом" " морамора дада имаима следећеследећеособинеособине::

-- дада јеје аутономногаутономног саставасастава односуодносу нана околнуоколну срединусредину-- дада поседујепоседује аутономностаутономност хемијскиххемијских реакцијареакција-- дада остварујеостварује везувезу саса околиномоколином ((отворенотворен системсистем))

ИзИз чегачега јеје састављенасастављена ћелијаћелија??КојаКоја јеје разликаразлика измеђуизмеђу прокариотскепрокариотске, , животињскеживотињске ии биљнихбиљнихћелијаћелија??

КонтролисанаКонтролисана повезаностповезаност ћелијећелије ии околнеоколне срединесредине остварујеостварује сесепрекопреко биолошкихбиолошких мембранамембрана..

Ћелија 1Ћелија 2Састав ћелије

ФункцијаФункција биолошкихбиолошкихмембранамембрана

БиолошкеБиолошке мембранемембране имајуимају тритри основнеосновне ии вишевише допунскихдопунскихфункцијафункција::ОсновнеОсновне функцијефункције::-- механичкамеханичка функцијафункција ((обезбеђујеобезбеђује отпорностотпорност ии аутономностаутономностћелијећелије))-- баријернабаријерна функцијафункција ((обезбеђујеобезбеђује регулисанурегулисану разменуразменуматеријаматерија саса околиномоколином))-- матричнаматрична функцијафункција ((обезбеђујеобезбеђује положајположај ии орјентацијуорјентацијумембранскихмембранских протеинапротеина уу циљуциљу њиховогњиховог деловањаделовања))ДопунскеДопунске функцијефункције::-- рецепторскарецепторска ((спољашњихспољашњих сигналасигнала), ), енергетскаенергетска ((синтезасинтеза"ATP"ATP--a"a" нана мембранамамембранама митохондријамитохондрија ии хлоропластахлоропласта), ), кондуктивнакондуктивна ((заза провођењепровођење биопотенцијалабиопотенцијала), ), генераторскагенераторска((заза генерисањегенерисање биопотенцијалабиопотенцијала) ...) ...

УкупнаУкупна површинаповршина свихсвих биолошкихбиолошких мембранамембрана кодкодчовекачовека јеје окооко 30 000 30 000 мм22..МембранеМембране чинечине прекопреко 50% 50% сувесуве материјематерије ћелијаћелија..ЗбогЗбог својесвоје сложеностисложености, , мембранемембране сусу најмањенајмањеистражениистражени деловиделови организмаорганизма..ПоремећајиПоремећаји уу функцијамафункцијама мембранамембрана сусу узрокузрок великогвеликогбројаброја болестиболести ((ракрак, , артериосклерозаартериосклероза, , вируснавирусна иибактеријскабактеријска обољењаобољења, , тровањатровања, , оштећењаоштећењајонизујућимјонизујућим зрачењемзрачењем ......

ХемијскиХемијски саставсастав биолошкихбиолошкихмембранамембрана

БиолошкеБиолошке мембранемембране уу свомсвом основномосновном хемијскомхемијском саставусаставусадржесадрже: : липиделипиде, , протеинепротеине ии угљенеугљене хидратехидрате..УУ мембранамембрана имаима уу мањојмањој количиниколичини ии: : нуклеинскихнуклеинскихкиселинакиселина, , полиаминаполиамина, , неорганскихнеорганских јонајона ии везаневезане водеводе..ПроцентниПроцентни односоднос липидалипида ии протеинапротеина зависизависи одод врстеврстемембранамембрана::

СтруктураСтруктура мембранемембране ПротеиниПротеини (%)(%) ЛипидиЛипиди (%)(%)

МијелинМијелин 2020 8080

ЕритроцитиЕритроцити 6060 4040

МитохондријеМитохондрије 6060--6565 3535--4040

ЈедроЈедро ћелијећелије 4848--5252 5252--4848

ХлоропластиХлоропласти 5050--6060 5050--4040

БактеријеБактерије 5555--6565 1010--2020

МембранскиМембрански липидилипидиУУ саставсастав биолошкихбиолошких мембранамембрана улазеулазе тритри класекласе липидалипида: : фосфолипидифосфолипиди, , гликолипидигликолипиди ии холестеролхолестерол..

ФосфолипидиФосфолипиди ии гликолипидигликолипиди сесе састојесастојеодод двадва хидрофобнахидрофобна угљоводоничнаугљоводоничналанцаланца ((репарепа) ) којикоји сусу везанивезани зазахидрофилнухидрофилну главуглаву..ФосфолипиднаФосфолипидна ““главаглава”” јеје фосфорилисанафосфорилисанаии састојисастоји сесе илиили одод глицеролаглицерола ((групагрупафосфоглицеридафосфоглицерида) ) илиили одод сфингозинасфингозина((сфингомијелинсфингомијелин).).ГликолипидиГликолипиди уу хидрофилнојхидрофилној ““главиглави”” имајуимајусфингозинсфингозин заза којикоји јеје везановезано једанједан илииливишевише шећерашећера. . ХидрофибниХидрофибни ““репреп”” имим сесесастојисастоји илиили одод дведве маснемасне киселинекиселине ((каокаокодкод фосфоглицеридафосфоглицерида) ) илиили одод једнеједне маснемаснекиселинекиселине ии једногједног сфингозинскогсфингозинскогугљоводоничногугљоводоничног ланцаланца..

ДаДа поновимопоновимо::

ФосфолипидиФосфолипиди::ФосфолипиднаФосфолипидна ““главаглава”” јејефосфорилисанафосфорилисана ии састојисастоји сесе илиилиодод глицеролаглицерола ((групагрупафосфоглицеридафосфоглицерида) ) илиили ододсфингозинасфингозина ((сфингомијелинсфингомијелин).).

ГликолипидиГликолипиди::ГликолипидиГликолипиди уу хидрофилнојхидрофилној““главиглави”” имајуимају сфингозинсфингозин заза којикојијеје везановезано једанједан илиили вишевишешећерашећера. . ХидрофибниХидрофибни ““репреп”” имим сесе састојисастојиилиили одод дведве маснемасне киселинекиселине ((каокаокодкод фосфоглицеридафосфоглицерида) ) илиили ододједнеједне маснемасне киселинекиселине ии једногједногсфингозинскогсфингозинског угљоводоничногугљоводоничногланцаланца..

МаснеМасне киселинекиселине обичнообично имајуимајуизмеђуизмеђу 14 14 ии 24 24 угљениковихугљениковихатомаатома. . МогуМогу битибити засићенезасићене илиилинезасићененезасићене. . ОдОд њиховењихове дужинедужинеии степенастепена незасићеностинезасићености зависизависиспепенспепен флуидностифлуидности мембранемембране((вишевише двострукихдвоструких везавеза = = већавећафлуидностфлуидност).).

PtdCho - Phosphatidylcholin; PtdEtn - Phosphatidylethanolamin; PtdIns - Phosphatidylinositol; PtdSer - Phosphatidylserin

ФосфолипидиФосфолипиди уу мембранамамембранамаУУ биолошкимбиолошким мембранамамембранама, , фосфолипидифосфолипиди сусу распоређенираспоређени уу видувиду двослојадвослоја иитото такотако дада сусу поларнеполарне, , хидрофилнехидрофилне ““главеглаве”” окренутеокренуте кака спољашњојспољашњој срединисрединиаа хидрофобнихидрофобни ““реповирепови”” кака унутраунутра..

MMоделодел помоћупомоћу којегкојег сесе мембранемембране описујуописују називаназива сесе флуиднофлуидно--мозаичкимозаички..БиолошкеБиолошке мембранемембране сесе могумогу посматратипосматрати ии каокао електричниелектрични кондензаторикондензаториприпри чемучему сусу: : проводниципроводници кондензаторакондензатора електролителектролит спољашњегспољашњег((ванћелијскогванћелијског) ) ии унутрашњегунутрашњег растворараствора ((цитоплазмацитоплазма). ). ПроводнициПроводници тогтогкондензаторакондензатора сусу раздвојенираздвојени диелектрикомдиелектриком ((којикоји представљапредставља липиднилипиднидвослојдвослој). ).

+

_

ванћелијскипростор

цитоплазма

МоделскеМоделске мембранемембранеФосфолипидиФосфолипиди уу воденомводеном растворураствору могумогу створитистворити формацијеформације мицеламицела иилипозомалипозома ((везикулавезикула).).

ЛипозомиЛипозоми ((фосфолипиднефосфолипидне везикулевезикуле) ) сеселаколако добијајудобијају убризгавањемубризгавањем растворарастворалипидалипида уу водуводу ((овакоовако добијамодобијамо стањестање којекојеодговараодговара минимумуминимуму ГибсовеГибсове енергијеенергије). ). СастојеСастоје сесе изиз једногједног илиили вишевише сфернихсфернихфосфолипиднихфосфолипидних двослојевадвослојева којикоји могумогу битибитираздвојенираздвојени воденомводеном срединомсредином..

-- пречникпречник липозомалипозома (60(60--400 400 nm)nm)-- дебљинадебљина липидноглипидног двослојадвослоја 6.56.5--7.57.5 nmnm-- растојањерастојање измеђуизмеђу слојеваслојева 1.51.5--22 nmnm

МицелеМицеле имајуимају самосамо једанједан, , сферичансферичан слојслојфосфолипидафосфолипида којикоји сусу поларнимполарним деломделом((главомглавом) ) окренутиокренути кака спољаспоља ((воденаводенасрединасредина), ), докдок сесе хидрофобнихидрофобни реповиреповисусрећусусрећу уу унутрашњостиунутрашњости мицелемицеле. . ДобијамоДобијамоихих изиз суспензијесуспензије вишеслојнихвишеслојних липозомалипозома којукојутретирамотретирамо ултраултра--звукомзвуком.. Вишеслојни липозом

МоделскеМоделске мембранемембранеУпотребаУпотреба липозомалипозома::-- уу липозомелипозоме јеје могућемогуће инкапсулиратиинкапсулирати различитеразличите типоветипове растворараствора..-- могумогу сесе користитикористити заза ""испорукуиспоруку" " лековалекова ии ензимаензима уу терапеутскетерапеутске сврхесврхе..ПримерПример јеје корићшењекорићшење липозомалипозома заза испорукуиспоруку контрастнихконтрастних агенасаагенаса уу CTCT ии MRIMRIдијагностицидијагностици..

КакоКако тото тачнотачно функционишефункционише? ? ЛипозомиЛипозоми имајуимају могућностмогућност дада сесе спојеспоје саса ћелијомћелијом ииизмешајуизмешају својсвој садржајсадржај саса унунуутарћелијскимтарћелијским медијумоммедијумом ((методеметоде заза циљнуциљну испорукуиспорукудодо појединихпојединих органаоргана сусу јошјош уу развојуразвоју).).ОвоОво јеје могућемогуће збогзбог амфипатичкеамфипатичке природеприроде фосфолипидафосфолипида. . ИмамоИмамо::-- јонскејонске интеракцијеинтеракције поларнеполарне главеглаве ии молекуламолекула водеводе-- хидрофобнехидрофобне интеракцијеинтеракције угљоводоничногугљоводоничног ланцаланца уу унутрашњостиунутрашњости двослојадвослојаНеполарниНеполарни деодео липозомалипозома спречаваспречава продорпродор ((ии излазакизлазак) ) јонајона ии осталихосталих поларнихполарнихентитетаентитета..

CT слика абдомена пса коме је дат јодинкапсулиран у липозоме (јод се овде користикао контраст јер га упијају Купферове ћелијејетре али не и ћелије тумора).

Фосфолипидне мембране као модели за испитивањеособина мембрана. Спонтано или индуковано

формирање фосфолипидног двослоја

ПланарнеПланарне мембранемембране ((black film)black film)

SUV (out-in 65-35%)

Липозоми (липидне везикуле)спонтано или сонификација

LUV (out-in 50-50%)Small or large

unilamellar vesicles

MLVMultilamellar vesicles

МултиламеларнеГолџијеве структуре

• Ове мембране добијамо намалим отворима дијаметра 1mmпотопљенима у воду.• Капљицу липида раствореног уалкохолу наносимо на отвор.• Како алкохол дифундује у водуствара се липидна опна.

Милерова метода:

ДинамикаДинамика мембранскихмембранских липидалипида

Термални покретихидрофобног дела

(уређеност унутрашњостимембране)

Трансверзално кретањелипида

(флип-флоп)

Латерално кретањелипида

(дифузија)

УУ мембранамамембранама постојепостоје тритри основнаосновна типатипа кретањакретања молекуламолекулафофсолипидафофсолипида. . МетодаМетода заза испитивањеиспитивање -- ЕПРЕПР..

ФазниФазни прелазипрелази липидалипида уумембранамамембранама

ЛипиднеЛипидне двослојнедвослојне мембранемембране сесе уу физиолошкимфизиолошким условимаусловима ннaaлазелазе уутечнотечно--кристалномкристалном стањустању..ОвоОво значизначи дада постојипостоји поредакпоредак уу узајамнојузајамној орјентацијиорјентацији ии положајуположајумолекуламолекула алиали јеје агрегатноагрегатно стањестање течнотечно. . СтационарниСтационарни периодпериод животаживота фосфолипидногфосфолипидног молекуламолекула износиизноси свегасвега1010--77--1010--88s.s.ТечниТечни кристаликристали сесе могумогу образоватиобразовати самосамо кодкод онихоних структураструктура којекојеимајуимају ""дугачкедугачке молекулемолекуле" (" (попречнепопречне димензиједимензије сусу знатнознатно мањемање ододузджнихузджних).).ТечноТечно--кристалнекристалне структуреструктуре сусу веомавеома осетљивеосетљиве нана променепроменетемпературетемпературе, , притискапритиска, , хемијскогхемијског саставасастава ии електричногелектричног пољапоља..ПриПри променипромени температуретемпературе биолошкихбиолошких мембранамембрана долазидолази додо фазногфазногпрелазапрелаза првогпрвог редареда..КадаКада хладимохладимо мембранемембране, , имамоимамо пралазакпралазак изиз течнотечно--кристалногкристалног уу гелгелстањестање..

ФазниФазни прелазипрелази липидалипида уумембранамамембранама

ДебљинаДебљина мембранемембране уу гелгел--фазифази јеје већавећа негонего уу уу фазифази течногтечногкристалакристала гдегде јеје затозато обимобим већивећи јерјер сесе повећаваповећава ии површинаповршина којукојузаузимајузаузимају молекулимолекули мембранемембране..ЗаЗа нормалнонормално функционисањефункционисање, , мембранамембрана морамора битибити уу течнотечно--кристалномкристалном стањустању..ТемператураТемпература фазногфазног прелазапрелаза гелгел--течнитечни кристалкристал зависизависи одод саставасаставамембранемембране ((варираварира одод --2020°°CC заза мембранемембране одод незасићенихнезасићених липидалипида додо+60+60°°CC заза мембранемембране одод засићенихзасићених липидалипида).).ОрганизмиОрганизми сесе адаптирајуадаптирају нана температурскетемпературске променепромене ((дисталнидистални деодеоногеноге јеленајелена имаима вишевише незасићенихнезасићених липидалипида одод деладела кака трупутрупу).).

МембранскеМембранске липиднелипидне фазнефазне транформацијетранформације сесенајчешћенајчешће меремере калориметријскикалориметријски иирендгеноструктурномрендгеноструктурном анализоманализом..ПриПри течнитечни кристалкристал--гелгел фазнимфазним прелазимапрелазима, , уулипидномлипидном двослојудвослоју долазидолази додо формирањаформирањатранспроводнихтранспроводних каналаканала пречникапречника 11--33nmnm крозкроз којекојесесе крозкроз мембранумембрану могумогу транспортоватитранспортовати јонијони иималимали молекулимолекули..ЗбогЗбог тогатога сесе нана температуритемператури фазногфазног прелазапрелазанаглонагло повећаваповећава јонскајонска проводљивостпроводљивост мембранемембране..ОвоОво можеможе спастиспасти ћелијућелију одод криогенихкриогених повредаповреда јерјердолазидолази додо повећаногповећаног испуштањаиспуштања водеводе ии солисоли изизћелијећелије ((онемогућаваонемогућава сесе кристализацијакристализација унутарунутарћелијећелије нана нискимниским температураматемпературама).).ПроменаПромена јонскејонске проводљивостипроводљивости изазиваизазивастварањестварање биопотенцијалабиопотенцијала ((нервнинервни импулсимпулс) ) којикојиносиноси информацијуинформацију оо променипромени температуретемпературе..

ФазниФазни прелазипрелази липидалипида уу мембранамамембранама

ПроменаПромена хемијскогхемијског саставасастава мембранемембране такођетакођеизазиваизазива фазнифазни прелезпрелез течнитечни кристалкристал--гелгел ((нпрнпр. . додатакдодатак јонајона CaCa+2 +2 доводидоводи додо његовењегове интеракцијеинтеракције сасанегативнонегативно наелектрисанимнаелектрисаним структурамаструктурама нанаповршиниповршини мембранемембране, , фазнефазне сепарацијесепарације ии прелазапрелаза).).

ПротеиниПротеини нана једномједном слајдуслајду ((подсећањеподсећање))Састоје се од 20 различитих аминокиселина, од којих је 8 есенцијалних (тело их не може произвести, препоручено је свакодневно узимање различитих намирница које садрже беланчевине).АК су у протеинима повезане пептидним везама (између карбоксилине и амино-групе) а њиховасеквенца је одређена генетским кодом (тј. распоредом трплета никлеотида који носе те АК тј. кодона).

Протеини поседују примарну, секундарну, терцијерну и квартенарну структуру.Редослед аминокиселина у појединим протеинима називамо примарном структуром.Просторна грађа протеинског ланца зове се секундарна структура протеина. Структура ланца можебити α-узвојница, β-набрана плоча, или неправилно клупко. Она је најчешће условљена водоничнимвезама. Најтипичнији протеин са конформацијом α-узвојнице је α-кератин, од којег је изграђена коса, нокти, рогови...Просторни распоред свих атома у молекулу неког протеина зове се терцијарна структура протеина. Тообухвата огранке алифатских и ароматских остатака.Квартерна структура протеина описује повезивање више пептидних ланаца у одређени молекул.Протеине можемо поделити и на скеропротеине, глобуларне протеине и протеинске комплексе.Скеропротеини су нерастворни у води, служе као потпорни елементи коштаног ткива, правилни сукончасти молекули, а карактеристични пример су колаген (везивно ткиво), и кератин (коса, нокти, перје).Глобуларни протеини растворни су у води, кугласти су молекули, а овде спадају протеини крвнеплазме, протеини беланца јајета и ензими.Протеински комплекси су грађени од протеинског дела и непротеинских или простетских група. У овугрупу спадају гликопротеини, липопротеини, фосфопротеини и металопротеини.

формирање пептидне везе енкодирање протеина

МембранскиМембрански протеинипротеиниКаоКао штошто јеје липиднилипидни двослојдвослој фундаменталнафундаментална структурнаструктурна јединицајединица уумембранамамембранама, , такотако мембранскимембрански протеинипротеини имајуимају скороскоро целокупнуцелокупну активнуактивнуфункцијуфункцију мембранемембране ((транспорттранспорт, , рецепторирецептори ...)....).

МембранскеМембранске протеинепротеине делимоделимо нана перифернепериферне ии интегралнеинтегралне..ПериферниПериферни протеинипротеинисусу глобуларниглобуларни протеинипротеини којикоји нене пролазепролазе крозкроз мембранумембрану ии саса њомњом најчешћенајчешћеинтереагујуинтереагују прекопреко електростатичкихелектростатичких интеракцијаинтеракција ии водоничнихводоничних везавеза. . ОдвајамоОдвајамоихих одод мембранемембране променомпроменом pHpH илиили третманомтретманом помоћупомоћу растворараствора солисоли..

ИнтегралниИнтегрални протеинипротеини поседујупоседујулатералнулатералну покретљивостпокретљивост

ИнтегралниИнтегрални протеинипротеинисусу интегрисаниинтегрисани уу липиднилипиднидвослојдвослој. . ПоседујуПоседују ии хидрофобнехидрофобнеии хидрофилнехидрофилне деловеделове тете могумогубитибити једнимједним деломделом уу мембранимембраниилиили пролазитипролазити крозкроз њуњу((трансмембранскитрансмембрански). ). УклањајуУклањају сесе помоћупомоћу детерџенатадетерџенатаилиили органскихорганских растварачарастварача((раскидањемраскидањем хидрофобниххидрофобних везавеза).).

СепарацијаСепарација ии детекцијадетекција протеинапротеина- Електрофореза- Изоелектрично фокусирање

ПринципПринцип електрофорезеелектрофорезеЗаснива се на миграцији наелектрисаних честица кроз раствор под дејствомелектричног поља.На честицу наелектрисања z која се налази у електричном пољу E делује сила:

F p = z EКретању честице се супротстаља сила трења Ft која је за сферне честицепропорционлна коефицијенту вискознасти раствора η, радијусу честице r ибрзини којом се она креће v.

Ft = 6 π η r vПовећавањем брзине честице се повећава и сила трења, тако да се посленеког времена успоставља равнотежа тако да је:

z E = 6 π η r vОдавде се види да покретљивост наелектрисаних честица (однос v/E) зависиод њихове величине и наелектрисања.

ЕлектрофорезаЕлектрофорезаТиповиТипови електрофорезеелектрофорезе::-- градијентнаградијентна гелгел електрофорезаелектрофореза-- нативнанативна дискдиск гелгел електофорезаелектофореза-- (SDS PAGE) (SDS PAGE) полиакриламидполиакриламид гелгел електрофорезаелектрофорезаИзборИзбор пуферапуфера::-- боратниборатни, , цитратницитратни, , EDTAEDTA сесе нене могумогу користитикористити ((правеправе комплексекомплексе илиилисесе везујувезују заза металнеметалне јонејоне).).-- користекористе сесе пуферскипуферски растворираствори нискениске проводљивостипроводљивости саса великимвеликимјонимајонима ии нискомниском електрофоретскомелектрофоретском покретљивпокретљивooшћушћу нпрнпр..HH--TRIS).TRIS).ЈачинаЈачина спољашњегспољашњег електричногелектричног пољапоља::-- потребанпотребан јеје стабиланстабилан изворизвор једносмернеједносмерне струјеструје (5(5--8 8 V/cm)V/cm)

ИзоелИзоел. . фокусирањефокусирање

2D 2D електрофорезаелектрофореза

ДетекцијаДетекција протеинапротеина

ВЕЖБА (ВИРТУЕЛНА) 1

ВЕЖБА (ВИРТУЕЛНА) 2

АсиметричностАсиметричност мембранемембранеМембранскиМембрански липидилипиди ии протеинипротеини показујупоказују латералнулатералну ии трансверзалнутрансверзалнуасиметријуасиметрију папа сусу онеоне -- асиметричнеасиметричне структуреструктуре..ЛатералнаЛатерална асиметријаасиметрија представљапредставља формирањеформирање липиднихлипидних иипротеинскихпротеинских кластеракластера уу равниравни мембранемембране..ЛипидиЛипиди честочесто формирајуформирају асиметричнеасиметричне кластерекластере каокао последицапоследицалатералнелатералне фазнефазне сепарацијесепарације ((примерпример саса CaCa+2+2).).ПротеиниПротеини такођетакође показујупоказују латералнулатералну мембранскумембранску асиметријуасиметрију. . ОниОни имајуимајупотребупотребу заза груписањемгруписањем уу кластерекластере радиради бржегбржег међуделовањамеђуделовања..

Протеински кластери бактеријеHalobacterium halobium

ТрансверзалнаТрансверзална асиметријаасиметрија мембранамембрана представљапредставља појавупојаву дада њенењенеособинеособине нисунису истеисте саса спољашњеспољашње ии унутрашњеунутрашње странестране ((битнобитно зазатранспорттранспорт, , деловањеделовање хормонахормона, , имунолошкеимунолошке реакцијереакције измеђуизмеђу ћелијаћелија ... )... )ПротеинскаПротеинска ии липидналипидна трансверзалнатрансверзална асиметријаасиметрија узрокујеузрокује различитразличитраспоредраспоред наелектрисаностинаелектрисаности спољашњостиспољашњости ии унутрашњостиунутрашњости мембранемембранештошто имаима утицајутицај нана мембранскимембрански потенцијалпотенцијал ((мењамења сесе пропустљивостпропустљивостјонскихјонских каналаканала ии активностактивност протеинапротеина).).

КакоКако сесе постижепостиже липидналипиднатрансверзалнатрансверзална асиметријаасиметрија??

ПротеиниПротеини -- нијеније тешкотешко схватитисхватити њиховуњихову асиметричностасиметричност алиали какокако остваритиостварити ииодржатиодржати асиметричностасиметричност заза липиделипиде ... ... требатреба лили енергијеенергије заза тото? ? УУ ћелијамаћелијама еукариотаеукариота фосфолипидифосфолипиди, , гликолипидигликолипиди ии холестеролхолестерол сесесинтетишусинтетишу помоћупомоћу ензимаензима којикоји сусу лоциранилоцирани уу ((илиили нана површиниповршини) ) ендоплазматичногендоплазматичног ретикулумаретикулума ((ЕРЕР) ) илиили ГолџијевогГолџијевог системасистема..ТранспортомТранспортом произведенихпроизведених фосфолипидафосфолипида, , гликолипидагликолипида ии холестеролахолестерола ододЕРЕР ии ГолџијаГолџија ((додо мембранамембрана уу ћелијићелији ии плазмаплазма мембранамембрана), ), управљајууправљају тзвтзв. . липидлипид--транспортнитранспортни протеинипротеини..СадаСада нана сценусцену ступајуступају флипазефлипазе. . ТоТо сусу протеинипротеини којикоји могумогу дада ""пребацепребаце" " фосфолипидфосфолипид саса једнеједне странестране двослојадвослоја нана другидруги..

ОвоОво скраћивањескраћивање флипфлип--флопфлоп временавремена радиради одржавањаодржавања трансверзалнетрансверзалнелипиднелипидне асиметричностиасиметричности захтевазахтева ЕЕ ((којакоја сесе добијадобија изиз ""АТАТPP--аа"").).

ОдвајањеОдвајање плазмаплазма мембранамембрана коренакорена кукурузакукуруза50 g исечених коренова хомогенизовано је у охлађеном авану помоћу тучка уз присуство 120 ml охлађеногпуфера. Пуфер коришћен у овом поступку састојао се из 250 mМ сахарозе, 3 mМетилендиаминтетрасирћетне киселине, 50 mМ Тris-HCl (pH 7.5), 1 mМ дитиотреитола и 10% (v/v) глицерола. Хомогенат је затим филтриран кроз четири слоја газе и центрифугиран на 12000 g 10 минута. Супернатант језатим центрифугиран на 100000 г 30 минута. Микрозомална фракција у натанту се затим испира пуфером запрање (2 mМ Трис-HCl, pH 7.5; 250 mМ сахароза, 10% v/v глицерол) и затим центрифугира на 100000 g 30 минута. Испрани микрозоми се затим суспендују у 3 мл фазног пуфера (5 мМ К-фосфатни пуфер, pH 7.8; 330 mМ сахароза; 3 mМ KCl) за одвајање плазма мембрана у двофазном систему по Ларсону. За фазно одвајање, 3 g микрозома се суспендује да би се направило 12 g двофазног система који садржи 6.5% (v/v) декстрана Т500, 6.5% (v/v) полиетиленгликола 335, 330 mМ сахарозе, 3 mМ KCl, 5 mМ К2HPO4, pH 7.8. Кивете се мешајуинверзијом 30-40 пута и центрифугирају 5 минута на 1500 g. Приближно 90% горње фазе се сакупља инаноси на свежу доњу фазу. Ова процедура се понавља три пута и коначна горња фаза (U3 фракција) серазблажује са 10 запремина пуфера за прање и центрифугира на 100000 g 30 минута. Резултујући натант којисадржи пречишћене плазма мембране ресуспендује се у одговарајућем пуферу за прање да би се добилаконачна концентрација од 2-3 mg протеина по милилитру. Овако добијене мембране се одмах користе или сечувају на -60°C.

ОдвајањеОдвајање ћелијскихћелијских органелаорганела ((нпрнпр..митохондријамитохондрија))Изолација митохондрија се заснива на њиховој величини (једино је једро веће од њих). И овде је основнипринцип диференцијално центрифугирање хомогенизованог ткива. Веома је тешко издвојити баш чистемитохондрије тако да се издваја митохондријална фракција што значи да је у систему највишемитохондрија (али има и других органела као што су лизозими, делови ћелије, језгра, пероксизоми ... ). Процедура: самељу се нпр. јетра, срце, мишићи, мозак ... спанаћ, авокадо ... (измрве се у авану, наравно, претходно се узорак прелије течним азотом). Стави се то у пуфер (обично сахарозни). Хомогенизовати све ублендеру да се ћелије растуре и испусте свој садржај у пуфер. Центрифугирати на малим брзинама (1200 г) при чему се спуштају тежи делови (ћелијски фрагменти, једра ...). Супернатант затим центифуфирамо навећим брзинама (26000 g .. овде се таложе мало лакше ствари као што су митохондрије). Одвојимо талог, иставимо га у пуфер, опет се центруфугира на великим брзинама (25000 g), одвоји се талог у коме су садарелативно чисте митохондрије. Иначе, све се ради на 2-4°C

Вежба - одвајање митохондрија и плазма мембрана корена кукуруза:)

ФИЗИКАЛИСАЊЕ

ТранспортТранспорт крозкроз мембранумембрануМожеМоже сесе класификоватикласификовати премапрема величинивеличини честицачестица којекоје сесе транспортујутранспортују::-- макротранспортмакротранспорт ((великевелике количинеколичине растворараствора, , комплексикомплекси, , малемале ћелијећелије))-- микротранспортмикротранспорт ((јонијони, , малимали молекулимолекули, , макромолекулимакромолекули) )

МакротранспортМакротранспортОбухватаОбухвата тритри типатипа процесапроцеса: : ендоцитозуендоцитозу ((ћелијећелије увлачеувлаче честицечестице), ), егзоцитозуегзоцитозу ((ћелијећелије избацујуизбацују честицечестице), ), транзицитозутранзицитозу ((кадакада сесе нана једнуједнучестицучестицу првопрво применипримени ендоендо-- папа егзоцитозаегзоцитоза).).-- ФагоцитозаФагоцитоза јеје посебанпосебан обликоблик ендоцитозеендоцитозе кодкод когакога имунокомпетентнеимунокомпетентнећелијећелије ((нпрнпр. . макрофагемакрофаге) ) једуједу ии уништавајууништавају вирусевирусе, , мртвемртве ћелијећелије ......

ендоцитоза

егзоцитоза два типа егзоцитозе

конститутивна(нерегулисана)

секреција

регулисанасекреција

("окидач" јенеки сигнал)

МикротранспортМикротранспортМожеМоже сесе класификоватикласификовати премапрема енергијиенергији којакоја јеје потребнапотребна дада биби сесе ононоствариоостварио. . ПремаПрема тометоме постојипостоји::1)1) ПасивниПасивни транспорттранспорт: : увекувек идеиде уу смерусмеру концентрационгконцентрационг градијентаградијента ((одод вишевишекака нижимнижим концентрацијамаконцентрацијама)),, последицапоследица јеје дифузиједифузије, , нене трошитроши ЕЕ јерјер јеје увекувекΔΔG<0 iG<0 i ΔΔS>0.S>0. ПасивниПасивни транспорттранспорт сесе можеможе реализоватиреализовати каокао::-- простапроста дуфузијадуфузија-- олакшанаолакшана дифузијадифузија2) 2) АктивниАктивни транспорттранспорт: : увекувек идеиде насупротнасупрот концентрациономконцентрационом градијентуградијенту, , тражитражиутрошакутрошак енергијеенергије папа јеје тото процеспроцес кодкод когакога јеје ΔΔG>0 iG>0 i ΔΔS<0.S<0.

ПростаПроста дифузијадифузија уу биолошкимбиолошким системимасистемимаПроста дифузија у биолошким системима и није толико "проста" с обзиром на њиховунехомогеност и анизотропност.Микротранспорт се у ћелијским мембранама обавља кроз липидни матрикс тј.: липидни двослој, порама и јонским каналима (одређени типови протеина).Пошто се сматра да је димензија ћелије знатно већа од димензија честица коједифундују, дифузију можемо описати 1 Фиковим законом:

Jx = - D (dС/dx)

Jx = дифузиони флукс (1/m2s), број молекула који пролазе кроз јединицу површине ујединици времена (у правцу x-осе)D = коефицијент дифузије (m2/s)dC = промена концентрације честица (mol/m3)dx = промена дужине (m)Негативан знак се јавља пошто се транспорт врши у смеру опадајуће концентрације. D зависи од P, T и састава средине.Промену концентрације услед дифузије са растојањем и временом дефинише 2 Фиков закон:

(∂C/∂t)x = D (∂2C/∂x2)t

ПростаПроста дифузијадифузија крозкроз мембранемембране

УколикоУколико сусу молекулимолекули изиз цитосолацитосола илиили спољашњегспољашњег медијумамедијумалипосолубилнилипосолубилни ониони могумогу дифундоватидифундовати саса једнеједне нана другудругу странустрану мембранемембране((маснемасне киселинекиселине, , алкохолиалкохоли ...)....).МолекулиМолекули којикоји нисунису липосолубилнилипосолубилни илиили сусу наелектрисанинаелектрисани ((нпрнпр. . аминоаминокиселинекиселине) ) тешкотешко дифундијудифундију крозкроз мембранумембрану..МембранеМембране различитихразличитих ћелијаћелија имајуимају различитеразличите вредностивредности дифузионихдифузионихкоефицијенатакоефицијената D.D.

ПростаПроста дифузијадифузија -- OOсмозасмоза

ОсмозаОсмоза јеје специјаланспецијалан случајслучај простепросте дифузиједифузије којакоја сесе одиграваодиграва ууслучајевимаслучајевима кадакада сусу двадва растворараствора различитихразличитих концентрацијаконцентрација одвојениодвојениселективномселективном мембраноммембраном ((полупропустљиваполупропустљива мембранамембрана))..СелективнаСелективна мембранамембрана јеје онаона којакоја имаима особинуособину дада допуштадопушта дифузијудифузијумолекуламолекула растварачарастварача алиали нене ии молекуламолекула растворкарастворка..УколикоУколико јеје концентрацијаконцентрација растворкарастворка већавећа уу једномједном негонего уу дугомдугом делуделу тадатадарастварачрастварач крозкроз мембранумембрану прелазипрелази уу деодео саса већомвећом концентрацијомконцентрацијом такотако дада: :

ΔΔG<0 G<0 ии ΔΔS>0S>0ОвајОвај процеспроцес сесе зовезове директнадиректна осмозаосмоза

ОсмоцкиОсмоцки притисакпритисакУколикоУколико саса дведве странестране полупропустљивеполупропустљиве мембранемембране имамоимамо двадва расворарасвораразличитихразличитих концентрацијаконцентрација догодићедогодиће сесе осмозаосмоза ((прелазакпрелазак водеводе изиз једногједног уудругидруги компартменткомпартмент).).ХидростатичкиХидростатички притисакпритисак којикоји вршиврши водавода нана мембранумембрану уу растворурастворуконцентацијеконцентације СС нана температуритемператури ТТ зовезове сесе осмоцкиосмоцки притисакпритисак..ОсмоцкиОсмоцки притисакпритисак описујеописује ВантВант--ХофовХофов законзакон којикоји гласигласи::

∏∏=C=CMMRTRT∏∏ -- осмоцкиосмоцки притисакпритисакCCMM -- моларнамоларна концентрацијаконцентрација растворараствораRR -- универзалнауниверзална гаснагасна константаконстантаTT -- температуратемпература растворараствора

ОсмоцкиОсмоцки притисакпритисак биолошкихбиолошкихрастворараствора једнакједнак јеје осмоцкомосмоцкомпритискупритиску стандардногстандардног растворараствора ((зовезовесесе ии физиолошкифизиолошки растворраствор) ) којикоји сесесастојисастоји одод: 0.145 : 0.145 ММ NaClNaCl, , нана pH=7, pH=7, нанасобнојсобној температуритемператури..

РаствориРаствори саса истимистим осмоцкимосмоцкимпритискомпритиском сусу изотоничниизотонични, , нижимнижимпритискомпритиском ((ии нижомнижом концентрацијомконцентрацијом) ) хипотоничнихипотонични илиили хипертоничнихипертонични ((сасавишомвишом концентрацијомконцентрацијом).).

Еритроцити потопљени у растворе различитог осмоцког притиска

КакоКако сесе ћелијаћелија штитиштити одод осмозеосмозе??

ЋелијскаЋелијска мембранамембрана јеје пропуснапропусна заза молекулемолекуле водеводе, , јонејоне ии малемале молекулемолекуле аанепропуснанепропусна јеје заза макромолекулемакромолекуле..АлиАли, , ћелијскаћелијска мембранамембрана јеје вишевише пропуснапропусна заза водуводу негонего заза јонејоне којикоји сусу чакчакмањимањи одод њенихњених колекулаколекула. . КакоКако тото??УУ мембранимембрани постојепостоје посебнипосебни ""водениводени" " каналиканали којикоји сесе користекористе искључивоискључиво зазатранспорттранспорт водеводе. . ОниОни сесе зовузову аквапориниаквапорини. . ВеомаВеома сусу специфичниспецифични заза молекулемолекуле водеводе ии нене пропуштајупропуштају чакчак нини протонепротоне!!

Аквапорин

ДаДа биби сесе заштитилазаштитила одод пуцањапуцања збогзбогосмозеосмозе, , уу ћелијићелији постојипостоји јошјош једанједан видвидтранспортатранспорта..ОнОн јеје задужензадужен дада ""избацујеизбацује" " јонејоне изиз ћелијећелијеии обављајуобављају гага јонскејонске пумпепумпе..ОвајОвај процеспроцес захтевазахтева утрошакутрошак енергијеенергије јерјерсесе одвијаодвија насупротнасупрот концентрационогконцентрационогградијантаградијанта ((бићебиће речиречи каснијекасније).).СледећиСледећи типтип пасивногпасивног транспортатранспорта јејеолакшанаолакшана дифузијадифузија..

ОлакшанаОлакшана дифузијадифузијаЈони као што су (Na+, K+, Cl-) и мали молекули (нпр. глукоза) се тешко растварју улипидном двослоју. Aли они ипак веома успешно пролазе кроз мембрану. Како то?Ово им омогућава посебан вид транспорта који се назива олакшан транспорт (тј. олакшана дифузија).Овакав вид транспорта се одвија у смеру концентрационог градијента.Слично простој дифузији, олакшана дифузија је егзоенергијски процес јер је ΔG<0,ΔS>0.Насупрот простој дифузији, олакшана дифузија се одвија путем специфичнихканала и протеина носача који су уграђени у мембрану.У зависности од врсте коју треба пренети кроз мембрану постоје два основна типаолакшаног транспорта: каналима и носачима

транспорт каналима транспорт носачима

ТранспортТранспорт каналимаканалимаКаналиКанали сусу трансмембранскитрансмембрански протеинипротеини којикоји сесе користекористе заза транспорттранспорт малихмалих јонајона иимолекуламолекула каокао штошто сусу: : NaNa++, K, K++, , ClCl--, Ca, Ca+2+2, H, H22OO..ОвеОве протеинскепротеинске структуреструктуре поседујупоседују дведве конформацијеконформације ((отварањеотварање ии затварањезатварање) ) којекоје сесеактивирајуактивирају хемијскимхемијским, , електричнимелектричним, , механичкиммеханичким илиили светлоснимсветлосним путемпутем..ПостојеПостоје ендогениендогени јонскијонски каналиканали ((транспортујутранспортују сопственесопствене јонејоне ии молекулемолекуле) ) ии егзогениегзогенијонскијонски каналиканали ((којикоји убацујуубацују молекулмолекулee ии јонејоне уу другедруге мембранемембране).).

ПримерПример егзогеногегзогеног кк.:.: СекрецијаСекреција грамицидинскогграмицидинског AA --јонскогјонског каналаканала одод странестране бактеријебактерије Bacillus Bacillus brevisbrevis

-- ГрамицидинскиГрамицидински каналканал јеје димердимер, , трансмембранскитрансмембранскипротеинпротеин којикоји сесе састојисастоји изиз двадва ββ--хеликсахеликса. .

-- ДозвољаваДозвољава несметаннесметан протокпроток јонајона NaNa++ ии КК++ ((наравнонаравно, , низниз концентрациониконцентрациони градијентградијент)),, алиали нене ии CaCa+2+2..

-- УколикоУколико сесе грамицидинскиграмицидински каналканал убациубаци уу мембранумембрануциљнециљне ћелијећелије, , бришебрише јојјој сесе електрохемијскиелектрохемијскиградијентградијент ии ћелијаћелија умиреумире..

-- ГрамицидинГрамицидин сесе нана овајовај начинначин понашапонаша каокаоантибиотикантибиотик, , хемијскохемијско оружјеоружје противпротив другихдругихкомпетитивнихкомпетитивних ћелијаћелија..

-- НаНа сличансличан начинначин ((формирањемформирањем порапора уу другимдругимћелијамаћелијама) ) функционишуфункционишу ии NistatinNistatin ии amfotericinamfotericin BB((лековилекови противпротив гљивицагљивица).).

3Д моделграмицидинског канала

ТранспортТранспорт носачиманосачимаМалиМали молекулимолекули каокао штошто сусу некинеки шећеришећери ((глукозаглукоза, , фруктозафруктоза, , манозаманоза) ) каокао ии аминоаминокиселинекиселине нене могумогу проћипроћи крозкроз мембранумембрану јерјер нисунису липосолубилнилипосолубилни..ИпакИпак, , ониони ((каокао ии некинеки јонијони) ) сесе крозкроз плазмаплазма мембранумембрану могумогу транспортоватитранспортоватипомоћупомоћу специфичнихспецифичних носачаносача којикоји сесе зовузову унипортериунипортери..ИИ овајовај транспорттранспорт сесе вршиврши низниз концентрациониконцентрациони градијентградијент такотако дада ии даљедаље важиважи дадајеје: : ΔG<0 и ΔS>0.Унипортери - полипептиди или протеински молекули носачи, веома суспецифични за одеђену врсту молекула или јона које треба да пренесу.Унипортери подлежу конформационим променама, вежу молекул са једне иослободе га на другу страну.Као у случају канала и овде постоје: ендогени и егзогени носачи.

ПримерПример егзогеногегзогеног носачаносача:: СекрецијаСекреција antibiotikaantibiotikaваниломицинаваниломицина изиз бактеријебактерије StreptomycesStreptomycesfulvissimusfulvissimus..-- ОвајОвај носачносач јеје хидрофобанхидрофобан тете сесе лаколако убацујеубацује уумембранемембране циљнихциљних ћелијаћелија ии туту сесе користикористи зазатранспорттранспорт јонајона КК++ ванван ћелијећелије ((заза когакога јеје знатнознатноспецифичнијиспецифичнији негонего заза јонејоне NaNa++).).

Ваниломицинпринцип рада

СС обзиромобзиром нана конформационеконформационе променепромене молекуламолекула носачаносача, , очигледноочигледно јеје дада јејепроцеспроцес преношењапреношења носачиманосачима знатнознатно споријиспорији одод каналскогканалског (10(1022 --101044 уу односуодносу нана101077 --101088 јонајона/s)/s)

ТранспортТранспорт носачиманосачимаПримерПример ендогеногендогеног ннooсачасача: : GLUT1GLUT1 -- носачносач глукозеглукозе уу мембранамамембранама еритроцитаеритроцита..ИмаИма дведве конформацијеконформације. . ЈеднаЈедна кадакада вежевеже молекулмолекул глукозеглукозе саса спољнеспољне странестранемембранемембране ии дугадуга кадакада гага ослободеослободе уу ћелијућелију..ИакоИако сесе глукозаглукоза крозкроз мембранумембрану константноконстантно уносиуноси уу ћелијућелију еритроцитаеритроцита онаона сесеунутраунутра нене акумулираакумулира јерјер сесе брзобрзо трансформишетрансформише уу глукозуглукозу 6 6 фосфатфосфат..ЗбогЗбог овоговог GLUT1GLUT1 константноконстантно функционишефункционише..ТребаТреба рећирећи дада сусу DD-- галактозагалактоза ии DD-- манозаманоза шећеришећери којикоји сесе такођетакође ((алиали сасамањиммањим афинитетомафинитетом) ) могумогу везативезати заза активнаактивна местаместа GLUT1 GLUT1 ии представљајупредстављајукомпетентекомпетенте глукозиглукози. .

GLUT1 GLUT1 дефицијентнидефицијентни синдромсиндром јеје узрочникузрочник многихмногих обољењаобољења каокао штошто сусу:: микроцефалиамикроцефалиа ((маламалаглаваглава), ), абнормалниабнормални мишићнимишићни спазмиспазми, , атаксијаатаксија ((отежанаотежана координацијакоординација покретапокрета), ), дисартријадисартрија((отежанотежан говорговор), ), летаргијалетаргија ((безвољностбезвољност), ), главобољеглавобоље, , тиковитикови, , неконтролисанинеконтролисани покретипокрети очимаочиманарочитонарочито препре јелајела..

Принцип рада GLUT1 носача

ОсновнеОсновне карактеристикекарактеристикеолакшанеолакшане дифузиједифузије

ШтаШта смосмо додо садасада научилинаучили::

-- ОбаОба типатипа олакшаноголакшаног транспортатранспорта ((каналимаканалима ии носачиманосачима) ) сесе одигравајуодигравајупасивнопасивно ((безбез утрошкаутрошка енергијеенергије) ) ии вођенивођени сусу концентрационимконцентрационим илиилиелектричнимелектричним градијентомградијентом..

-- БрзинаБрзина олакшанеолакшане дифузиједифузије знатнознатно јеје већавећа негонего простепросте дифузиједифузије..

-- ОбаОба типатипа олакшанеолакшане дифузиједифузије сусу веомавеома специфичниспецифични заза врстеврсте којекоје сесепреносепреносе крозкроз мембранумембрану..

-- БрзинаБрзина олакшаноголакшаног транспортатранспорта лимитираналимитирана јеје бројембројем каналаканала илиили носачаносачакојикоји сусу специфичниспецифични заза датудату врстуврсту..

-- ПостојањеПостојање компетицијекомпетиције измеђуизмеђу жељенежељене ии сличнихсличних врставрста додатнододатно смањујесмањујебрзинубрзину транспортатранспорта циљнихциљних молекуламолекула илиили јонајона..

-- ОбаОба типатипа транспортатранспорта могумогу битибити блокираниблокирани инхибиторимаинхибиторима..

АктивниАктивни транспорттранспортЖивеЖиве ћелијећелије, , дада биби нормалинонормалино моглемогле дада функционишуфункционишу, , морајуморају дада одржавајуодржавајуоптималнеоптималне концетрацијеконцетрације јонајона уу свомсвом цитосолуцитосолу ((којекоје сесе честочесто разликујуразликују уу односуодносу нанаспољашњуспољашњу срединусредину).).ОвакваОваква прерасподелапрерасподела концентацијаконцентација јонајона честочесто нијеније уу складускладу саса електричнимелектричним илиилихемијскимхемијским градијентомградијентом..ЗбогЗбог тогатога постојепостоје специфичниспецифични биолошкибиолошки механизмимеханизми којекоје транспортујутранспортују јонејоне насупротнасупротелектрохемијскогелектрохемијског градијентаградијента..ОвакавОвакав типтип транспортатранспорта називаназива сесе активниактивни транспорттранспорт..ЗаЗа активниактивни транспорттранспорт важиважи дада јеје ΔG>0 и ΔS<0.ДаДа биби овакавовакав видвид транспортатранспорта могаомогао дада сесе одриграваодриграва потребанпотребан јеје утрошакутрошак енергијеенергије. . ОвуОву енергијуенергију обезбеђујеобезбеђује ћелијаћелија уу видувиду АТАТPP--аа..ПостојиПостоји примарнипримарни ии секундарнисекундарни активниактивни транспорттранспорт ((вођенвођен концентрационимконцентрационимградијентимаградијентима насталихнасталих каокао последицапоследица примарногпримарног транспортатранспорта).).

ВећинаВећина ћелијаћелија користикористи чакчак 1/3 1/3 својихсвојих резервирезерви АТАТPP--аа дада биби одржалеодржале активниактивни транспорттранспорт..НеурониНеурони користекористе чакчак 3/4 3/4 својихсвојих резервирезерви ATPATP--аа заза активниактивни транспорттранспорт..

АТP3Д структура ПримарниПримарни ии

секундарнисекундарниактивниактивнитранспорттранспорт

ДаДа сесе подсетимоподсетимо: : синтезасинтеза АТАТPP--аа

КакоКако ии гдегде сесе дешавадешава синтезасинтеза АТАТPP--аа ? ? АТАТPP сесе можеможе правитиправити уу различитимразличитим процесимапроцесима: : -- ћелијскећелијске респирацијереспирације ((изиз шећерашећера уу процесупроцесу гликолизегликолизе ии циклусуциклусу лимунскелимунскекиселинекиселине тјтј. . оксидатвнеоксидатвне фосфорилацијефосфорилације).).-- бетабета оксидацијиоксидацији ((изиз мастимасти, , маснихмасних киселинакиселина).).-- анаеробнојанаеробној респирацијиреспирацији ((кодкод прокариотапрокариота безбез присустваприсуства кисеоникакисеоника).).-- уу процесупроцесу фотосинтезефотосинтезе ......АТАТPP сесе кодкод еукариотаеукариота којикоји нене вршеврше фотосинтезуфотосинтезу правиправи уу митохондријамамитохондријама уупроцесупроцесу ћелијскећелијске респирацијереспирације ((оксидативнеоксидативне фосфорилацијефосфорилације).).КодКод биљакабиљака АТАТPP сесе правиправи уу тилакоиднимтилакоидним мембранамамембранама хлоропластахлоропласта уупроцесупроцесу фотосинтезефотосинтезе ((процеспроцес фосфорилацијефосфорилације).).УУ процесупроцесу синтезесинтезе АТАТPP--аа ћелијаћелија користикористи простепросте ии комплекснекомплексне шећерешећере иимастимасти каокао изворизвор енергијеенергије, , разноврснеразноврсне ензимеензиме, , носаченосаче, , пумпепумпе ......

МитохондријеМитохондрије кодкод еукариотаеукариота заузимајузаузимају окооко 1/4 1/4 запреминезапремине ћелијећелије..ЈеданЈедан молекулмолекул глукозеглукозе можеможе произвестипроизвести 36 36 молекуламолекула АТАТPP--аа..

Процес синтезе АТP-а Хемиосмоза

ПримарниПримарни активниактивни транспорттранспортОсновнаОсновна својствасвојства примарногпримарног активногактивног транспортатранспорта сусу::-- ендоенергијскиендоенергијски јеје процеспроцес ((ΔΔGG>0>0))-- нене постојипостоји кодкод мртвихмртвих ћелијаћелија-- температурскитемпературски јеје зависанзависан ((знатнознатно вишевише одод пасивнепасивне дифузиједифузије))-- можеможе битибити смањенсмањен помоћупомоћу метаболичкихметаболичких инхибитораинхибитора ((цијанидимацијанидима, , азидимаазидима ...) ...) илиили хипоксијомхипоксијом ((смањенимсмањеним присуствомприсуством кисеоникакисеоника).).-- можеможе битибити инхибиранинхибиран специфичнимспецифичним инхибиторимаинхибиторима каокао штошто сусукардиотоничникардиотонични стериодистериоди ((великогвеликог сусу афинитетаафинитета премапрема јонскимјонским пумпамапумпама).).ЈонскеЈонске пумпепумпе, , каокао специфичниспецифични биолошкибиолошки процесипроцеси којикоји сусу одговорниодговорни зазапумпањепумпање јонајона ((нпрнпр. . NaNa++ ии KK++), ), заснивајузаснивају својсвој радрад нана активномактивном транспортутранспорту((примерпример: : NNаа++//KK++ АТАТPP--азнаазна пумпапумпа). ).

ВећВећ дужедуже временавремена јеје познатопознато дада кардиотоничникардиотонични стероидистероиди ouabainouabain ии digitoxigenindigitoxigeninповећавајуповећавају снагуснагу срчаногсрчаног мишићамишића. . КардиотоничниКардиотонични стероидистероиди сесе клиничкиклинички користекористе зазатретмантретман престанкапрестанка радарада срцасрца. .

Активни транспортПасивни транспорт

NNаа++//KK++ пумпапумпаПостојиПостоји неколиконеколико типоватипова јонскихјонских пумпипумпи одод којихкојих јеје NNаа++//KK++ АТАТPP--азнаазна једнаједна ододнајважнијихнајважнијих заза ћелијућелију..NNаа++//KK++ АТАТPP--азааза јеје интегралниинтегрални мембранскимембрански протеинпротеин којикоји обављаобавља активниактивнитранспорттранспорт NNаа++ ии KK++ јонајона узуз хидролизухидролизу АТАТPP--аа::

ATP+HATP+H22O O → ADP+P+HADP+P+H++

ОвајОвај ензимензим ((NNаа++//KK++ АТАТPP--азааза) ) јеје уу ствариствари једнаједна маламала молекулскамолекулска машинамашина којакојапумпапумпа тритри јонајона NNаа+ + ванван ии двадва јонајона KK++ уу ћелијућелију попо једномједном циклусуциклусу..ЈеданЈедан циклкусциклкус NNаа++//KK++ пумпапумпа обавиобави самосамо заза 1010 ms.ms.УкупнаУкупна реакцијареакција којакоја описујеописује NNаа++//KK++ АТАТPP--азнуазну пумпупумпу јеје::

3Na+унутра+2K+

споља+ATPунутра →3Na+споља+2K+

унутра+ADPунутра+Pунутра+∆Gунутра

∆G - Гибсова слободна енергија реакције која износи 50 кЈ/mol

ПоштоПошто уу свакомсваком циклусуциклусу пумпапумпа истовременоистовремено транспортујетранспортује јонејоне NNаа++ ванван аа јонејоне KK++

уу цитосолцитосол, , овајовај системсистем преносапреноса сесе зовезове антипортниантипортни системсистем илиили антипортерантипортер..УколикоУколико сесе двадва различитаразличита јонајона транспортујутранспортују уу истомистом правцуправцу тото јеје симпортнисимпортнисистемсистем илиили симпортерсимпортер докдок акоако сесе самосамо једанједан типтип јонајона транспортујетранспортује уу једномједномсмерусмеру тото јеје унипортниунипортни системсистем илиили унипортерунипортер, , носачносач..

ЗбогЗбог концентрационогконцентрационог односаодноса транспортованихтранспортованих јонајона одод [[NNаа++]]//[[KK++]] = 3/2 = 3/2 оваова пумпапумпаимаима електрогеничкиелектрогенички карактеркарактер, , тјтј. . доприносидоприноси електричнојелектричној поларизацијиполаризацији мембранемембране((укупноукупно сесе вишевише позитивнихпозитивних јонајона избацујеизбацује ванван).).

ПостојиПостоји неколиконеколико типоватипова NNаа++//KK++ АТАТPP--азааза алиали имим јеје заједничкозаједничко дада сусу свесвесастављенесастављене одод двадва типатипа протеинапротеина: : αα ии ββ подјединицаподјединица..αα подјединицеподјединице сусу састављенесастављене одод 10 10 трансмембранскихтрансмембранских хеликсахеликса којикојиделимичноделимично штрчештрче уу цитоплазмичнуцитоплазмичну областобласт ((цитосолцитосол). ). ЗаЗа тајтај((каталитичкикаталитички активниактивни) ) деодео сесе везујевезује P P изиз АТАТPP дајућидајући ААDPDP ((тјтј. . АТАТPP гагафосфорилишефосфорилише аа самсам сесе хидролизујехидролизује).).ββ подјединицаподјединица јеје једнаједна трансмембранскатрансмембранска структураструктура којакоја делимичноделимичноштрчиштрчи ванван мембранемембране. . СврхаСврха јојјој јеје дада помажепомаже кретањукретању αα подјединицаподјединица. . НекеНеке NNаа++//KK++ АТАТPP--азеазе имајуимају ии малумалу γγ подјединицуподјединицу којакоја учествујеучествује ууензимскојензимској регулацијирегулацији пумпепумпе..

NNаа++//KK++ пумпапумпа

Na/K пумпаNa/K пумпа видео

ФункционисањеФункционисање NNаа++//KK++ АТАТPP--азеазе базиранабазирана јеје нана њенојњеној могућностимогућности дада доживидоживицикличнецикличне конформационеконформационе променепромене захваљујућизахваљујући енергијиенергији изиз АТАТPP--аа..ОвуОву серијусерију сукцесивнихсукцесивних конформационихконформационих променапромена можемоможемо описатиописати прекопрекодвадва стањастања: : стањстањaa високогвисоког афинитетаафинитета заза NNаа++ илиили ПИНГПИНГ,, ии стањстањaa високогвисокогафинитетаафинитета заза КК++ илиили ПОНГПОНГ..

ПингПинг--понгпонг ((NNаа++//KK++ пумпапумпа))

ФункционисањеФункционисање NNаа++//KK++ АТАТPP--азеазе ствараствара мембранскимембранскипотенцијалпотенцијал одод 5050--70 70 mV.mV.

Jens Jens SkouSkou jeje 1997. 1997. годинегодине добиодобио НобеловуНобеловунаградунаграду заза хемијухемију збогзбог открићаоткрића какокакофункционишуфункционишу јонскејонске пумпепумпе..

ДругеДруге јонскејонске пумпепумпе ((АТАТPP--азеазе PP--типатипа))У плазма мембранама и мембранама ћелијских органела можемо наћи јошпуно различитих јонских пумпи: H+,K+ ATP-aзе, Ca2+ ATP-aзe, K+ ATP-aзe, H+ ATP-aзe, ... као и протонске пумпе које активира светлост.H+,K+ ATP-aзе се могу наћи у мембранама ткива која облажу унутрашњостжелуца и служе да одржавају веома ниску pH желудачног сока. Једначинакоја описује кинетику деловања овог антипортера је:

nH+унутра+nK+

споља+ATPунутра →nH+споља+nK+

унутра+ADPунутра+Pунутра+∆Gунутра

Ca2+ ATP-aза одржава ниску концентрацију Ca+2 у ћелији (0.1µМ) која јепотребна за пренос спољашњих сигнала у ћелију путем пасивне дифузијеCa+2 (која прати специфичне хемијске и физичке окидаче).

Ca ATP-aза

Ca2+ ATP-aзаструктура

Ca ATP-aза

2Ca2+унутра+ATPунутра →2Ca2+

споља+ADPунутра+Pунутра+∆Gунутра

ДругеДруге јонскејонске пумпепумпе ((АТАТPP--азеазе FF--типатипа))ПосебноПосебно јеје занимљивазанимљива HH++ ATPATP--aaзаза којакоја сесе можеможе наћинаћи кодкод бактеријабактерија(Halobacterium halobium,(Halobacterium halobium, Escherichia coli), Escherichia coli), митохондријамамитохондријама, , хлорпластимахлорпластима..ОнаОна користикористи илиили енергијуенергију фотонафотона (Halobacterium halobium) (Halobacterium halobium) илиили ATPATP--aa(Escherichia coli)(Escherichia coli) дада биби транспортовалатранспортовала HH++--јонејоне ванван ћелијећелије ((насупротнасупротконцентрациономконцентрационом градијентуградијенту).).КаоКао резултатрезултат насталогнасталог протонскогпротонског градијентаградијента добијадобија сесе изворизвор енергијеенергије којикојисесе можеможе искориститиискористити заза синтезусинтезу ATPATP--aa уу митохондријамамитохондријама (Halobacterium (Halobacterium halobium) halobium) илиили заза вршењевршење механичкогмеханичког радарада (Escherichia coli)(Escherichia coli)..ЗанимљивоЗанимљиво јеје дада оваова пумпапумпа, , којакоја првопрво служислужи заза избацивањеизбацивање HH++--јонајона, , можеможерадитирадити ии уу обрнутомобрнутом смерусмеру ((каокао АТАТPP синтазасинтаза). ).

H+ ATP-aза H+ ATP-aза као ATP синтаза

ПостојеПостоје ии ATPATP--aaзезе VV--типатипа ((вакуоларневакуоларне) ) којекојеистоисто преносепреносе протонепротоне ииснижавајуснижавају pHpH кодкод многихмногихорганизамаорганизама ((подврстаподврста сусуATPATP--aaзаза PP--типатипа алиали јошјошнијеније познатопознато тачнотачно дододетаљадетаља какокако радераде). ).

ПредстављајуПредстављају читавучитаву фамилијуфамилију АТРАТР -- зависнихзависних траспортератраспортера којикоји служеслуже зазатранспорттранспорт: : аминоамино--киселинакиселина, , пептидапептида, , протеинапротеина, , металнихметалних јонајона, , липидалипида иидругихдругих хидрофобниххидрофобних супстанцијасупстанција ванван ћелијећелије ((насупротнасупрот концконц. . градијентуградијенту).).ПознатПознат јеје MDR1MDR1 транспортертранспортер којикоји јеје одговоранодговоран заза резистентнострезистентност некихнекихтуморатумора нана антитуморскеантитуморске лековелекове ((затозато штошто пумпапумпа леклек ванван мембранемембранетуморатумора).).ВећнаВећна ""АВСАВС" " транспортератранспортера сесе налазиналази уу мембранимембрани алиали имаима ихих ии уу ендоендо. . ретикулумуретикулуму, , мембранамамембранама митохондријамитохондрија ии лизозомализозома..""АВСАВС" " транспортеритранспортери уу главномглавном функционишуфункционишу каокао пумпепумпе алиали имаима ии онихонихкојикоји сесе понашајупонашају каокао јонскијонски каналиканали ((којикоји сесе активирајуактивирају хидролизомхидролизом АТРАТР--аа).).

""ABCABC"" транспортеритранспортери

Пример АВСтранспортера

ФлипазеФлипазе, , групагрупа мембранскихмембранских протеинапротеина чијачија јеје улогаулогадада пребацујупребацују мембранскемембранске липиделипиде саса једнеједне нана другудругустранустрану мембранемембране, , сусу такођетакође изиз групегрупе ""АВСАВС" " транспортератранспортера..ЋелијскиЋелијски механизмимеханизми којикоји уклањајууклањају вишаквишакхолестеролахолестерола изиз ћелијећелије заснивајузаснивају сесе нана радураду ""АВСАВС" " транспортератранспортера. . МутацијеМутације уу генимагенима којикоји сусу одговорниодговорнизаза синтезусинтезу овихових транспортератранспортера водеводе болестимаболестима каокаоштошто сусу: : цистичнацистична фиброзафиброза ии анемијаанемија. .

ТранспортТранспорт глукозеглукозеГдеГде годгод дада јеје уу ћелијићелији потребнапотребна енергијаенергија, , морамора постојатипостојати системсистем заза доводдовод глукозеглукозе. . ГлукозаГлукоза сесе нпрнпр. . уу еритроцитееритроците уводиуводи помоћупомоћу специфичногспецифичног транспортератранспортера GluT1GluT1 ((већвећ јејебилобило речиречи оо њемуњему). ). ОвајОвај процеспроцес сесе одвијаодвија олакшаномолакшаном дифузијомдифузијом..

ТранспортерТранспортер ЛокацијаЛокацијатранспортатранспорта ТранспортерТранспортер ЛокацијаЛокација

транспортатранспорта

GluT1GluT1 ВећинаВећина ћелијаћелија GluTGluT77 МикрозомиМикрозоми ((уујетријетри))

GluT2GluT2ЈетраЈетра, , бетабета ћелијећелије

панкреасапанкреаса, , хипоталамусхипоталамус

GluTGluT88 ТестисиТестиси, , бластоцитибластоцити, , мозакмозак

GluT3GluT3 НеурониНеурони, , плацентаплацента GluTGluT99 ЈетраЈетра, , бубрезибубрези

GluT4GluT4 СкелетниСкелетни ии срчанисрчанимишићимишићи, , салосало GluTGluT1010 ЈетраЈетра, , панкреаспанкреас

GluT5GluT5МукознаМукозна ткиваткива уу

тестисиматестисима, , спермасперма, , бубрезибубрези

GluTGluT1111 СрцеСрце, , скелетнискелетнимишићимишићи

GluTGluT66 СлезинаСлезина, , леукоцитилеукоцити, , мозакмозак GluTGluT1212 СкелетниСкелетни мишићимишићи, ,

адипозноадипозно ткивоткиво

ТачнаТачна структураструктура GluT1GluT1 транспортератранспортера нини данасданас нијеније прецизнопрецизно одређенаодређена..ПроцесПроцес транспортатранспорта глукозеглукозе можеможе сесе описатиописати механизмоммеханизмом којикоји јеје аналогананалоган ензимскимензимскимреакцијамареакцијама ((МихаелисМихаелис--МентеновогМентеновог типатипа).).

УколикоУколико јеје супстратсупстрат глукозаглукоза ванван ћелијећелије ((SSoutout), ), продуктпродукт глукозаглукоза уу ћелијићелији ((SSinin), ), аа""ензимензим" " јеје транспортертранспортер ""ТТ"" ... ... тадатада можемоможемо представитипредставити брзинубрзину ""узимањаузимања" " глукозеглукозекаокао функцијуфункцију концентрацијеконцентрације глукозеглукозе саса спољашњеспољашње странестране мембранемембране каокао::

ТранспортТранспорт глукозеглукозе ((кинетикакинетика))

ЗависностЗависност брзинебрзине узимањаузимањаглукозеглукозе одод њенењене спољашњеспољашње

концентрацијеконцентрације

СхематскиСхематски описопистранспортатранспорта глукозеглукозеТранспортТранспорт глукозеглукозе сесе

одвијаодвија уу четиричетирикоракакорака: :

БрзинаБрзина акумулацијеакумулацијеглукозеглукозе уу ћелијићелији

((МихаелисМихаелис МентеноваМентеноваједначинаједначина))

ПроцесПроцес преносапреноса идеиде овакоовако::ГлукозаГлукоза сесе везујевезује заза носачносач, , смањујесмањује сесеактивационаактивациона енергијаенергија заза конформационуконформационупроменупромену SSoutoutTT11 →→ SSininTT22, , глукозаглукоза пролазипролазикрозкроз мембранумембрану, , глукозаглукоза сесе ослобађаослобађа ууцитоплазмуцитоплазму, , транспортертранспортер сесе враћавраћа ууосновнуосновну ТТ11 конформацијуконформацију..

СхематскиСхематски описопистранспортатранспорта глукозеглукозеНосачНосач поседујепоседује двадва

конформационаконформациона обликаобликаТТ1 1 ии ТТ2. 2.

ГрафичкиГрафички приказприказМихаелисМихаелис МентеновеМентенове

једначинеједначине

ЛошЛош транспорттранспорт глукозеглукозе ((дијабетисдијабетис))

КадаКада сесе детектуједетектује повећанаповећана количинаколичинаглукозеглукозе уу крвикрви долазидолази додо испуштањаиспуштањаинсулинаинсулина ((хормонхормон панкреасапанкреаса). ). ОвајОвај процеспроцес индукујеиндукује померањепомерање везикулавезикулабогатихбогатих GluT4GluT4 додо плазмаплазма мембранемембране уу којукојугага ""убацујуубацују".".НаНа овајовај начинначин процеспроцес ""узимањаузимања" " глукозеглукозесесе повећаповећа 15 15 путапута. . ПоПо смањењусмањењу концентрацијеконцентрације глукозеглукозе, , смањујесмањује сесе секрецијасекреција инсулинаинсулина папа сесеGluT4GluT4 враћајувраћају уу својесвоје везикулевезикуле..КодКод дијабетисадијабетиса ТипаТипа 1 1 (diabetes mellitus)(diabetes mellitus)инсулининсулин сесе нене излучујеизлучује, , тете нене постојипостојипроцеспроцес узимањаузимања глукозеглукозе ((храњењехрањење) ) мишићамишића, , већвећ онаона остајеостаје уу крвикрви ((папа јеједетектујемодетектујемо онимоним апаратимаапаратима заза мерењемерењешећерашећера).).АА шташта сесе догађадогађа кодкод дијабетисадијабетиса типатипа 2?2?

КадаКада поједемопоједемо оброкоброк којикоји јеје веомавеома богатбогат угљенимугљеним хидратимахидратима, , долазидолази додо повећањаповећања концентрацијеконцентрацијеглукозеглукозе уу крвикрви ((измеђуизмеђу оброкаоброка 5 5 mmММ))..ЗаЗа уклањањеуклањање тогтог вишкавишка глукозеглукозе, , задуженизадужени сусу миоцитимиоцити срчаногсрчаног ии скелетнихскелетних мишићамишића ((којикоји јеје складиштескладиштекаокао гликогенгликоген) ) илиили адипоцитиадипоцити ((којикоји јеје конвертујуконвертују уу триглицеридетриглицериде).).ЗаЗа уклањањеуклањање глукозеглукозе јеје овдеовде задужензадужен транспортертранспортер GluT4GluT4 чијачија јеје концентрацијаконцентрација уу мембранимембрани иначеиначевеомавеома маламала ((наименаиме, , GluT4GluT4 јеје уу великојвеликој меримери смештенсмештен уу везикуламавезикулама унутарунутар ћелијећелије). ). КакоКако садсад тото свесве радиради??

Како се призводи вештачки инсулин? (људски ген који садржи инф. о производњи инсулина се убаци уДНК бактерије која се затим користи као "фабрика" за производњу инсулина ($$$$$$$$$$).

СекундарниСекундарни активниактивни транспорттранспорт ((јонскијонскиградијентиградијенти каокао енергијаенергија заза активниактивни транспорттранспорт))

ЈонскиЈонски градијентиградијенти којикоји сесе добијајудобијају каокао последицапоследица транспортатранспорта NaNa++ ии HH+ + могумогубитибити искоришћениискоришћени заза котранспорткотранспорт различитихразличитих молекуламолекула насупротнасупрот њиховомњиховомконцентрациономконцентрационом градијентуградијенту ((лактозелактозе, , глукозеглукозе, , аминоамино киселинакиселина ...) ....) .

ПримарниПримарни транспорттранспорт HH++ ванванћелијећелије кодкод E. coliE. coli::стандардностандардно долазидолази додоуспостављањауспостављања протонскогпротонскогградијентаградијента ии електричногелектричногпотенцијалапотенцијала крозкроз мембранумембранудокдок лактознилактозни транспортертранспортеромогућаваомогућава садасада секундарнисекундарниактивниактивни транспорттранспорт лактозелактозе уућелијућелију узуз симпортсимпорт HH++ низнизконцконц. . градинетградинет ((уу ћелијућелију).).

КоранспортКоранспорт глукозеглукозе саса NaNa++ крозкроз плазмаплазма мембранемембране епителијалнихепителијалних ћелијаћелија. . NaNa++/K/K++ ATPATP--азнаазна пумпапумпа одржаваодржава јонскијонски концентрациониконцентрациони градијентградијент, , пумпајућипумпајућиNaNa++ јонејоне напољенапоље ии нана тајтај начинначин омогућаваомогућава ии котранспорткотранспорт глукозеглукозе..

ХидрофилниХидрофилни трансмембранскитрансмембрански каналиканали-- аквапориниаквапорини--

ФамилијаФамилија интегралнихинтегралних мембранскихмембранских протеинапротеина којикоји сусу задуженизадужени искљичивоискљичиво зазабрзбрз транспорттранспорт водеводе крозкроз мембранумембрану називајуназивају сесе аквапориниаквапорини..ДоДо садасада јеје кодкод људиљуди познатопознато окооко 10 10 типоватипова аквапоринааквапорина. . СвакиСваки одод њихњихзадуженизадужени сусу заза транспорттранспорт водеводе уу одређенимодређеним типовиматиповима ћелијаћелија..ЕритроцитиЕритроцити имајуимају пунопуно аквапоринааквапорина уу својимсвојим мебранамамебранама којикоји имим омогућавајуомогућавајудада сесе брзобрзо скупљајускупљају ии ширешире ((уу зависностизависности одод осмоларностиосмоларности околнеоколне срединесредине).).НефронскеНефронске ћелијећелије ((уу бубрезимабубрезима) ) такођетакође поседујупоседују пунопуно аквапоринааквапорина сс обзиромобзиромнана потребупотребу овихових ћелијаћелија дада реабсорбујуреабсорбују водуводу токомтоком формирањаформирања уринаурина..МолекулиМолекули водеводе могумогу сесе кретатикретати крозкроз аквапоринеаквапорине брзиномбрзином чакчак одод 101099 11/s/s, , штошто јејемалтенемалтене континуалниконтинуални токток водеводе крозкроз њихњих ((вођенвођен јеје осмоцкимосмоцким градијетомградијетом).).НајбржиНајбржи ензимскиензимски транспорттранспорт којикоји јеје додо садасада забележензабележен јеје 44x10x1077 1/s 1/s ((заза ензимензимкаталазукаталазу).).ИпакИпак, , аквапориниаквапорини сусу изузетноизузетно специфичниспецифичнизаза водуводу ((нпрнпр. . веомавеома јеје битнобитно дада крозкроз овеовеканалеканале нана пролазипролази ии хидронијумхидронијум јонјон НН33ОО++).).

ПаПа какокако функционишуфункционишу тити аквапориниаквапорини??

АквапориниАквапорини -- структураструктураКаоКао примерпример узећемоузећемо аквапоринаквапорин ААQPQP--1. 1. ОнОн јеје тетрамертетрамер, , састојисастоји сесе ододчетиричетири мономернамономерна протеинапротеина одод којихкојих свакисваки представљапредставља трансмембранскутрансмембранскупорупору којакоја попо димензијамадимензијама омогућаваомогућава дада крозкроз њуњу истовременоистовремено прођепрође самосамо 1 1 молекулмолекул водеводе ((d=d=22--33АА).).СвакиСваки мономермономер сесе састојисастоји одод 6 6 трансмембранскихтрансмембранских хеликоидалниххеликоидалнихсегменатасегмената ии 2 2 краћакраћа хеликсахеликса ((којикоји сусу постављенипостављени кака унутраунутра иипредстављајупредстављају филтерфилтер искључивискључив самосамо заза водуводу).).

ОсталиОстали остациостаци уу мономеримамономерима сусу ууглавномглавном неполарнинеполарни алиали јеје омогућеноомогућеноформирањеформирање водоничнихводоничних везавеза сасамолекулимамолекулима водеводе којикоји пролазепролазе..ИпакИпак, , онемогућенонемогућен јеје пролазпролаз повезанихповезанихмолекуламолекула водеводе ((НН--везамавезама) ) којикоји могумогупредстављатипредстављати мостовемостове заза брзибрзитранспорттранспорт протонапротона дуждуж воденогводеног ланцаланца..АргининскиАргинински ии хистидинскихистидински остациостаци онаона 2 2 хеликсахеликса формирајуформирају благоблаго позитивнопозитивнонаелектрисањенаелектрисање којекоје додатнододатно осигураваосигураванемогућностнемогућност пролазапролаза протонимапротонима крозкрозпорупору..

ЈонЈон--селективниселективни каналиканали ((маломало детаљниједетаљније))ПредстављајуПредстављају посебнупосебну врстуврсту каналаканала којикоји сусу специфичноспецифично селективниселективни самосамозаза одређениодређени типтип јонајона..ПоредПоред јонскихјонских пумпипумпи ((већвећ билобило речиречи оо њимањима), ), јонскијонски каналиканали додатнододатноомогућавајуомогућавају брзбрз протокпроток специфичнихспецифичних јонајона кадакада сесе заза тото постојипостоји потребапотреба..ПрвобитноПрвобитно сусу препознатипрепознати кодкод неуронанеурона алиали постојепостоје уу свимсвим плазмаплазма ииунутарћелијскимунутарћелијским мембранамамембранама еукариотаеукариота..ВеомаВеома сусу важниважни заза регулисањерегулисање трансмембранскогтрансмембранског потенцијалапотенцијала..КодКод неуронанеурона, , брзабрза променапромена активностиактивности јонскихјонских каналаканала јеје одод суштинскесуштинскеважностиважности заза променупромену мембранскогмембранског потенцијалапотенцијала ((акционогакционог потенцијалапотенцијала) ) којикоји носиноси сигналсигнал одод једногједног нана другидруги крајкрај неуронанеурона..КодКод миоцитамиоцита, , брзобрзо отварањеотварање CaCa+2+2 каналаканала уу саркоплазмичномсаркоплазмичномретикиулумуретикиулуму доводидоводи додо ослобађањаослобађања CaCa+2+2 јонајона штошто индукујеиндукује контракцијуконтракцијумишићамишића..КаоКао штошто смосмо већвећ напоменулинапоменули, , флуксфлукс проласкапроласка јонајона крозкроз јонскејонске каналеканалеможеможе битибити заза неколиконеколико редоваредова величиневеличине битибити већивећи негонего штошто јеје тото случајслучајкодкод транспортатранспорта јонајона путемпутем јонскихјонских транспортератранспортера (10(1077--101088 јонјон//ss) ) штошто јејеблизублизу теоријскогтеоријског максимумамаксимума заза слободнуслободну дифузијудифузију..ПролазакПролазак јонајона крозкроз јонјон--селективнеселективне каналеканале нијеније концентрационоконцентрационо сатурисансатурисан((брзинабрзина прпрооласкаласка јонајона нене достижедостиже максимуммаксимум припри високојвисокој спољашњојспољашњојконцентрацијиконцентрацији јонајона).).

ЈонЈон селективниселективни каналиканали поседујупоседују ""вратаврата" " саса обеобе својесвоје странестране ((спољашњеспољашњеии унутрашњеунутрашње странестране мембранемембране).).ОваОва ""вратаврата" " сесе отварајуотварају ии затварајузатварају каокао одговородговор нана спољашњеспољашње агенсеагенсе..ПостојеПостоје лиганднолигандно ии напонсконапонско контролисаниконтролисани јонскијонски каналиканали..КодКод лиганднолигандно--контролисанихконтролисаних јонскихјонских каналаканала везивањевезивање малихмалих молекуламолекуланана спољашњаспољашња илиили унутрашњаунутрашња ""вратаврата" " каналаканала доводидоводи додо алостеричкеалостеричкемодификацијемодификације каналаканала ((протеинапротеина) ) штошто отвараотвара илиили затваразатвара каналканал..КодКод напонскинапонски--контролисанихконтролисаних јонскихјонских каналаканала, , променапроменатрансмембранскогтрансмембранског електричногелектричног потецијалапотецијала узрокујеузрокује померањепомерањенаелектрисанихнаелектрисаних деловаделова протеинапротеина ии нана тајтај начинначин сесе каналканал отвараотвара иизатваразатвара..ДаДа биби сесе јонскијонски каналканал отвориоотворио потребанпотребан јеје свегасвега деодео милисекундемилисекунде, , иитакођетакође, , онон можеможе остатиостати отворенотворен свегасвега неколиконеколико милисекундимилисекунди ((овоовоомогућаваомогућава дада овеове молекулскемолекулске машинемашине будубуду веомавеома ефикаснеефикасне зазатранспорттранспорт сигналасигнала нервногнервног системасистема).).ПаПа какокако можемоможемо измеритиизмерити овакоовако краткукратку активностактивност јонскихјонских каналаканала? ? ЗаЗа туту сврхусврху користимокористимо електричнаелектрична мерењамерења patchpatch--calmpcalmp техникомтехником ((каокаопроменапромена напонанапона којикоји сесе јављајавља измеђуизмеђу дведве странестране мембранемембране -- којикоји јејередареда mV, mV, илиили каокао токток електичнеелектичне струјеструје -- којикоји јеје редареда pApA илиили µµAA).).

ЈонЈон--селективниселективни каналиканали ((маломало детаљниједетаљније))

СтруктуруСтруктуру КК++ јонскогјонског каналаканала објаснићемообјаснићемо нана примерупримеру којикоји сесе можеможе наћинаћиуу бактеријибактерији StreptomycesStreptomyces lividanslividans. . ОваквуОвакву структуруструктуру генералногенерално имајуимају ии свисви додо садасада познатипознати КК++ јонскијонскиканаликанали укључујућиукључујући онеоне којикоји сусу напонскинапонски регулисанирегулисани ((којикоји сусу одговорниодговорнизаза преноспренос нервногнервног сигналасигнала крозкроз неуроненеуроне).).РадијусРадијус јонајона КК++ јеје 1.33 1.33 АА ии онон крозкроз овајовај каналканал пролазипролази 10 000 10 000 путапута бржебржеодод јонајона NaNa+ + чијичији јеје радијусрадијус 0.95 0.95 АА, , ии тото брзиномбрзином одод 101088 јонјон/s./s. КакоКако тото??KK++ јонскијонски каналканал сесе састојисастоји изиз 4 4 идентичнеидентичне подјединицеподјединице којекоје пролазепролазе крозкрозмембранумембрану ии формирајуформирају двострукидвоструки конусконус коко јеје проширенпроширен саса спољњеспољњестранестране мембранемембране..

СтруктураСтруктура КК++ јонскогјонског каналаканала

СвакаСвака подјединицаподјединица имаима 2 2 дужадужа, , трансмембранскатрансмембранска αα--хеликсахеликса каокаоии једанједан краћикраћи..СпољашњиСпољашњи конусконус формираформира попоједанједан дужидужи αα--хеликсхеликс одод свакесвакеподјединицеподјединице докдок унутрашњиунутрашњиконусконус правеправе осталиостали αα--хеликсихеликсиокружујућиокружујући каналканал, , правећиправећи јонскијонскифилтерфилтер..Структура К+ јонског канала

СаСа обеобе странестране каналаканала, , нана ""вратимавратима", ", налазеналазе сесе негативнонегативно наелектрисанинаелектрисаниостациостаци аминоамино--киселинакиселина којикоји повећавајуповећавају локалнулокалну концентрацијуконцентрацију катјонакатјона каокаоштошто сусу КК++ ии NaNa++. . НаНа самомсамом улазуулазу, , свисви јонијони слободнослободно улазеулазе изиз растворараствора задржавајућизадржавајући својусвојухидратационухидратациону сферусферу..КраћеКраће αα--подјединицеподјединице усмеренеусмерене сусу кака каналуканалу ((којекоје сусу такођетакође негативнонегативнонаелектрисаненаелектрисане тете додатнододатно стабилишустабилишу јонејоне).).

СтруктураСтруктура ии принциппринцип радарада КК++ јонскогјонског каналаканала

ОвиОви малимали хеликсихеликси додо 2/3 2/3 путапута полакополакосужавајусужавају каналканал одвајајућиодвајајући хидратационухидратационусферусферу јонимајонима ((тјтј. . узмуузму имим водуводу).).ЕЕ садсад онооно правоправо ... ... кисеониковикисеоникови атомиатоми изизкарбонилнекарбонилне групегрупе ((одод АКАК изиз хеликсахеликса) ) замењујузамењују молекулемолекуле HH22O O изиз сфересфере иизатварајузатварају јонјон уу ""кавезкавез" (" (алиали уу којикоји сесе могумогууфитоватиуфитовати самосамо јонијони КК+). +). ЈониЈони NaNa++ сусуисувишеисувише малимали дада направенаправе контактконтакт сасакисеоничнимкисеоничним лигандималигандима..ЈониЈони КК++ овакоовако крозкроз каналканал пролазепролазе једанједанпопо једанједан, , међусобномеђусобно сесе одбијајућиодбијајући ии тиметимеодржавајуодржавају својсвој константанконстантан токток.. Структура К+ јонског канала

ПостојеПостоје 44 потецијалнапотецијална местаместа заза којакоја сесе могумогу везативезати КК++ јонијони ((црвенецрвенекарбонилнекарбонилне групегрупе сусу обележенеобележене нана слицислици).).ИпакИпак, , истовременоистовремено сусу заза везивањевезивање искоришћенаискоришћена самосамо 2 2 местаместа..КакоКако садасада тото функционишефункционише? ? ЈониЈони калијумакалијума првопрво заузимајузаузимају местаместа 1 1 ии 3 3 папа затимзатим ""скоческоче" " нана местаместа 2 2 ии 4.4.

СтруктураСтруктура ии принциппринцип радарада КК++ јонскогјонског каналаканала

Места везивања наК+ јонском каналу

123

4

СтварСтвар јеје уу тометоме штошто јеје каналканал такотаконаправљеннаправљен дада јеје енергијскаенергијска разликаразликаизмеђуизмеђу положајаположаја 11--3 3 ии 22--4 4 изузетноизузетномаламала..ОвајОвај размакразмак измеђуизмеђу КК++ јонајона сесе дешавадешавасамсам попо себисеби збогзбог њиховогњиховог међусобногмеђусобногодбијањаодбијања..ТакођеТакође, , овоово одбијањеодбијање спречаваспречава даданекинеки одод јонајона будебуде дужедуже времевреме везанвезан зазакарбонилнукарбонилну групугрупу ((максималномаксимално 1010--100 100 nsns), ), већвећ дада постојипостоји њиховњихов константанконстантантокток крозкроз каналканал путемпутем везивањавезивања ииодбијањаодбијања..

NaNa+ + јонскијонски каналиканали уу плазмаплазма--мембранамамембранама неуронанеурона ии миоцитамиоцита срчанихсрчаних ии скелетнихскелетнихмишићамишића сусу попо својојсвојој природиприроди напонсконапонско регулисанирегулисани каналиканали..ОниОни осећајуосећају електричнеелектричне градијентеградијенте крозкроз мембранумембрану нана основуоснову којихкојих сесе отварајуотварају илиилизатварајузатварају..ФлуксФлукс којикоји овиови каналиканали постижупостижу заза NaNa++ јонејоне јеје већивећи одод 101077 јонјон//s.s.КадаКада сусу уу затвореномзатвореном стањустању ((затвореназатворена конформацијаконформација) ) овиови каналиканали сесе могумогу брзобрзоактивиратиактивирати ((отворитиотворити) ) подпод утицајемутицајем трансмембранскогтрансмембранског електричногелектричног потенцијалапотенцијала..УУ отвореномотвореном стањустању NaNa+ + јонскијонски каналиканали остајуостају свегасвега деодео милисекундемилисекунде кадакада сесе брзобрзозатварајузатварају ии остајуостају затворенизатворени чакчак неколиконеколико милисекундимилисекунди..ОвајОвај процеспроцес јеје кључанкључан заза успешануспешан транспорттранспорт нервногнервног сигналасигнала крозкроз аксонаксон((сигнализацијасигнализација).).

СтруктураСтруктура NaNa++ јонскогјонског каналаканала

СуштинскаСуштинска компонентакомпонента NaNa+ + јонскогјонског каналаканала јеје дугачакдугачак полипептидполипептид одод 1840 1840 АКАК којикоји сусуорганизованиорганизовани уу 4 4 доменадомена увијенихувијених окооко централногцентралног каналаканала. . СвакиСваки одод доменадомена сесесастојисастоји изиз 6 6 трансмембранскихтрансмембранских хеликсахеликса..

ОбластОбласт сегменатасегмената измеђуизмеђу трансмембранскихтрансмембранских хеликсахеликса 5 5 ии 6 6 називаназива сесе поромпором којакоја јеје специфичнаспецифичнапопо искључивомискључивом транспортутранспорту јонајона NaNa++ јерјер уу себисеби садржисадржи филтерфилтер ((премапрема величинивеличини ии налектрисањуналектрисању).).ХеликсХеликс 4 4 садржисадржи моноштвомоноштво АКАК саса позитивнопозитивно наелектрисанимнаелектрисаним остацимаостацима ии померапомера сесе уу оквируоквирумембранемембране каокао одговородговор нана променупромену трансмембранскогтрансмембранског потенцијалапотенцијала..ПотенцијалПотенцијал јеје ""нормаланнормалан" " кадакада јеје унутрашњостунутрашњост мембранемембране негативнанегативна ((окооко --60 60 mV) mV) ии крећекреће сесе додоокооко +40 +40 mVmV кадакада сесе преносипреноси сигналсигнал..ПомерањеПомерање хеликсахеликса 4 (4 (уследуслед променепромене потенцијалапотенцијала) ) условљаваусловљава отварањеотварање каналаканала..

СтруктураСтруктура неуронскогнеуронског NaNa++ јонскогјонског каналаканала

ОтворенОтворен каналканал сесе затваразатвара помоћупомоћу специфичногспецифичног механизмамеханизма ((лопталопта++ланацланац). ). КакоКако тото радиради??ДаДа днудну каналаканала ((деодео кака цитосолуцитосолу) ) налазиналази сесе једанједан лоптастилоптасти протеинпротеин којикоји јеје повезанповезан краткимкраткимполипептиднимполипептидним сегментомсегментом ((ланацланац) ) заза каналканал. . ЛоптаЛопта сесе слободнослободно крећекреће кадакада јеје каналканал затворензатворен. . МеђутимМеђутим, , кадакада сесе каналканал отвориотвори ((померипомери сесе 4 4 хеликсхеликс) ) тото условљаваусловљава ослобађањеослобађање местаместа гдегде сеселоптастилоптасти протеинпротеин вежевеже заза днодно каналаканала ((повученповучен онимоним краткимкратким сегментомсегментом) ) ии такотако гага затворазатвора. . ОдОд дужинедужине полипептидногполипептидног ланцаланца зависизависи коликоколико ћеће каналканал дугодуго битибити отворенотворен. .

Затворен канал (поларизована мембрана) Отворен канал (деполаризована мембрана)

ДаДа сумирамосумирамо шташта смосмо научилинаучили штоштосесе тичетиче јонскихјонских каналаканала

ДоДо садасада смосмо виделивидели дада сесе пасивнипасивни транспорттранспорт јонајона ии малихмалих молекуламолекуланајефикаснијенајефикасније обављаобавља порамапорама, , каналимаканалима ии носачиманосачима..ЗаЗа разликуразлику одод њихњих јонскејонске пумпепумпе транспортујутранспортују јонејоне активноактивно насупротнасупротконцентрацономконцентрацоном градијентуградијенту трошећитрошећи енергијуенергију којукоју производипроизводи ћелијаћелија..БрзинаБрзина олакшанеолакшане дифузиједифузије каналимаканалима јеје вишевише одод 1000 1000 путапута већавећа одод брзинебрзинетранспортатранспорта јонскимјонским пумпамапумпама ((приближнаприближна дифузијидифузији уу воденимводеним растворимарастворима).).ВиделиВидели смосмо дада јеје структураструктура јонскихјонских каналаканала веомавеома комплекснакомплексна ии дада ониони ненепредстављајупредстављају обичнеобичне ""цевицеви" " којикоји пролазепролазе крозкроз мембранумембрану..СтруктураСтруктура јонскихјонских каналаканала битнобитно зависизависи одод њиховењихове околинеоколине..УУ зависностизависности одод околинеоколине, , каналиканали могумогу заузетизаузети једноједно одод двадваконформационаконформациона стањастања: : отвореноотворено илиили затворенозатворено..ОкидачОкидач заза постојањепостојање једногједног одод двадва стањастања можеможе битибити::-- хемијскахемијска активацијаактивација ((везивањемвезивањем специфичнихспецифичних лиганадалиганада заза каналканал каокао кодкодаквапоринааквапорина, , ГГ--протеинапротеина илиили неуротрансмитеранеуротрансмитера ацетилхолинаацетилхолина))-- електричнаелектрична активацијаактивација ((деполаризацијадеполаризација елетричногелетричног пољапоља))-- механичкамеханичка активацијаактивација ((торзијаторзија, , спољашњиспољашњи притисакпритисак ... ) ... ) -- индукованаиндукована светлошћусветлошћу ((апсорпцијаапсорпција фотонафотона).).

АкциониАкциони потенцијалпотенцијал--транспорттранспорт електричногелектричног сигналасигнала дуждуж аксонааксона--

КакоКако померамопомерамо стопалостопало? ? КакоКако долазидолази додо преносапреноса електричногелектричног сигналасигнала ододмозгамозга--прекопреко неуронанеурона--додо мишићамишића??СвакаСвака нервнанервна ћелијаћелија ((неуроннеурон) ) имаима дугачакдугачак деодео ((аксонаксон) ) којикоји сесе користикористи зазапреноспренос сигналасигнала..АксониАксони сусу направљенинаправљени дада биби преносилипреносили електричнеелектричне сигналесигнале штошто сесе називаназиваакциониакциони потенцијалпотенцијал..АксониАксони сусу обложениобложени ШвановимШвановим ћелијамаћелијама којекоје изолујуизолују аксонаксон ии помажупомажу дада сесеелектирчниелектирчни сигналсигнал транспортујетранспортује бржебрже ии ефикаснијеефикасније..

Нерв Аксон

АКЦИОНИ ПОТЕНЦИЈАЛ

Акциони потенцијал

НеуронскеНеуронске синапсесинапсеНаНа којикоји начинначин садасада долазидолази додо преносапреноса неуронеуро--сигналасигнала нанаследећиследећи неуроннеурон??ТајТај прелазакпрелазак сесе дешавадешава прекопреко неуронскихнеуронских синапсисинапси..

Синапса

ШтаШта сусу тото неуротрансмитеринеуротрансмитери? ? КојаКоја јеје улогаулога Ca Ca уу овомовом процесупроцесу??НеуротрансмитериНеуротрансмитери сусу посебнипосебни молекулимолекули којикоји сусу смештенисмештени уу везикуламавезикулама нана крајукрају аксонааксона. . ТоТо сусу: : аминоамино--киселинекиселине ((глицинглицин, , глутаматглутамат, , аспартатаспартат, , серинсерин, GABA), , GABA), моноаминимоноамини ((допаминдопамин, , норадреналиннорадреналин, , епинефринепинефрин, , серотонинсеротонин, , мелатонинмелатонин) ) ии осталиостали ((ацетилхолинацетилхолин, , аденозинаденозин, , хистаминхистамин, , NO, CO, Zn (NO, CO, Zn (нене пакујупакују сесе уу везикулевезикуле већвећ сесе самосамо ослобађајуослобађају уу синаптичкисинаптичкирасцепрасцеп...)...)КадаКада неуронеуро--сигналсигнал дођедође додо крајакраја аксонааксона, , тото изазиваизазива отварањеотварање Ca Ca каналаканала ии Ca Ca улећеулеће уунеуроннеурон ии везујевезује сесе заза везикулевезикуле..ТоТо индукујеиндукује процеспроцес интегрисањаинтегрисања везикулавезикула ((којикоји сусу пунепуне неуротрансмитеранеуротрансмитера) ) уу мембранумембрану иииспуштањаиспуштања неуротрансмитеранеуротрансмитера изиз ћелијећелије уу синаптичкисинаптички расцепрасцеп ((просторпростор измеђуизмеђу дведвенервненервне ћелијећелије).).НеуротрансмитериНеуротрансмитери сесе затимзатим везујувезују заза рецепторерецепторе постпост--синаптичкогсинаптичког неуронанеурона. . ТоТо изазиваизазивадеполаризацијудеполаризацију аксонааксона уласкомуласком Na Na крозкроз мембранумембрану путемпутем олакшанеолакшане дифузиједифузије, , појавупојавуакционогакционог потенцијапотенција ... ... ии сигналсигнал путујепутује даљедаље..ПослеПосле обавњеногобавњеног послапосла, , неуротрансмитеринеуротрансмитери сесе враћајувраћају уу препре--синаптичкисинаптички неуроннеуронпаковањемпаковањем уу везикулевезикуле ии проласкомпроласком крозкроз мембранумембрану..

Синапса 1 Синапса 2

ОметањеОметање нормалногнормалног преносапреноса неуронеуро--сигналасигналаКојиКоји свесве проблемипроблеми могумогу настатинастати уу процесупроцесу преносапреноса неуронеуро--сигналасигнала??ДемијенализацијаДемијенализација -- МСМС ((мултиплексмултиплекс склерозасклероза))

Метафемини

ПрозакПрозак ((антидепресивантидепресив) ) -- инхибираинхибира поновнопоновно преузимањапреузимања употребљеногупотребљеногсеротонинасеротонина..

Прозак

КонзумирањеКонзумирање опојнихопојних дрогадрога -- активацијаактивација хиперпродукцијехиперпродукције допаминадопамина..

МС

ЛајмскаЛајмска болестболест -- узуз оштећењаоштећења нервногнервног системасистема

Лајмска болест

НеуротоксиниНеуротоксини -- принциппринцип деловањаделовања..

Неуротоксини

ГлутаматГлутамат

КончноКончно дада сумирамосумирамо транспорттранспорт ......

ИспитивањеИспитивање јонскихјонских каналаканалаpatchpatch--calmpcalmp техникатехника

ЕлектричнеЕлектричне методеметоде заза испитивањеиспитивање јонскихјонских каналаканала сусу коришћенекоришћене давнодавно препренегонего штошто јеје билабила познатапозната њиховањихова структураструктура..PatchPatch--calmpcalmp техникатехника користикористи појачавачпојачавач трансмембранскогтрансмембранског напонанапона иистакленестаклене пипетепипете саса врхомврхом микрометарскихмикрометарских димензијадимензија ((заза мерењемерење струјеструје).).ПринципПринцип јеје следећиследећи::-- округлиокругли врхврх пипетепипете ((пречникапречника окооко 11µµmm)) сесе притиснепритисне узуз ћелијскућелијску мембранумембрану-- применипримени сесе малимали вакумвакум дада биби сесе осигураоосигурао контактконтакт саса ћелијомћелијом..-- унутрашњостунутрашњост пипетепипете јеје испуњенаиспуњена електролитомелектролитом дада биби сесе контролисалоконтролисалопонашањепонашање јонскихјонских каналаканала присутнихприсутних уу ""ухваћеномухваћеном" " делуделу мембранемембране..

PatchPatch--clampclamp техникатехникаинтерактивниинтерактивни приказприказ

ДаДа биби сесе моглемогле меритимерити малемалеструјеструје створенестворене проласкомпроласком јонајонакрозкроз каналеканале, , отпоротпор измеђуизмеђу пипетепипетеии мембранемембране морамора битибити великивелики тзвтзв. . gigasealgigaseal..ЗатоЗато јеје вакумвакум веомавеома важанважан јерјер ненедозвољавадозвољава дада медијуммедијум окооко ћелијећелијепродрепродре уу електролителектролит..

УУ зависностизависности одод типатипа контактаконтактаизмеђуизмеђу пипетепипете ии ћелијећелије постојипостојичетиричетири типатипа снимањаснимања::-- cell attachedcell attached ((заза мерењемерење сигналасигналапојединихпојединих каналаканала којикоји сусу унутарунутар""закрпезакрпе" " -- великивелики отпоротпор..-- whole cellwhole cell ((вакумскивакумски пулспулсостварујеостварује електричниелектрични контактконтакт сасаунутрашњошћуунутрашњошћу ћелијећелије) ) мембранамембранапуцапуца -- снимајуснимају сесе свисви јонскијонски каналиканалиуу мембранимембрани + + могућностмогућностубацивањаубацивања хемхем. . реагенсареагенса уу ћелијућелију..-- inside outinside out ((каокао whole cellwhole cell узузодвајањеодвајање пипетепипете одод ћелијећелије прикомприкомчегачега сесе откидаоткида каналканал узуз затварањезатварањеуу односуодносу нана околниоколни медијуммедијум. . ЗаЗаипитивањеипитивање једногједног каналаканала ууцитоплазмичномцитоплазмичном медијумумедијуму..-- outside outoutside out ((каокао whole cellwhole cell узузодвајањеодвајање пипетепипете одод ћелијећелије кадакада сесествараствара везикулавезикула нана њеномњеном врхуврху. . ЗаЗаиспитивањеиспитивање понашањапонашања једногједногканалаканала подпод утицајемутицајем спољашњихспољашњихрецепторарецептора..

PatchPatch--calmpcalmp методеметоде снимањаснимања

ИнтерактивниИнтерактивни приказприказ типоватипова снимањаснимања

ТриТри одод описанихописаних методаметода снимањаснимања служеслуже заза мерењемерење појединачнихпојединачних јонскихјонскихканалаканала подпод утицајемутицајем различитихразличитих агенасаагенаса..КаквеКакве информацијеинформације добијамодобијамо изиз patchpatch--clamp clamp мерењамерења??-- нана слицислици јеје типичантипичан patchpatch--clampclamp сигналсигнал једногједног каналаканала-- присуствоприсуство илиили одсуствоодсуство струјеструје говориговори намнам оо тометоме дада лили јеје каналканал отворенотворенилиили затворензатворен

PatchPatch--calmpcalmp методаметода

ЕлектрофизиолошкаЕлектрофизиолошка испитивањаиспитивања јонскихјонских каналаканала доказаладоказала сусу хипотезухипотезу оопостојањупостојању мембранскихмембранских структураструктура којакоја сесе понашајупонашају каокао вратаврата заза јонејоне..

NeherNeher & & SakmannSakmann сусу 1991. 1991. годинегодине добилидобили НобеловуНобелову наградунаграду заза физиологијуфизиологију иимедицинумедицину заза развојразвој patchpatch--clampclamp техникетехнике

ВежбаВежба::

ПрименаПримена Patch ClampPatch Clampтехникетехнике заза снимањеснимање јонскихјонскихканалаканала кодкод XenopusXenopus OocytesOocytes

((јајнајајна ћелијаћелија жабежабе))

ФотосинтезаФотосинтезаКакоКако биљкебиљке долазедолазе додо хранехране? ? СтварајуСтварају јеје самесаме. . КакоКако? ? ИзИз СОСО22 путемпутем фотосинтезефотосинтезе..ПроцесПроцес фотосинтезефотосинтезе сесе састојисастоји изиз светлесветле ии тамнетамне фазефазе..УУ светлојсветлој фазифази ((догађадогађа сесе дањудању), ), биљкебиљке користекористе енергијуенергију СунцаСунца ((светлостсветлост) ) дада бибистворилествориле енергијскеенергијске молекулемолекуле NADPHNADPH ии ATPATP ((ee-- транспортнитранспортни ланацланац уу тилакоиднимтилакоидниммембранамамембранама хлоропластахлоропласта). ). УУ овојовој фазифази сесе ослобађаослобађа ОО2 2 ((добијендобијен изиз водеводе). ). ОвдеОвде једнуједнуодод кључнихкључних улогаулога имаима хлорофилхлорофил ((молекулмолекул, , пигментпигмент, , којикоји веомавеома ефикасноефикасно апсобујеапсобујесветлоснусветлосну ЕЕ ии усмераваусмерава јеје нана реакционереакционе центрецентре..УУ тамнојтамној фазифази ((КалвиновКалвинов циклусциклус, , догађадогађа сесе ии дањудању ии ноћуноћу), ), биљкебиљке стварајустварају глукозуглукозу иидругедруге угљенеугљене--хидратехидрате изиз СОСО22 користећикористећи енергијуенергију добијенудобијену уу светлојсветлој фазифази. . ОвајОвајпроцеспроцес сесе одиграваодиграва уу стромамастромама хлоропластахлоропласта. . ДобијенаДобијена глукозаглукоза сесе можеможе трошититрошити уупроцесупроцесу респирацијереспирације ((добијањедобијање АТРАТР узуз утрошакутрошак ОО22 ии ослобађањеослобађање СОСО22) ) илиилискладиштитискладиштити ии видувиду скробаскроба ((амилозаамилоза, , амилопектинамилопектин .... .... молекулимолекули глукозеглукозе повезаниповезаниαα(1,4) (1,4) ии αα(1,6) (1,6) гликозиднимгликозидним везамавезама ...)....).

Light

Хлорофил а и бФотосинтеза

Фотосинтеза 1

Фотосинтеза 2

Добијање глукозе

АФМАФМ каокао методаметода заза испитивањеиспитивање мембранамембранаЈеднаЈедна одод методаметода којакоја сесе можеможе искориститиискористити заза испитивањеиспитивање мембранскихмембранских протеинапротеинајеје АФМАФМ ((AAtomic tomic FForce orce MMicroscopyicroscopy).).ПринципПринцип јеје уу тометоме штошто сесе веомавеома зашиљензашиљен врхврх микроскопскемикроскопске пробепробе,, којикоји сесе налазиналазинана носачуносачу ""клацкалициклацкалици"",, превлачипревлачи прекопреко неравненеравне површинеповршине мембранемембране..ЕлектростатичкеЕлектростатичке ии ВанВан--ДерДер--ВалсовеВалсове силесиле,, којекоје сесе јављајујављају измеђуизмеђу тогтог врхаврха ииповршинеповршине узоркаузорка,, померајупомерају пробупробу горегоре--доледоле тете сесе такотако могумогу детектоватидетектовати ""брдабрда" " ии""долинедолине" " нана узоркуузорку. .

ЛасерскиЛасерски зракзрак којикоји јеје усмеренусмерен нана ""клацкалицуклацкалицу" " детектуједетектује њеноњено померањапомерања редареда 0.10.1nmnm..СкенирањемСкенирањем дуждуж X X ии YY осеосе добијамодобијамотродимензионутродимензиону сликуслику површинеповршине мембранемембране сасарезолуцијомрезолуцијом одод 0.1 0.1 nmnm..

AФМ слика аквапорина Е. Colli

AФМ видеоАФМ принцип рада

EPR-primene u biološkim sistemima-

Spinske probe i spinski obeleživači

Spinske probe – stabilni (dugoživeći) slobodni radikali (nitroksidi) koji se ubacuju u sistem da bi se ispitala neka osobina

Spinski obeleživači (spin labels) – nitroksidi vezani za druge molekule – praćenje ponašanja obeleženih molekula

Sterno zaklanjanje reaktivne grupe

Modifikacija osobina ‘ručka’

-½

+½

Spinske probe i obeleživači(EPR spektri)

TEMPONE

EPR spektar

• Paramagnetni elektron spin-labela se nalazi u sp3

orbitali između N i O. IN=1, a IO=0. • Jezgro sa spinom 1 ima 3 moguće vrednosti magnetnog

momenta (+1,0,-1) pa dolazi do cepanja oba energetska nivoa elektrona (mS =1/2 i mS =- 1/2) na po tri.

• Iz jednačine ∆E = gβeB, vidimo da razlike u energiji vode ka različitim rezonantnim uslovima.

• Na osnovu izbornog pravila ΔmS=±1 (spinski nivoi) i ΔmI=0 (Zemanovi nivoi) moguća su 3 prelaza, pa postoje i 3 linije.

* Svaka linija je i dodatno proširena usled interakcije sa protonima (I=1/2) iz susednih CH3 grupa (super hiper fina interakcija), vide se i 13C (I=1/2) sateliti ... ali, polako

MS=±½

B“triplet”

a

ΔE1 ΔE2 ΔE3

+1

-1

-1

+1

MI

+0

+0

MI

Kretanje lipida u membrani

Termalni pokretihidrofobnog dela

Uređenost unutrašnjosti membrane

Transverzalno kretanjeflip-flop

Lateralno kretanje lipidadifuzija

Fosfolipidne membrane kao modeli za ispitivanje osobina membrana. Spontano ili indukovano formiranje

fosfolipidnog dvosloja

Planarne membrane (black film)

Problem je šta sa krajevima, pa se krajevi zakače za nešto

SUV (out-in 65-35%)

Liposomi (lipidne vezikule)spontano ili sonifikacija

LUV (out-in 50-50%)Small or large unilamellar vesicles

MLVMultilamellar vesicles

EM multilamelarne Goldžijeve strukture

Lipozomi - uređenost i fazni prelaziEPR spinske probe

Selektivno obeležavanje pozicije duž lanca

Uticaj pokretljivosti spinske probe na izgled EPR spektra

DS u vodi

DS u membrani

Određivanje faktora uređenosti S fosfolipidnog dvosloja metodom EPR spinskih proba

Fazni prelaz = gel (uređeno) ↔ neuređeno (tečni kristal)

Šta se dešava sa EPR spektrima spin-labela kada se ugrade u membranu ???

++

++ HH22OOU vodenom rastvoru

7-DS

Integrisan u membranu

• Ukupan spektar 7DS-a ugradjenog u membranu potpuno odudara od onog iz rastvora. Do toga dolazi zbog anizotropije.

C

O OH

ON

O

5,7,12-DS u membraniŠto je fluidnost veća, molekuli se slobodnije kreću pa dolazi do postepenog gubitka anizotropije i spektar je sve sličniji onom iz rastvora. Spektri za dve ekstremne situacije postaju identični, a ukupni spektar uži –zašto ???

Širina spektralnih linija = (2τ1)-1 + (1 + γe2B1

2τ1τ2)1/2 τ2-1 gde su:

τ1 i τ2 longitudinalno i transverzalno relaksaciono vreme, B1 je magnetna komponenta ulaznog zračenja); γe je žiromagnetni odnos.

τ1 opisuje gubitak magnetizacije, relaksaciju koja nastaje kroz proces gde apsorbovana energija prelazi u toplotu (spin-rešetka relaksacija). τ2 opisuje gubitak magnetizacije kroz gubitak faze, energija se prenosi sa elektrona na elektron (spin-spin relaksacija)

Širina linije je u principu obrnuto proporcionalna brzini relaksacije.

Kada je membrana rigidnija, spinovi su bliži jedan drugome takoda lakše dolazi do spinske difuzije, a veći broj sudara doprinosispin-rešetka relaksaciji. Relaksacija je tada brža, a linije šire. Kada se poveća mobilnost molekula (spin-label-a) u membrani relaksacija ide sporije, pa su i linije uže. Ovo je još jedan faktor, osim anizotropije, koji daje direktnu vezu izmedju fluidnosti membrane i širine spektralnih linija.

Fluidnost membrane se povećava od površine prema unutra. Polarne glave su relativno gusto spakovane na površini, međusobno se privlače ili odbijaju i interaguju sa vodom u okolini. Od njih se prema sredini membrane pruža(ju) masnokiselinski lanac koji nepolaran. U blizini glave on je slabo pokretan. Međutim što se ide dalje od polarnog dela, hidrofobni rep je sve slobodniji i tu se može uočiti veća fluidnost.

Određivanje faznih prelaza lipidnog dvoslojametodom EPR spin obeležavanja

7-DS

T = 20 °C

T = 75 °C

Fosfolipidi

Spinska proba

temperatura

SGel – ispod faznog prelaza

Tečni kristal – iznad faznog prelaza

+

Lipozomilateralna difuzija fosfolipida

Spin-spin širenje

Bliski kontakt spinova dovodi do širenja linije i indukuje da su obeleženi fosfolipidi u kontaktu

Pojavljivanje tri linije ukazujena ‘razblaživanje’ lateralnom difuzijom

Lipozomiflip-flop-

fosfolipida

vreme

1

0.5

Asc na 0oC

Asc na 30oC