백출(白朮 - nifds.go.kr

한약재 품질표준화 연구사업단

백출(白朮)Atractylodis Rhizoma Alba

생약연구과

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○ 한글명(한자명) : 백출(白朮)

○ 영 명 : Atractylodes Rhizome White

○ 라 틴 명 : Atractylodis Rhizoma Alba

○ 기원식물 : 삽주 Atractylodes japonica Koidzumi 또는 백출 (白朮) Atractylodes

macrocephala Koidzumi (국화과 Compositae)

○ 약용부위 : 뿌리줄기로서 그대로 또는 주피를 제거한 것

1. 성상

이 약은 국화과의 삽주 (Atractylodes japonica Koidzumi) 또는 백출 (Atractylodes

macrocephala Koidzumi)의 뿌리줄기 또는 주피를 제거하여 말린 약재이다. 삽주

(Atractylodes japonica Koidzumi)는 고르지 않은 덩어리 또는 일정하지 않게 구부러진

원주상의 모양을 하고 길이 3~8 cm, 지름 2~3 cm이다. 바깥면은 엷은 회황색~엷은

황백색으로 군 데군데 회갈색을 띠고 있다. 주피가 붙어있는 것은 바깥면이 흑갈색이고

때로 매듭 모양으로 튀어나와 있으며 거친 주름이 있다. 잘 꺾이지 않으며 꺾인 면은

섬유성이다. 이 약의 횡단면을 현미경으 볼 때 주피에는 석세포층이 있고 피부의

유조직에는 때로 사부의 바깥쪽에 접하여 섬유속이 있으며 수선의 말단부에는 유실이 있고

그 안에는 연한 갈색~갈색의 내용물이 들어있다. 목부에는 작은 도관들이 수를 방사상으로

둘러싸고 있고 그 도관들의 둘레에는 섬유속이 둘러싸고 있다. 수 및 수선 중에는 피부에

있는 것과 같은 유실이 있고 유조직 중에는 이눌린 결정 및 작은 옥살산칼슘침정이

들어있다. 특이한 냄새가 있고 맛은 약간 쓰다. 백출 (Atractylodes macrocephala

Koidzumi)은 불규칙하게 비대한 덩이 모양이고 길이 3~13 cm, 지름 15~70 mm이다.

바깥면은 회황색 또는 회갈색이고 컵 모양의 작은 돌기가 있다. 또한 중간 중간 끊어진

세로 주름과 패인 무늬가 있으며 뿌리털이 붙었던 자국이 있다. 위쪽 끝에는 줄기의

그루터기와 싹이 붙었던 자국이 남아있다. 질은 단단하며 쉽게 꺾기 어렵다. 꺾인 면은

평탄하지 않고 황백색~연한 갈색을 띠며 황갈색의 유실이 점 모양으로 흩어져 있다. 불에

말린 것은 자른 면이 각질이고 색은 비교적 진하며 빈틈이 있다. 횡단면을 현미경으로 볼

때 코르크세포와 피부가 마주치는 부위에는 중간 중간 끊어진 석세포의 띠가 있다. 피부와

수선에는 여기저기에 유실이 있으며 갈색의 기름방울이 들어있다. 형성층의 고리는 아주

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뚜렷하다. 유세포 중에는 옥살산칼슘침정과 이눌린이 들어있다. 특유한 냄새가 있고 맛은

달고 약간 매우며 씹으면 점성을 띤다. .

2. 기원

한국, 중국, 일본의 공정서를 비교한 결과 기원식물과 라틴명은 다음과 같다.

Table 1. The origin of the Araliae Continentalis Radix in KP, CP and JP

구분 라틴명 기원 함량기준

KP 11Atractylodis Rhizoma

Alba

Atractylodes japonica

Koidzumi or Atractylodes

macrocephala Koidzumi

정유함량 0.5 mL

이상 (50.0 g).

CP 2015 Atractylodis Rhizoma

Atractylodes lancea(Thunb.)

DC. or Atractylodes

chinensis(DC.) Koidz )

atractylodin

(C13H10O)0.30%이

상

JP 16 Atractylodis Rhizoma

Atractylodes japonica

Koidzumi or Atractylodes


3. 한방에서의 용도

방향성 건위제, 발한, 이뇨, 진통, 건위등에 효능이 있어 식욕부진, 위장염, 감기 등에

사용한다

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4. 성분분리 연구

(1) 국내·외 연구 현황

백출의 성분은 정유(2~3% : atractylon, 3-β-hydroxy-atractylon, atractylenolide Ⅰ~

Ⅲ,eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one), Sesquiterpene glycoside (atractyloside A, B, 10-

epi-atractyloside A), 다당체 (atractan A, B, C)와 기타(acetaldehyde, 2-furaldehyde,

polyacetylene 화합물) 등이 알려져 있다. 주요 약리작용으로는 건위작용 (atractylon이

CuCl2에 의한 간독성으로부터 간세포를 보호하며 궤양억제를 억제, 50% MeOH 추출

물은 스트레스로 인한 위궤양의 발생을 예방), 이뇨·지한작용 (atractylenolide Ⅲ 등도

세뇨관의 Na+, K+-ATPase의 활성을 억제하지만, atractylon이 가장 강하게 선택적으

로 억제, 전체의 뇨량 증가는 인정되지 않으나, EtOH 추출액의 이뇨작용은 다소 인정),

진정작용 (백출의 정유성분에 중추억제, 약간의 혈압강하, 적출심장의 운동억제작용이

있음), 혈당강하작용 (다당류(glycan)인 atractan A, B, C에는 혈당강하작용, 물 및 EtO

H 추출물 모두 혈당을 상승시킨 후 하강시킴), 안태(安胎)작용 (백출의 정유성분이 위

장관과 자궁의 운동 및 말초혈관에 대해서도 억제작용), 기타(면역중강작용 : 백출의

물 추출물이 현저한 면역증강작용, atractylon에 항미생물작용, 항염증작용음, 에틸아세

테이트 추출물의 간세포보호작용 및 담즙분비 촉진작용) 등이 지금까지의 연구로 밝혀

져 있다.

(2) 성분 분리 및 동정

가) 시료 정보

생약명 기원식물학명 산지 형태

백출Atractylodes japonica Koidzumi or Atractylodes


국내산

중국산

일본산

뿌리줄기

나) 백출 추출물 제조

백출 근경 1.5 kg을 건조 후 100% MeOH 3 L (1.5 L x 2)를 가하여 198분 동안 2회

초음파 추출하였다. 용매는 감압농축하고 100% MeOH 추출물 268 g을 수득하였다.

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다) 성분 분리 과정

수득한 100% MeOH 추출물을 증류수에현탁한 후 극성지향적 분리기법에 따라

n-Hexane, CHCl3, EtOAc 및 n-BuOH로 분획하여 각각 71.0 g,31.8 g, 3.4 g, 11.4 g의

분획물을 얻었다.Hexane fraction을 silicagel chromatography (Hexane:EtOAc=100:1 to

5:1)로 분리하여 14개의 소분획을 얻었다. 이 중 F03을 silicagel chromatography

(Hexane:EtOAc=100:1 to 2:1)로 다시 분리하여 atractylenolide 2 (2, 43mg)를 분리하였

고 F03 일부를 다시 RP HPLC (MeOH:H2O=70:30)으로 분리하여 actactylenolide 3 (3,

47mg)를 분리하였다. F09 소분획을 silicagel chromatography (Hexane:EtOAc=60:1 to

1:1)로 분리하여 20개의 소분획으로 나누고 이중 F0905 소분획을 RP HPLC

(MeOH:H2O=73:27)로 분리하여 eudesma-4(14), 7(11)-dien-8-one (4, 41mg)를 분리하

였다. F10 소분획을 silicagel chromatography (Hexane:EtOAc=80:1 to 5:1)로 분리하여

atractylenolide 1 (1, 40mg)을 분리하였다.

백출 근경 4 kg을 건조 후 100% MeOH 3 L (1.5 L x 2)를 가하여 198분 동안 2회 초

음파 추출하였다. 용매는 감압농축하고 100% MeOH 추출물 292 g을 수득하였다 (수

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율: 7.3%). 수득한 100% MeOH 추출물을 증류수에 현탁한 후 극성지향적 분리기법에

따라 n-Hexane, CHCl3, EtOAc 및 n-BuOH로 분획하여 각각 117.1 g (수율: 2.93%),

24.4 g (수율: 0.61%), 6 g (수율: 0.15%), 10.6 g (수율: 0.27%)의 분획물을 얻

었다.

CHCl3 fraction을 step gradient silica gel chromatography (Hexane:EtOAc=100:0→)

를 이용하여 45개의 소분획으루 분리하였다. 이 중 C13~15, C22, C29 소분획을 재결정

시켜 각각 atractylenolide 2 (2,27.2mg), atractyenolide 3 (3, 61.2mg), 4,15-epoxy-8β

-hydroxyasterolide (5, 12,7mg)를 분리하였다. C33 소분획을 sephadex LH-20

(MeOH)로 분리하여 3-hydroxy atractylenolid 3 (6, 79.8mg)을 분리하였고 C45 소분획

을 step gradient silicagel column chromatography (CHCl3:MeOH=95:5→)로 분리하여

daucosterol (7,20.4mg)을 분리하였다. C38 소분획을 step gradient silicagel column

chromatography(n-Hexane:EtOAc:MeOH=15:4:1→)로 분리하여 10개의 소분획으로 나

눈 뒤, 소분획 C38-5와 C38-8을 RPHPLC (MeOH:H2O=70:30)으로 분리하여 각각

atractylodiol (10, 1mg)와 4(15)-eudesmene-1β,7,11-triol (8,27.9mg), 3-eudesmene-1

β,7,11-triol (9, 23.9mg)을 분리하였다. C38-10 소분획은 RP HPLCMeOH:H2O=50:50)

으로 분리하여 eudesma-3,7(11)-dien-5,15-dihydroxy-8,12-olide (11, 1.9mg)을 분리하

였다.

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Hexane 분획 117.1g을 step gradient silicagel chromatography (n-Hexane:EtOAc=

100:0→)을 시행하여 26개의 소분획으로 분리하였다. 이 중 H14소분획을 sephadex

LH-20 (n-Hexane:CH2Cl2:MeOH=7:7:1)로 분리하여 7개의 소분획으로 나눈 뒤,

H14-3, H14-6, H14-7 소분획을 RP HPLC (MeOH:H2O=85:15)로 분리, 각각

8β-methoxyatractylenolide (16, 3.3mg), eudesm-7(11)-en-4-ol (13, 1mg),

eudesm-4(15),7-diene-11-ol(14, 2.7mg)을 분리하였다. H18 소분획을 sephadex

LH-20을 시행하여 7개의 소분획으로 나눈 뒤, H18-7소분획을 sephadex LH-20

(n-Hexane:CH2Cl2:MeOH=7:7:1) 으로 분리하여 5개의 소분획으로 나누었다. 이중

H18-7-4 소분획을 RP HPLC (MeOH:H2O=90:10)으로 정제하여 atractylodiol (15,

1.3mg)을 분리하였고, H18-7-5 소분획을 RP HPLC (MeOH:H2O=85:15)으로 정제하여

8-epiasterolid (12, 1.6mg)을 분리하였다.

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라) 성분 분리 현황

물질명 분리량 (mg) 비고

AtractylenolideⅠ 40mg 효능연구

AtractylenolideⅡ 43mg

AtractylenolideⅢ 47mg 효능연구

Eudesma-4(14), 7(11)-diene-8-one 41mg 효능연구

4,15-epoxy-8β-hydroxyasterolide 12.7mg

3-hydroxy atractylenolide Ⅲ 79.8mg

Daucosterol 20.4mg

4(15)-eudesmene-1β,7,11-triol 27.9mg

3-eudesmene-1β,7,11-triol 23.9mg

atractylodiol 1mg

eudesma-3,7(11)-dien-5,15-dihydroxy-8,12-olide 1.9mg

8-epiasterolid 1.6mg

eudesm-7(11)-en-4-ol 1mg

eudesm-4(15),7-diene-11-ol 2.7mg

taenialactam B 1.3mg

8β-methoxyatractylenolide 3.3mg

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마) 분리 성분의 화학구조 (파일명:2009~2011 한약재(890) p233-241)

구조 화합물명 (compound number)

Atractylenolide I

Atractylenolide II

AtractylenolideⅢ

Eudesma-4(14), 7(11)-diene-8-one

4,15-epoxy-8β-hydroxyasterolide

3-hydroxy atractylenolide Ⅲ

Daucosterol

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4(15)-eudesmene-1β,7,11-triol

3-eudesmene-1β,7,11-triol

atractylodiol

eudesma-3,7(11)-dien-5,15-dihydroxy-8,12-olide

8-epiasterolid

eudesm-7(11)-en-4-ol

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바) 성분 분리 결과

백출의 성분을 분석하여 AtractylenolideⅢ, Eudesma-4(14), 7(11)-diene-8-one, 4,15-epoxy-8

β-hydroxyasterolide, 3-hydroxy atractylenolide Ⅲ, Daucosterol, 4(15)-eudesmene-1β,7,11-tri

ol, 3-eudesmene-1β,7,11-triol, Atractylodiol, eudesma-3,7(11)-dien-5,15-dihydroxy-8,12-olide,

8-epiasterolid, eudesm-7(11)-en-4-ol, eudesm-4(15),7-diene-11-ol, taenialactam B, 8β-meth

oxyatractylenolide의 총 16가지 성분을 분리하였다.

사) 지표성분 후보 선정

대표적인 생리활성성분 5종 (atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, e

udesma-4(14),7(11)-dien-8-one 및 atractylodin)을 지표성분으로 선정하였다. 위보호,

간보호, 항알러지, 중추신경 약리, 항염증, 항관절염, 심혈관 효능, 항암, 위장운동 효능

의 활성이 있었으며 효능지표물질은 atractylenolide Ⅰ였다.

eudesm-4(15),7-diene-11-ol

taenialactam B

8β-methoxyatractylenolide

Atractylenolide I Atractylenolide II Atractylenolide III Eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one

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5. 분석법 연구

(1) 연구수행 방법 및 연구내용

가) 수집시료 및 감별

백출 및 창출 시료는 동국대학교 한의과대학에서 수집하고 감별한 총 28종 (국산

11종, 중국산 16종 및 일본산 1종)의 시료를 제공받았다.

나) 분석대상 성분

① HPLC/DAD 분석법

백출의 5가지 생리활성성분 (atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide

III, eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one 및 atractylodin)을 사용하였다.

② LC-MS / MS분석법

백출의 생리활성성분 중 Atractylodin은 낮은 끓는점 (305.5 ± 34.0°C)과 높은

증기압력 (1.48 × 10-3 Torr)으로 인해 분석 중 ESI (electrospray ionization)

source에서 휘발되는 것으로 사료되어 분석대상성분에서 제외시키고 나머지 4종

(atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III 및 eudesma-4(14),

7(11)-dien-8-one)을 .사용하였다

(2) 연구결과

가) TLC 분석법 개발

백출의 생리활성성분 5종 (atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide

III,eudesma-4(14),7(11) -dien-8-one 및 atractylodin)을 대상으로 하였다. 전개용매가

Atractylodin

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hexane/ethyl acetate (90/20, v/v)일 때 백출의 생리활성성분 5종이 가장 좋은 분리도

를 보였다. UV/Vis 발색 결과 단파장 (254 nm)에서는 5종의 생리활성성분이 검출 되

었고, 장파장 (366nm)에서는 모든 성분이 검출되지 않았다. 따라서 5종의 생리활성성

분이 모두 검출된 UV/Vis 발색 (단파장 : 254 nm)으로 28종의 백출 및 창출 추출물을

동시에 분석하였다. UV/Vis 발색 결과 단파장 (254 nm)에서 5종의 생리활성성분이

0.2 이상의 Rf값으로 검출되었다

Thin layer chromatography of 28 Atractylodis Rhizoma Alba and Atractylodis Rhizoma samples (normal phase, UV 254 nm)

a. atractylenolide I, b. atractylenolide II, c. atractylenolide III,d. eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one and e. atractylodin

(1~10; A. japonica, 11~20; A. macrocephala, 21~25; A. chinensis and 26~28; A. lancea)

Thin layer chromatography of 28 Atractylodis Rhizoma Alba and Atractylodis Rhizoma samples(normal phase, color developing method using 10% sulfuric acid)

a. atractylenolide I, b. atractylenolide II, c. atractylenolide III,d. eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one and e. atractylodin


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나) HPLC-CAD 분석법 개발

① 백출의 추출법 최적화

동국대학교 한의과대학으로부터 백출 및 창출을 제공받아 이를 분말화한 후 50

호 (300 μm) 체로 균질화하고 이를 200 mg씩 정밀하게 취하여 10 mL의 추출용매를

가하였다

Table 4. The optimal condition of sample preparation

Extracting method Solvent Time

초음파추출법 80% MeOH 40분

② 시료제조 방법

백출 근경 1.5 kg을 건조 후 100% MeOH 3 L (1.5 L x 2)를 가하여 198분 동안 2회

초음파 추출하였다. 용매는 감압농축하고 100% MeOH 로 추출하였다.

수득한 100% MeOH 추출물을 증류수에 현탁한 후 극성지향적 분리기법에 따라

n-Hexane, CHCl3, EtOAc 및 n-BuOH로 분획하여 사용하였다.

③ 분석조건

Capcell PAK C18 UG120 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 칼럼을 사용한 결과 Optimapak

C18 (4.6× 250 mm, 5 μm) 칼럼에서 분리가 원할히 되지않았던 eudesma-4(14),

7(11)-dien-8-one과 atractylodin의 분리도를 개선할 수 있었고 피크의 tailing현상도 감

소시켰으며, 추출물 중 간섭성분과의 분리도도 향상시킬 수 있었다.

Column Capcell PAK C18 UG120 (4.6 × 250 mm, 5 μm)

Mobile phaseA : waterB : acetonitrile

Flow rate 1.0 mL/minColumn temp. 25°CWave length 236 nmInj. vol. 10 μL

Gradient

program

Time (min) A (%) B (%)0.0 50 50

35.0 35 6550.0 0 100

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④ 분석법 검증(validation)

선택성 (Selectivity) 관련, 백출의 5가지 생리활성성분의 머무름 시간은

atractylenolide I이 약 25.8분, atractylenolide II가 약 17.9분, atractylenolide III가 약

10.5분, eudesma-4(14), 7(11)-dien-8-one이 약 30.7분 그리고 atractylodin이 약

35.7분이었고, 백출의 다른 성분들로부터 간섭을 받지 않고 양호하게 분리되었다.

직선성 (Linearity)관련, 백출의 5가지 생리활성성분에 대하여 atractylenolide II,

atractylenolide III는 0.1~50 μg/mL, atractylenolide I, atractylodin은 0.5~50 μg/mL,

eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one은 0.4∼200 μg/mL의 농도 범위에서 검량선을

작성하였다. 모든 성분에 대하여 검량선의 상관계수 (R2)가 0.999 이상의 양호한

직선성을 나타내었다. 정확성 (Accuracy) 및 정밀성 (Precision) 관련, 일내 및 일간

정밀성은 피크 면적을 이용하여 얻어진 검량선에 의하여 정량한 농도의 표준

HPLC/DAD chromatogram of (A) standard compounds,(B) Atractylodes japonica Koidz., (C) Atractylodes macrocephala Koidz.,

(D) Atractylodes chinensis Koidz. and (E) Atractylodes lancea DC. extractsa. atractylenolide I, b. atractylenolide II, c. atractylenolide III,

d. eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one and e. atractylodin

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편차를 정량한 농도의 평균값으로 나눈 비의 백분율 (%)로서 구하였으며, 그 값은

1.6~5.8%이었다. 일내 및 일간 정확성은 검량선에 의하여 정량한 농도의 평균값을

기지의 농도로 나눈 비의 백분율 (%)로서 구하였으며, 그 값은 92.8~108.7% 이었다.

정량한계 (Limit of quantification, LOQ)관련, 백출의 5가지 생리활성성분 각각의

표준용액을 적정 농도로 희석하면서 분석하였을 때, atractylenolide II 및

atractylenolide III는 0.1 μg/mL, eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one은 0.4

μg/mL, atractylenolide I 및 atractylodin은 0.5 μg/mL로 정량한계를 설정하였다.

회수율 시험 (Recovery) 관련, 회수율 시험의 결과, 평균 회수율은 atractylenolide I이

2.0 μg/mL 농도에서 103.5%, 10 μg/mL 농도에서 100.9%, 20 μg/mL 농도에서

106.4%이었고, atractylenolide II는 2.0 μg/mL 농도에서 104.4%, 10 μg/mL 농도에서

107.0%, 20 μg/mL 농도에서 102.9%이었고, atractylenolide III는 2.0μg/mL 농도에서

98.4%, 10 μg/mL 농도에서 103.2%, 20 μg/mL 농도에서 104.1%이었고,

eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one이 2.0 μg/mL 농도에서 96.9%, 10 μg/mL 농도에서

95.7%, 20μg/mL 농도에서 95.5%이었고, atractylodin이 2.0 μg/mL 농도에서 95.1%, 10

μg/mL 농도에서 102.8%, 20 μg/mL 농도에서 90.7%로 모두 90% 이상의 양호한

회수율을 보였다. 피크면적의 반복성 (Repeatability)관련, 분석기기의 시간에 따른 변화

정도를 보기 위하여 백출의 5가지 생리활성성분의 표준용액을 연속 5회 분석하여

머무름 시간과 피크면적의 변화 정도를 평가하였다. - 반복성 시험 결과 머무름 시간

및 피크면적의 변화되는 정도는 RSD (%) 0.0~1.6으로 분석기기의 오차가 신뢰할 수

있는 수준임을 확인하였다. 완건성 시험 (Robustness) 관련, 칼럼에 대한 완건성

시험은 Capcell PAK C18 UG120 (4.6 × 250 mm, 5 μm) column,Optimapak C18 (4.6

× 250 mm, 5 μm) column, INNO C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) column을 이용하여

시험하였다. 칼럼 온도는 25, 30, 35°C의 조건에서 시험하였으며, 유속은 1.0 ±

0.1 mL/min의 조건에서 시험하였다. 각각의 조건에서 3회 반복하여 시험한 후

완건성을 평가하였다. 지표성분의 안정성 시험 (stability) 관련, 백출의 5가지

생리활성성분에 대하여 실온과 4°C 냉장 조건하에 20일간 시험을 진행하였다.

각각 1, 2, 5, 10, 20일이 경과하였을 때 HPLC/DAD 분석법에 적용하여 각 성분의

면적을 측정하여 각 성분들의 안정성을 평가하였다. 그 결과, 실온과 4°C 냉장

조건하에서 모두 평균적으로 97% 이상의 안정성을 보였다

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다) HPLC-MS/MS 분석법 개발

① 분석조건

백출의 생리활성성분 4종 (atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III

및 eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one)에 대하여 실시하였다. (Atractylodin은 낮은 끓는

점과 높은 증기압력으로 인해 분석 중 휘발되므로 분석대상성분에서 제외). 기타

MS/MS의 capillary voltage, source temperature, desolvation temperature, desolvation

gas, cone gas, collision gas, collision cell pressure, ion energy 1 and 2, RF lens 1

and 2등과 같은 파라미터를 최적화하여, 각 성분별로 최적의 감도와 분리능을 갖도록

조건을 설

정하였다.

Optimum LC-MS/MS condition for atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III and

eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one

InstrumentHPLC - Waters Alliance 2795 HPLC system

MS/MS - Waters Quattro micro API

Detection mode Positive mode

Column Hypersil Gold C18 column (2.1 × 150 mm, 5 μm)

Mobile phaseA : 2mM ammonium formate in waterB : methanol

Gradient program

Time A(%) B(%)0.0 60.0 40.00.2 60.0 40.00.7 5.0 95.05.0 5.0 95.05.1 60.0 40.09.0 60.0 40.0

Oven Temperature 30°C

Injection volume 5 μL

Flow rate 0.2 mL/min

Run time 9 min

Mode positive, MRM

Capillary voltage 4.5 kV Desolvation gas 650 L/hr

Source temp. 120°C Cone gas 50.0 L/hr

Desolvation temp. 350°C Collision cell pressure 4.0 × 10-3 m bar

Ion energy 3.0 RF lens 0.0 V

- 18 -

MS/MS parameters for atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III and

eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one

Fig. 19. (A) Precursor and (B) product ion spectra of atractylenolide I

Analytes Q1 (amu) Q3 (amu) Cone voltage (V)Collision energy

(eV)

Atractylenolide I 233.2187.6

35.0 15.0151.5

Atractylenolide II 231.2185.5

40.0 20.0157.5

Atractylenolide III 249.2231.6

25.0 10.0163.5

Eudesma-4(14),7(11)

-dien-8-one219.3

123.330.0 20.0

95.1

Atorvastatin (IS) 559.1 440.5 40.0 21.0

- 19 -

백출의 생리활성성분 4종 (atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III 및

eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one)을 대상으로 MS/MS MRM 방식으로 분석한 결과, 9

분 이내에 양호하게 분리되었다. Sesquiterpene 계열 성분의 구조적 유사성으로 동일한

MRM을 가지는 일부 간섭물질들이 검출되었으나, 다른 retention time을 가지므로 정

량에 방해가 되지 않았다.

LC-MS/MS chromatogram of active component standards

(A) atorvastatin (IS), (B) atractylenolide III, (C) atractylenolide I,

(D) atractylenolide II and (E) eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one

- 20 -

② 분석법 검증(validation)

선택성 (Selectivity) 관련 백출의 생리활성성분 4종 (atractylenolide I,

atractylenolide II, atractylenolide III 및 eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one)을

LC-MS/MS의 MRM mode로 분석한 결과, atractylenolide III가 약 5.87분

atractylenolide I이 약 6.17분, atractylenolide II가 약 6.51분, eudesma-4(14),

7(11)-dien-8-one이 약 6.88분 그리고 내부표준물질인 atorvastatin이 약 5.35분으로

다른 피크의 간섭을 받지 않고 양호하게 분리되었다. 직선성 (Linearity)관련, 백출의

4가지 생리활성성분에 대하여 eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one은 20~2000 ng/mL,

atractylenolide I, atractylenolide II 및 atractylenolide III는 50~2000 ng/mL의 농도

범위에서 검량선을 작성하였다. 모든 성분에 대하여 검량선의 상관계수 (R2)가 0.99

이상의 양호한 직선성을 보였다. 정확성 (Accuracy) 및 정밀성 (Precision) 관련,

백출의 4가지 생리활성성분의 일내 정확성과 정밀성을 확인하기 위하여 eudesma-4

(14), 7(11)-dien-8-one은 20, 100, 500, 2000 ng/mL, atractylenolide I, atractylenolide

II, atractylenolide III는 50, 100, 500, 2000 ng/mL의 4가지 농도에 대하여 하루에 3번

반복실험을 하였으며, 일간 정확성과 정밀성을 확인하기 위하여 3일간 반복실험하였다.

일내 및 일간 정밀성은 각 성분과 내부표준물질의 피크 면적비를 이용하여 얻어진

검량선에 의하여 정량한 농도의 표준편차를 정량한 농도의 평균값으로 나눈 비의

백분율 (%)로서 구하였으며, 그 값은 0.9~5.9% 이었다. 일내 및 일간 정확성은

검량선에 의하여 정량한 농도의 평균값을 기지의 농도로 나눈 비의 백분율 (%)로서

구하였으며, 그 값은 94.8~107.9% 이었다. 정량한계 (Limit of quantification,

LOQ)관련, 백출의 생리활성성분 4종 각각의 표준용액을 적정 농도로 희석하면서

분석하였을 때, 크로마토그램 상에서 신호대잡음비 (S/N ratio)가 10 이상이고,

정밀성이 20% 이하이며 정확성이 80~120%인 조건을 만족하는 농도로 정량한계를

설정하였다. Atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III는 10.0 ng/mL

그리고 eudesma-4(14),7(11)- dien-8-one은 20 ng/mL로 각각 정량한계를 설정하였다.

마) 함량 모니터링 및 통계

① HPLC-CAD 분석법

동국대학교 한의과대학으로부터 제공받은 국산 백출 11종, 중국산 백출 및 창출

- 21 -

16종과 일본산 창출 1종의 총 28종 백출 및 창출 시료를 개발한 추출법으로 추출하여

분석 시료를 조제하였다. 분석 시료를 확립된 HPLC/DAD 분석법에 적용하여 백출의

5가지 생리활성성분의 피크 면적을 구한 후 미리 작성한 검량선에 대입하여 추출용액

에서 각 생리활성성분의 농도를 구하였다. 이를 이용하여 28종의 백출 및 창출에

함유되어 있는 각 생리활성성분의 백분율 함량을 구하였다. 각 분석 시료는 3회

반복하여 분석하였다.총 28종의 시료 중 백출의 시료 함량 분석 결과, 백출시료 중

atractylenolide I의 평균 함량이 0.14%로 가장 많았고, atractylodin이 0.13%, eudesma-

4(14),7(11)-dien-8-one이 0.10%, atractylenolide III가 0.05%, atractylenolide II가

0.03%이었다. Atractylodin은 5가지 생리활성성분 중 함량 편차가 크게 나타났는데,

백출의 기원식물인 A. japonica 및 A. macrocephala에서는 함량이 적거나 검출되지

않았고, 창출의 기원식물인 A. chinensis 및 A. lancea에서는 그 함량이 많았다

- 22 -

6. 약리활성 연구

(1) 중추신경계 약리 작용, 항우울 작용

중추에서 억제성 신경전달물질인 GABA(γ-aminobutyric acid)의 작용과 관련되어 있

는 Cl- influx를 측정한 결과, 세 식물 모두 Cl- influx를 유발하였다. 백출 물 추출물

이 가장 큰 influx를 유발하였다. Rotarod test는 균형 유지 능력과 운동 유지 능력, 그

리고 진정 및 근이완 효능을 확인 할 수 있는 실험 방법으로 백출은 물추출물과 에탄

올 추출물 모두 endurance time을 증가시키고, falling frequency를 감소시키는 경향을

나타내어 운동 유지능력이 증가하였으나 유의성은 없었다. Forced swimming test는

항 우울 효능을 검색하는 방법으로, immobile duration이 감소되고 mobile duration이

증가하며 항 우울 효능이 있는 것이다. 백출의 물 추출물에서 immobile duration

이 감소하고 mobile duration이 유의성 있게 증가하는 것으로 보아 백출 물 추출물에

는 항 우울 효과가 있는 것으로 사료 된다

(2) 간보호 작용

백출의 H2O 추출물은 CCl4로 유도된 간세포 독성과 GalN로 유도된 간세포 독성을

현저히 억제하였다

Contents of atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one

and atractylodin in Atractylodis Rhizoma Alba and Atractylodis Rhizoma


- 23 -

(3) 심혈관 작용

TNF-a에 의한 adhesion molecules (ICAM_1,VCAM-1)의 발현 억제능을 관찰한 결과,

백출의 70% ethanol 추출물은 TNF-a에 의한 VCAM-1발현을 억제하였다.

(4) 항산화 작용 및 제산력

DPPH 시험법을 이용하여 실험한 결과 백출의 물 및 70% 에탄올추출물에서 IC50이

각각 8.0, 13.6 ug/mL로 항산화효과가 확인되었고 Lipid peroxidation을 이용하여 흡광

도를 측정한 결과 백출의 물 및 70 % 에탄올추출물 160 ug/mL에서 각각 74.8, 75.8%

로 지질과산화 억제효과를 확인 할 수 있었다. 제산력 시험관련 NaOH 소비량으로 억

제률을 계산한 결과, 백출의 물 및 70% 에탄올추출물에서 제산력이 각각 14.2%,

11.3%로 확인되었으며 HCl-ethanol이 유발하는 급성 위염모델에서 물과 70% EtOH

추출물 300 mg/kg은 백출이 각각 24.7%, 59.6%로, lesion이 억제됨을 확인하였다.

Indomethacin이 유발하는 만성 위염모델에서 백출의 물 및 70% 에탄올추출물 300

mg/kg이 각각 84.6%, 64.6%로 높게 억제하였다.

(5) 암세포 증식 저해 작용

한국인에서 많이 발생하는 6 대암 유래의 사람 암세포주를 이용하여 백출과 비교 생약

인 중국백출 및 북창출 물 및 70% 에탄올 추출물에 대한 암세포 증식 저해 효과를 관

찰한 결과, 중국백출 70% 에탄올 추출물에서 사람 폐암세포주인 A549 세포 (EC50 =

48.6 μg/mL)에서 우수한 암세포 성장 저해 효능을 나타내었다

(6) 위장 운동 작용

백출의 물 추출물에서 위장운동에서의 뛰어난 효능을 나타내었다. 백출의 물 및 70%

에탄올추출물이 급성위염모델과 만성위염모델에서 lesion의 억제효과를 보

여 주었는데, 이것은 항산화와 제산력 및 공격인자인 위액분비량 감소, 약간의 pH증가

및 total acid output의 감소에 의한 것으로 사료된다.

- 24 -

(7) 기억력 개선, 항불안 작용

백출의 70% 에탄올, 물 추출물은 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 동물 모델에게

기억력 개선 활성이 없었고, elevated plus-maze를 이용하여 항불안 활성을 확인한 결

과, open arms에 머무른 시간과 횟수가 대조군에 비해 차이를 나타내지 않아 항불안

효과도 없는 것으로 나타났다

(8) 항염증 효능

백출 70% 에탄올 추출물은 농도 의존적으로 세포주 RAW 264.7 대식세포에서 LPS에

의해 유도된 NO 생성 억제 되었으며, trasfected RAW 264.7 대식세포에서 NF-кB의

활성을 저해 효능을 나타내었고 iNOS와 COX-2의 protein 발현의 억제 효능을 보였다.

또한 백출 70% 에탄올 추출물 20 mg/kg, 100 mg/kg 을 처리한 carrageenan 유발형

급성 족부종실험에서 미약한 족부종 억제활성을 보였다

(9) 항알러지 활성

백출은 RBL-1 세포주의 5-lipoxygenase 저해활성이 있었고 이 활성물질은

atractylenolide I 으로 사료된다.

(10) 항관절염 작용

백출의 물추출물 및 에탄올추출물은 관절활막세포(HIG-82)에서 모두 1000 ㎍/㎖

농도에서 세포생존도가 91.8%와 99.6%로 독성을 나타내지 않았는데 IL-1β로 유도된

관절활막세포에서의 염증물질생성(PGE2, COX-2, MMP-3)에 대한 억제효과를

나타내어 관절활막 염증억제효과가 있는 것으로 나타났다. 실제로 콜라겐유도 염증성

관절염(CIA) 마우스에서 50 ㎎/㎏ 용량으로 28일 동안 경구 투여하였을 때 관절염

발병도(clinical score)와 관절 내 활막증식과 염증 억제 및 혈청 내 항콜라겐항체

(anti-CII IgG)의 농도를 감소시킴으로써 항관절염 효능이 있는 것으로 나타났다

- 25 -

7. 최신 연구 동향

구분 제목 주요내용

성분·

분석

Atractylochromene Is a Repressor of Wnt/β-Catenin Signaling in Colon Cancer Cells.

대장 암 세포에서 Wnt / β-catenin 시그널링의 억제자 역할을 하는 택사로 부터 분리된 Atractylochromene

약리·

독성

Anti-inflammatory and Antinociceptive Constituents of Atractylodes japonica Koidzumi.

백출의 항염 및 진통역할 성분들

Atractylodes lactone compounds inhibit platelet activation. 백출 락톤 화합물의 혈소판 활성 억제

Inflammatory Inhibitory Activity of Sesquiterpenoids from Atractylodes macrocephala Rhizomes.

백출 근경에서 분리된 Sesquiterpenoids의 염증 억제 활성

Induction of apoptosis and differentiation by atractylenolide-1 isolated from Atractylodes macrocephala in human leukemia cells.

인간의 백혈병 세포주에서 백출에서 분리된 atractylenolide-1에 의한 분화 및 아폽토시스의 유도

The Roots of Atractylodes macrocephala Koidzumi Enhanced Glucose and Lipid Metabolism in C2C12 Myotubes via Mitochondrial Regulation.

백출 뿌리가 미토콘드리아 조절을 통해 C2C12 Myotubes에서의 포도당 및 지질 대사를 개선시킴

1) 백출의 항염 및 진통역할 성분들

연구방법:

연구결과:

결론:

The rhizomes of many Atractylodes species, including Atractylodes chinensis

Koidzumi, Atractylodes macrocephala Koidzumi, and Atractylodes japonica Koidzumi,

are collectively termed Atractylodis Rhizoma. We prepared n-hexane extracts of the

three species and evaluated their anti-inflammatory effects on lipopolysaccharide

(LPS)-induced RAW 264.7 cells. Among all n-hexane extracts, those of A. japonica

most strongly inhibited nitric oxide (NO) production in LPS-induced RAW 264.7

cells; five sesquiterpenes, atractylon, atractylenolide I, atractylenolide II,

atractylenolide III, and 8-epiasterolid, were isolated from A. japonica. The

phytochemical content of A. japonica was similar to those of A. chinensis and A.

- 26 -

macrocephala. Moreover, the atractylon concentration was higher in A. japonica

than in A. chinensis and A. macrocephala. Atractylon significantly inhibited NO and

prostaglandin E2 production as well as inducible NO synthase and

cyclooxygenase-2 expression in LPS-induced RAW 264.7 cells. Atractylon (40

mg/kg) also significantly reduced the acetic-acid-induced writhing response,

carrageenan-induced paw edema, and hot-plate latent pain response in mice.

According to the results, A. japonica has anti-inflammatory and antinociceptive

effects and atractylon is the major active component of A. japonica. Therefore,

atractylon can be used as a bioactivity marker in A. japonica.

2) 백출 락톤 화합물의 혈소판 활성 억제

연구방법:

연구결과:

결론:

Platelets play a crucial role in the development and progression of

atherosclerosis-thrombosis and, therefore, antiplatelet drugs are widely used in the

treatment of coronary artery disease. Moreover, advances in understanding the

biological functions of natural plant products can provide new pharmacological

strategies aimed at promoting cardiovascular health. Atractylenolide I (ATL-1),

ATL-2, and ATL-3 are the major bioactive components of a Qi tonifying medicinal

herb Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (Atractylodes macrocephala), which is

commonly used in traditional Chinese medicine (TCM). These components possess

well-documented anti-inflammatory and anticancer activities, but their effects on

platelet activation are still unknown. In this study, the effects of ATL on platelet

function in vitro and in vivo were investigated, and the underlying mechanism was

explored. We found that ATL-2 and ATL-3 but not ATL-1 diminished

agonist-induced platelet aggregation and diminished adenosine triphosphate (ATP)

release from dense granules. The levels of phospho-Akt (Ser473) and phospho-p38

MAPK were downregulated in the presence of ATL-2 and ATL-3. We also found

- 27 -

that ATL-2 and ATL-3 have a similar inhibitory effect on platelet activation as

acetylsalicylic acid in response to agonists. Furthermore, ATL-2 and ATL-3

diminished the spreading of human platelets on immobilized fibrinogen (Fg), delayed

clot retraction in platelet-depleted plasma containing human platelets, extended first

occlusion time in a mouse model of ferric chloride (FeCl3)-induced carotid arterial

thrombosis, and prolonged the bleeding time. These observations suggest that

ATL-2 and ATL-3 are potential candidate therapeutic drugs for the prevention of

thrombosis.

3) 백출 근경에서 분리된 Sesquiterpenoids의 염증 억제 활성

연구방법:

연구결과: .

결론:

Three new sesquiterpenoids, 13-hydroxyl-atractylenolide II (1),

4-ketone-atractylenolide III (2), and eudesm-4(15)-ene-7β,11-diol (3), along with

eleven known compounds (4-14), were isolated from the rhizomes of Atractylodes

macrocephala. The structures and relative configurations of 1-3 were determined by

analysis of the spectroscopic data, and the absolute configurations of 1 and 2 were

assigned by circular dichroism technique. The anti-inflammatory activities of these

isolates were evaluated against lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in

macrophage RAW264.7 cells; compounds 4, 7, and 8 exhibited moderate efficacy

with IC50 values of 48.6±0.5, 46.4±3.2, and 32.3±2.9??M, respectively.

4) 인간의 백혈병 세포주에서 백출에서 분리된 atractylenolide-1에 의한 분화 및

아폽토시스의 유도 연구방법:

연구결과: .

결론:

Atractylodes macrocephula Koidz (A. macrocephula, also known as Baizhu) is an

important ingredient in several traditional Chinese herb complexes for the treatment

- 28 -

of abdominal pain and gastroenterology diseases for thousands of years. We

previously demonstrated the induction of ROS-mediated apoptosis by methanol

extract of A. macrocephula in human leukemia cells. After purification and

assessment of those active compounds from A. macrocephula ethanol extracts, in

this study, we focused on the major active compound, atractylenolide I (ATL-I).

Through MTT assay and morphology observation, we found cytotoxic effect of

ATL-I in human K562 chronic myeloblastic leukemia (CML), U937 acute

myeloblastic leukemia (AML) and Jurkat T lymphoma cells. In addition,

ATL-I-induced apoptosis was demonstrated by sub G1 and fragmented

chromosomal DNA detection using flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent

assay (ELISA) and agarose electrophoresis. Finally, we found ATL-I also induced

caspase-3 and caspase-9 activation through the detection of procaspase-3,

procaspase-9 and caspase-3 substrate poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) by

immunoblotting. Interestingly, we found that ATL-I induced not only apoptosis but

also differentiation, as upregulation of CD14 and CD68 surface markers and increase

of phagocytosis ability were discovered in ATL-I-treated K562 CML and U937

AML cells. Our study thus suggests the potential of developing new leukemia

therapies by using ATL-I for leukemia treatment in the future.

Copyright ? 2016 Elsevier Ltd. All rights reserved.

5) 백출 뿌리가 미토콘드리아 조절을 통해 C2C12 Myotubes에서의 포도당 및

지질 대사를 개선시킴

연구방법:

연구결과: .

결론:

The root of Atractylodes macrocephala Koidzumi (Atractylodis Rhizoma Alba, ARA)

is a Traditional Korean Medicine and has been commonly used for weight control.

Mitochondrial dysfunction appears to be a key contributor to insulin resistance, and

therefore mitochondrial targeting drugs represent an important potential strategy for

- 29 -

the treatment of insulin resistance and obesity. In this study, the authors

investigated the regulatory effects of ARA on mitochondrial function with respect

to the stimulation of glucose and lipid metabolism in C2C12 myotubes. After

differentiating C2C12 myotubes, cells were treated with or without different

concentrations (0.2, 0.5, and 1.0?mg/mL) of ARA extract. ARA extract significantly

increased the expression of peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1

alpha (PGC1α) and the downregulations of its targets, nuclear respiratory factor-1

(NRF-1), transcription factor A (TFAM), and total ATP content in C2C12

myotubes. ARA extract also increased the expressions of PGC1α activator and of

the metabolic sensors, AMP-activated protein kinase (AMPK), and acetyl-CoA

carboxylase and sirtuin (SIRT) 1. Furthermore, it significantly increased glucose

uptake by enhancing glucose consumption and subsequently decreased FFA

contents and increased carnitine palmitoyltransferase (CPT) 1b expression. Our

study indicates that ARA has a potential for stimulating mitochondrial function and

energy metabolism in muscle.

- 30 -

8. 종합고찰

백출(생약명; Atractylodis Rhizoma Alba) 성분을 분석하여 AtractylenolideⅢ,

Eudesma-4(14), 7(11)-diene-8-one, 4,15-epoxy-8β-hydroxyasterolide, 3-hydroxy

atractylenolide Ⅲ, Daucosterol, 4(15)-eudesmene-1β,7,11-triol, 3-eudesmene-1β,7,11-triol,

Atractylodiol, eudesma-3,7(11)-dien-5,15-dihydroxy-8,12-olide, 8-epiasterolid,

eudesm-7(11)-en-4-ol, eudesm-4(15),7-diene-11-ol, taenialactam B, 8β

-methoxyatractylenolide의 총 16가지 성분을 분리하였다. 대표적인 생리활성성분 5종

(atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, eudesma-4(14),

7(11)-dien-8-one 및 atractylodin)을 선정하였으며, 이 성분들의 정량분석을 통하여 백

출의 표준화 된 동시분석법을 개발하였다. 위보호, 간보호, 항알러지, 중추신경 약리,

항염증, 항관절염, 심혈관 효능, 항암, 위장운동 효능의 활성이 있었으며 효능지표물질

은 atractylenolide I 이었다. 개발된 HPLC-DAD 분석법은 일반적인 ODS 칼럼

(Capcell PAK C18 UG120, 4.6 × 250 mm, 5 μm)과 이동상으로서 물과 아세토니트릴

을 이용하여 분석의 편리성을 높였고 그 결과 60분 내에 생리활성성분의 분리 및 정량

이 가능하였으며, 밸리데이션을 통하여 이 분석법의 신뢰성과 완건함을 검증하였다. 분

석법을 제공받은 백출 및 창출 시료에 적용하여 패턴분석을 실시한 결과 기원식물별로

성분함량에 차이를 보였다. 약리활성 연구를 통하여 백출이 중추신경계 약리 작용, 항

우울 작용, 간보호 작용, 심혈관 작용, 항산화 작용 및 제산력 효능, 암세포 증식 저해

작용, 위장운동작용, 항염증 효능, 항알러지 활성, 항관절염 효능이 있음을 확인하였다.

그러나 기억력 개선, 항불안에 효능은 없는 것으로 확인되었다. 최근의 연구를 조사

한 결과 대장 암 세포에서 Wnt / β-catenin 시그널링의 억제자 역할을 하는 택사로

부터 분리된 Atractylochromene 연구, 백출의 항염 및 진통역할 성분들에 대한연구,

백출 락톤 화합물의 혈소판 활성 억제에 대한연구, 백출 근경에서 분리된

Sesquiterpenoids의 염증 억제 활성 연구, 인간의 백혈병 세포주에서 백출에서 분리된

atractylenolide-1에 의한 분화 및 아폽토시스의 유도 연구, 백출 뿌리가 미토콘드리아

조절을 통해 C2C12 Myotubes에서의 포도당 및 지질 대사를 개선시킴에 대한 연구가

진행되고 있음을 확인하였다.

- 31 -

※ 별첨

(1) 백출의 지표성분 검토

(2) 백출의 분석 가이드라인

(3) 백출의 지표성분 표준품 제조 가이드라인

- 32 -

9. 참고문헌

1. 한약재 품질 표준화 연구 사업단 연구개발과제 최종보고서(2009~2011)

2. 한약재 관능검사 해설서

3. 대한민국약전 제11개정 (제2016-57호)

4. 중국약전 2015

5. 일본약전 16th

6. Chen LG, Jan YS, Tsai PW, Norimoto H, Michihara S, Murayama C, Wang CC.

Anti-inflammatory and Antinociceptive Constituents of Atractylodes japonica

Koidzumi. J Agric Food Chem. 2016 Mar 23;64(11):2254-62. doi:

10.1021/acs.jafc.5b05841. Epub 2016 Mar 14.

7. Chen Y, Yang W, Guo L, Wu X, Zhang T, Liu J, Zhang J. Atractylodes lactone

compounds inhibit platelet activation. Platelets. 2016 Aug 25:1-9. [Epub ahead of

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8. Hoang le S, Tran MH, Lee JS, Ngo QM, Woo MH, Min BS. Inflammatory

Inhibitory Activity of Sesquiterpenoids from Atractylodes macrocephala Rhizomes.

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9. Huang HL, Lin TW, Huang YL, Huang RL. Induction of apoptosis and

differentiation by atractylenolide-1 isolated from Atractylodes macrocephala in

human leukemia cells. Bioorg Med Chem Lett. 2016 Apr 15;26(8):1905-9. doi:

10.1016/j.bmcl.2016.03.021. Epub 2016 Mar 8.

10. Song MY, Kang SY, Oh TW, Kumar RV, Jung HW, Park YK. The Roots of

Atractylodes macrocephala Koidzumi Enhanced Glucose and Lipid Metabolism in

C2C12 Myotubes via Mitochondrial Regulation. Evid Based Complement Alternat

Med. 2015;2015:643654. doi: 10.1155/2015/643654. Epub 2015 Nov 4.

11. Shim AR, Dong GZ, Lee HJ, Ryu JH. Atractylochromene Is a Repressor of

Wnt/β-Catenin Signaling in Colon Cancer Cells. Biomol Ther (Seoul). 2015

Jan;23(1):26-30. doi: 10.4062/biomolther.2014.095.

- 33 -

[별첨 1] 지표성분 검토

화학팀 지표물질 제시효능팀 지표물질 제시

(약리학효능)분석팀 지표물질 제시

(함량기준)종합의견

백출로부터 총 16가지 단일 성분을 분리해

내었다

tractylenolide

Ⅰ(위보호, 간보호,

항알러지, 중추신경

약리, 항염증,

항관절염, 심혈관

효능, 항암, 위장운동

효능)

atractylenolide I,

atractylenolide II,

atractylenolide III 및

eudesma-4(14),

7(11)-dien-8-one

Atractylodin은 낮은 끓는점 (305.5

± 34.0°C)과 높은 증기압력

(1.48 × 10-3 Torr)으로 인해

분석 중 ESI (electrospray

ionization) source에서 휘발되는

것으로 사료되어 분석대상 성분

에서 제외시켰음

결론

백출의 성분을 분석하여 AtractylenolideⅢ, Eudesma-4(14), 7(11)-diene-8-one,

4,15-epoxy-8β-hydroxyasterolide, 3-hydroxy atractylenolide Ⅲ, Daucosterol,

4(15)-eudesmene-1β,7,11-triol, 3-eudesmene-1β,7,11-triol, Atractylodiol,

eudesma-3,7(11)-dien-5,15-dihydroxy-8,12-olide, 8-epiasterolid, eudesm-7(11)-en-

4-ol, eudesm-4(15),7-diene-11-ol, taenialactam B, 8β-methoxyatractylenolide의

총 16가지 성분을 분리하였고, 위보호, 간보호, 항알러지, 중추신경 약리, 항염증,

항관절염, 심혈관 효능, 항암, 위장운동 효능의 활성이 있었으며 효능지표물질은

atractylenolide Ⅰ였다.

- 34 -

[별첨 2] 분석 가이드라인

백출(白朮)

기원

약전 생약명 기원

KPAtractylodis Rhizoma

Alba

Atractylodes japonica Koidzumi or Atractylodes


CP Atractylodis Rhizoma Atractylodes lancea(Thunb.) DC. or Atractylodes


JP Atractylodis Rhizoma Atractylodes japonica Koidzumi or Atractylodes


지표성분


III, eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one 및 atractylodin)을 사용하였다

검액제조

백출 근경 1.5 kg을 건조 후 100% MeOH 3 L (1.5 L x 2)를 가하여 198분 동안 2회 초음파

추출하였다. 용매는 감압농축하고 100% MeOH 로 추출하였다. 수득한 100% MeOH

추출물을 증류수에 현탁한 후 극성지향적 분리기법에 따라 n-Hexane, CHCl3, EtOAc 및

n-BuOH로 분획하여 사용하였다

분석조건HPLC CAD

Column Capcell PAK C18 UG120 (4.6 × 250 mm, 5

μm)

Mobile phase A : water

B : acetonitrile


Column temp. 25°C

Wave length 236 nm

Inj. vol. 10 μL

Gradient program

Time (min) A (%) B (%)0.0 50 50

35.0 35 6550.0 0 100

함량평균치

총 16종의 단일 성분을 분리 atractylenolide I atractylodin atractylenolide III

0.14% 0.13% 0.05%

함량제안

공정서 기준 함량제안

KP11 CP 2015 JP 16 KP

정유함량 0.5

mL 이상

(50.0 g).

atractylodin

(C13H10O)0.

30%이상

- 35 -

백출(白朮)

기원

약전 생약명 기원

KPAtractylodis Rhizoma

Alba

Atractylodes japonica Koidzumi or Atractylodes


CP Atractylodis Rhizoma Atractylodes lancea(Thunb.) DC. or Atractylodes


JP Atractylodis Rhizoma Atractylodes japonica Koidzumi or Atractylodes


지표성분


III, eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one 및 atractylodin)을 사용하였다

검액제조

4종 (atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III 및 eudesma-4(14), 7(11)-dien-8-one)을 사용하였다

분석조건LCMS



ColumnHypersil Gold C18 column (2.1 × 150 mm, 5

μm)

Mobile phaseA : 2mM ammonium formate in water

B : methanol




Run time 9 min

Mode positive, MRM

함량평균치

총 16종의 단일 성분을 분리 atractylenolide I atractylodin atractylenolide III

0.14% 0.13% 0.05%

함량제안

공정서 기준 함량제안

KP11 CP 2015 JP 16 KP

정유함량 0.5

mL 이상

(50.0 g).

atractylodin

(C13H10O)0.

30%이상

- 36 -

[별첨 3] 지표성분 표준품 제조 가이드라인

① atractylenolide Ⅰ

□ 백출로부터 분리

□ 물리화학적 특성

[붙임 1.1] 구조 동정

□ 1H-NMR (CDCl3, 500MHz)

N/A

□ 13C-NMR (CDCl3, 125MHz)

N/A

□ MSN/A

□ IRN/A

○ 성상 백색 바늘 결정

○ 이명 8,9-Dehydroasterolide

○ CAS number 73069-13-3

○ 분자식 C15H18O2

○ 녹는점(℃) 405 °C at 760 mmHg.

○ 구조

- 37 -

[붙임 2] 분석법 개발

□ HPLC-CAD

○ 분석조건

Column Capcell PAK C18 UG120 (4.6 × 250 mm, 5 μm)

Mobile phaseA : waterB : acetonitrile

Flow rate 1.0 mL/minColumn temp. 25°CWave length 236 nmInj. vol. 10 μL

Gradient

program

Time (min) A (%) B (%)0.0 50 50

35.0 35 6550.0 0 100

○ HPLC chromatogram

HPLC/DAD chromatogram of (A) standard compounds,(B) Atractylodes japonica Koidz., (C) Atractylodes macrocephala Koidz.,

(D) Atractylodes chinensis Koidz. and (E) Atractylodes lancea DC. extractsa. atractylenolide I, b. atractylenolide II, c. atractylenolide III,

d. eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one and e. atractylodin

- 38 -

□ HPLC-MS/MS

○ 분석조건



Detection mode Positive mode

Column Hypersil Gold C18 column (2.1 × 150 mm, 5 μm)

Mobile phaseA : 2mM ammonium formate in waterB : methanol

Gradient program

Time A(%) B(%)0.0 60.0 40.00.2 60.0 40.00.7 5.0 95.05.0 5.0 95.05.1 60.0 40.09.0 60.0 40.0




Run time 9 min

Mode positive, MRM

Capillary voltage 4.5 kV Desolvation gas 650 L/hr

Source temp. 120°C Cone gas 50.0 L/hr

Desolvation temp. 350°C Collision cell pressure 4.0 × 10-3 m bar

Ion energy 3.0 RF lens 0.0 V

- 39 -

○ HPLC chromatogram

LC-MS/MS chromatogram of active component standards

(A) atorvastatin (IS), (B) atractylenolide III, (C) atractylenolide I,

(D) atractylenolide II and (E) eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one

- 40 -

[붙임 3] 분석법 밸리데이션

□ HPLC-CAD

- 범위, 직선성(Linearity), 검출한계 및 정량한계

Calibration curves of atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III,

eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one and atractylodin

- 41 -

Limit of quantification of atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III,


Compounds LOQ (μg/mL)

Atractylenolide I 0.5Atractylenolide II 0.1Atractylenolide III 0.1

Eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one 0.4Atractylodin 0.5

- 회수율 (Recovery)

Recovery of atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III,

eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one and atractylodin through standard addition

- 재현성,반복성( reproducibility, Repeatability)

Repeatability of analytical system

Compounds

Spiked

Concentrations

(μg/mL)

Recovery (n=5)

Mean (%) RSD (%)

Atractylenolide I2 103.5 7.5

10 100.9 3.420 106.4 2.0

Atractylenolide II2 104.4 8.8

10 107.0 3.020 102.9 1.1

Atractylenolide III2 98.4 8.4

10 103.2 3.620 104.1 4.7

Eudesma-4(14),7(11)

-dien-8-one

2 96.9 0.910 95.7 2.220 95.5 2.3

Atractylodin2 95.1 6.6

10 102.8 4.520 90.7 3.5

CompoundsRetention time (n=5) Peak area (n=5)

Mean (min) RSD (%) Mean (min) RSD (%)

Atractylenolide I 25.8 0.1 39636.3 1.6

Atractylenolide II 17.9 0.0 86437.2 0.9

Atractylenolide III 10.5 0.1 86214.3 1.0

Eudesma-4(14),7(11) 30.7 0.1 130478.8 0.9

- 42 -

- 정확도 및 정밀성 (Precision & Accuracy)

Intra-, inter-day precision and accuracy of atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III,


- 완건성(Robustness)System suitability and Robustness of atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one and atractylodin (n=3)

CompoundsConc.

(μg/mL)

Precision (C.V., %) Accuracy (%)Intra-day

(n=5)Inter-day

(n=5)Intra-day

(n=5)Inter-day

(n=5)

Atractylenolide I

0.5 3.4 5.8 102.5 107.62 3.9 3.6 105.5 102.6

10 4.0 2.9 101.4 99.650 4.1 1.5 105.9 100.4

Atractylenolide II

0.1 4.8 1.9 96.5 108.72 2.9 1.7 103.7 93.5

10 4.9 3.1 103.3 90.450 4.8 3.3 102.9 92.1

Atractylenolide III

0.1 3.9 3.7 96.7 108.22 3.4 1.6 104.3 100.5

10 4.3 5.5 102.7 96.850 2.9 4.0 104.4 98.1

Eudesma-4(14),7(11)

-dien-8-one

0.4 4.8 4.3 97.2 92.88 2.0 5.3 100.4 103.7

40 3.7 2.9 101.4 105.5200 3.4 2.6 102.4 99.7

Atractylodin

0.5 2.3 5.3 98.6 106.52 4.2 2.5 102.4 102.1

10 4.5 2.7 102.6 99.750 1.6 3.5 100.5 98.4

-dien-8-one

Atractylodin 35.7 0.1 66204.8 0.5

System suitability and Robustness

Compounds Analytical conditionTheoretical

plate (N)

Capacity

factor (K')

Separation

factor (a)

Resolution

(Rs)

Atractylenolide I ColumnCapcell PAKC18 UG120

36383.4 13.1 1.5 15.3

Optimapak C18 58332.5 17.9 1.4 18.3

- 43 -

INNO C18 52936.9 18.8 1.4 17.1

Column

Temp.

25°C 36336.2 13.4 1.5 15.730°C 36092.2 13.1 1.5 15.635°C 36597.7 12.7 1.5 15.6

Flow rate0.9 mL/min 36547.1 14.6 1.5 15.61.0 mL/min 36336.2 13.4 1.5 15.71.1 mL/min 36547.1 12.3 1.5 15.0

Atractylenolide II

Column

Capcell PAKC18 UG120

23470.4 8.8 1.9 18.6

Optimapak C18 38563.3 12.4 1.9 23.7INNO C18 34062.3 13.2 1.9 22.7

Column

Temp.

25°C 23466.3 9.0 1.9 18.530°C 24517.1 8.8 1.9 18.435°C 24534.6 8.5 1.9 18.2


Atractylenolide III

Column


12431.3 4.6 1.9 18.6


Column

Temp.

25°C 13440.5 4.8 1.9 18.530°C 13550.0 4.7 1.9 18.435°C 13461.4 4.6 1.9 18.2


Eudesma-4(14),7(11)

-dien-8-one

Column


42218.7 15.9 1.2 8.7


Column

Temp.

25°C 43056.8 16.2 1.2 8.830°C 42355.0 15.8 1.2 8.935°C 40068.2 15.4 1.2 9.1


Atractylodin

Column


58511.3 18.6 1.2 8.2


Column

Temp.

25°C 58577.2 18.9 1.2 8.430°C 58256.8 18.5 1.2 8.435°C 58624.6 18.0 1.2 8.2


- 44 -

- 안정성 (Stability of analytes)

Stability test of atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one

and atractylodin (n=3)

CompoundsTemp.

(°C)Reference 1일 2일 5일 10일 30일 Mean

R.S.D.(%)

Atractylenolide IR.T. 100.0 99.1 99.4 103.3 102.3 103.1 101.4 2.14°C 100.0 98.6 100.8 103.6 104.3 104.5 102.4 2.6

Atractylenolide IIR.T. 100.0 99.1 99.8 103.6 102.8 106.9 102.4 3.24°C 100.0 98.8 101.2 102.5 103.8 106.8 102.6 3.0

Atractylenolide IIIR.T. 100.0 97.4 98.1 103.4 106.3 107.4 102.5 4.64°C 100.0 97.4 97.9 101.6 103.1 105.6 101.1 3.5

Eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one

R.T. 100.0 94.2 97.9 99.8 100.8 101.7 98.9 3.04°C 100.0 94.3 98.2 98.8 99.3 98.9 97.9 2.0

AtractylodinR.T. 100.0 98.6 99.7 102.1 102.8 104.6 101.6 2.44°C 100.0 99.0 99.8 101.8 102.2 102.7 101.1 1.6

Stability test of atractylenolide I, atractylenolide II, atractylenolide III, eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one

and atractylodin at (A) room temperature and (B) 4°C

- 45 -

□ HPLC-MS/MS

- 범위, 직선성(Linearity), 검출한계 및 정량한계

Fig. 24. Calibration curves of 4 active components of Atractylodis Rhizoma Alba

Limit of quantification of 4 active components of Atractylodes Rhizoma Alba

Compounds LOQ (ng/mL)

Atractylenolide I 50

Atractylenolide II 50

Atractylenolide III 50

Eudesma-4(14),7(11)-dien-8-one 20

- 46 -

- 정확도 및 정밀성 (Precision & Accuracy)

Intra-, inter-day precision and accuracy of 4 active components

of Atractylodis Rhizoma Alba

CompoundsConc.

(ng/mL)

Precision (C.V., %) Accuracy (%)

Intra-day(n=3)

Inter-day(n=3)

Intra-day(n=3)

Inter-day(n=3)

Atractylenolide I

50 1.5 2.1 105.7 102.1

100 0.9 4.4 99.0 104.5

500 1.8 4.9 94.8 97.9

2000 2.3 1.8 100.4 99.3

Atractylenolide I

50 2.0 1.8 101.9 104.2

100 2.7 3.4 100.0 107.9

500 2.5 2.8 92.2 100.5

2000 2.1 2.9 96.7 101.6

Atractylenolide I

50 3.5 3.8 98.8 97.5

100 2.2 4.6 101.0 99.8

500 1.8 1.2 97.4 100.6

2000 1.9 5.0 102.8 104.4

Eudesma-4(14)-7(11)

-dien-8-one

20 3.9 4.2 107.6 107.6

100 0.9 1.4 105.1 103.1

500 2.7 2.7 100.6 101.0

2000 2.5 5.9 103.4 96.4

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