Upload
others
View
7
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
i {jy\ V Л Н
а правах рукописи
Носарева Олеся Валерьевна
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА ESAT6
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
03 00 03—молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
0 0 3 1 6 2 0 G 2
Кольцове 2007
Работа выполнена во ФГУН Государственный научный центр вирусологии и
биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты
прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России
Научный руководитель
кандидат химических наук С И Татьков
Официальные оппоненты
доктор биологических наук, профессор Л Ф Гуляева кандидат биологических наук С В Серегин
Ведущая организация
Научноисследовательский институт туберкулеза, г Новосибирск
Защита состоится 9 ноября 2007 г в 13 30 часов на заседании диссертационного совета Д 208 020 01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559,тел (383)3367428
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Автореферат разослан « Л » октября 2007 г
Ученый секретарь диссертационного совета ^ Э Г Малыгин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования С туберкулезом (ТБ) человечество знакомо очень давно Однако мы до оих пор
очень мало знаем о механизмах, позволяющих микобактериям в обход защитных сил организма длительное время сосуществовать в виде латентной инфекции у одной трети мирового населения и поджидать подходящего случая для разития заболевания (Stewart et al, 2003, Tufanello et al, 2003) Несмотря на предпринимаемые мировым сообществом меры неуклонно продолжает возрастать распространение лекарственноустойчивого ТБ В октябре 2006 г ВОЗ декларировала появление форм о широкой лекарственной устойчивостью, для лечения которых отсутствуют эффективные лекарственные средства Поэтому возрастает роль иммунопрофилактики и ранней диагностики заболевания В настоящее время для вакцинопрофилактики ТБ применяется живой апенуированный штамм Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerm (BCG), однако, индуцируемый им протективный эффект варьирует от 0 до 80 % (Aronson et a l , 2004) Для скринингового выявления инфицированных ТБ лиц применяется кожный теот, основанный на использовании грубого экстракта фильтрата культур М tuberculosis — туберкулина, или PPD (purified protein derivative), для определения реакций клеточного иммунитета, вызываемых микобактериями Специфичность туберкулиновых тестов ограничена невозможностью дифференцировать заболевание от поствакцинального состояния либо от инфицирования невирулентными микобактериями Точный диагноз ТБ предусматривает обнаружение М tuberculosis в материале от пациента, но микроскопические исследования не позволяют выявлять абациллярных больных и больных нелегочными формами ТБ, а культуральные методы еще требуют длительного времени для постановки диагноза В настоящее время активно исследуется возможность использования новых высокоиммуногенных видоспецифичных антигенов в диагностике ТБ Однако и здесь остаются проблемы, как, например, повышение чувствительности таких диагностических тестов без снижения их специфичности
С развитием современных методов исследования генома мы приблизились к разгадке проблем вирулентности микобактерий и к возможности создания более эффективных препаратов для вакцинопрофилактики ТБ В 1996 г путем сравнения геномов патогенных микобактерий М bovis и М tuberculosis и микобактерий вакцинного штамма BCG были обнаружены области, кодирующие более 100 высокоиммуногенных белков, пригодных для диагностики и создания альтернативных вакцинных конструкций Наиболее интересная область генома RD1 (region of deletion) присутствует только в патогенных штаммах микобактерий и делетирована из генома вакцинного штаммаМ bovis
BCG, а значит белки, кодируемые этой областью, могут оказаться ценными для дифференциальной диагностики Кроме того, эти белки могут стать вакцинными кандидатами, так как отвечают за вирулентность микобактерий и, возможно, будут индуцировать протективный иммунитет С их использованием открываются возможности для создания субъединичных и ДНКвакцин, однако, до сих пор до практики не доведена ни одна альтернатива существующей вакцины BCG, которая бы превосходила ее по своим протективным свойствам Одним из возможных направлений совершенствования субъединичных и ДНКвакцин является поиск более эффективных способов их доставки в организм Ранее было показано, что при введении в организм мышей полисахаридных частиц, в оболочке которых находятся суммарные антигены BCG, индуцируется клеточный иммунный ответ, а рибонуклеиновая кислота, находящаяся в их ядре, устойчива к действию рибонуклеаз Такие конструкции были названы искусственными микобактериальными частицами (МБЧ) Оставалось неясным, будет ли их введение животным приводить к формированию протективного иммунитета против М tuberculosis,
возможно ли их использование для доставки в организм животных ДНК, обеспечивающих синтез т vivo микобактериальных антигенов, а также будет ли формироваться иммунный
3
ответ на эти антигены и каким он будет преимущественно гуморальным или клеточным'
Цель настоящей работы заключалась в изучении возможности использования рекомбинантного белка ESATб для диагностики туберкулёза и изучении особенностей иммунного ответа у лабораторных животных, вызываемого ДНКконструкцией, обеспечивающей синтез т vivo антигена esxA M tuberculosis, с применением полисахаридной системы доставки
Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи: 1 Получить рекомбинантный штамм Е coli, опособный продуцировать
микобактериальный антиген ESATб, и оценить диагностический потенциал рекомбинантного белка ESATб
2 Оценить возможность формирования протективного иммунного ответа к заражению М bovis морских свинок, иммунизированных искусственными микобактериальными частицами на основе полисахаридной системы доставки
3 Создать экспериментальный препарат на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей антиген ESATб, и полисахаридной системы доставки
• сконструировать рекомбинантную плазмиду, обеспечивающую синтез антигена ESATб в эукариотической системе,
• получить конъюгат полиальдегиддекстранспермидин, • получить экспериментальный препарат и проверить его стабильность 4 Исследовать иммуногенные свойства экспериментального препарата на
мышиной модели 5 Оценить безопасность применения экспериментального препарата для живых
организмов
Положения, выносимые на защиту. 1 Плазмидная конструкция, включающая ген esxA M tuberculosis, обеспечивает
синтез рекомбинантного белка GSTESAT6 в клетках Е coh
2 Использование рекомбинантного белка GSTESAT6 в ИФА позволяет выявлять антитела, специфичные кМ tuberculosis
3 Использование рекомбинантного белка GSTESATб в ELISA/ИФНу анализе позволяет проводить дифференциальную диагностику активного туберкулеза и поствакцинального иммунитета
4 Искусственные микобактериальные частицы на основе полисахаридного конъюгата и экспонирующие на своей поверхности суммарные белки М bovis BCG обладают иммуногенностью и протективными свойствами на экспериментальной модели животных
5 Экспериментальный препарат на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей антиген ESATб, и полисахаридной системы доставки обладает Тклеточной иммуногенностью на мышиной модели и безопасен для животных
Научная новизна и практическая значимость работы: Впервые получен рекомбинантный штамм Е coh, продуцировавший
микобактериальный рекомбинантный белок GSTESATб, который оказался пригоден для диагностики активного ТБ Важным результатом выполненной работы явилось определение чувствительности ИФА при выявлении антител класса IgG к антигену ESAT6 М tuberculosis, которая составила 60 %, при специфичности 95 %
В результате проделанной работы впервые был показан протективный иммунный ответ при заражении М bovis иммунизированных искусственными микобактериальными частицами морских свинок
4
Впервые сконструирована плазмида pONE6, содержащая ген esxA, экопрессирующая микобактериальный антиген ESAT6, на основе которой создан экспериментальный препарат «КрОМЕб», окруженный полиоахаридной оболочкой из молекул модифицированного полиглюкина и спермидина, способной защищать нуклеотидный материал от деградации нуклеазами
Впервые показано, что иммунизация экспериментальным препаратом «KpONE6» лабораторных животных приводит к формированию специфического клеточного иммунного ответа, а сам препарат не обладает «острой» токсичностью И является безопасным для применения на животных
Полученные данные настоящей работы по иммуногенности экспериментального препарата могут лечь в основу дальнейшего исследования его протективных свойств на лабораторных животных
Апробация работы и публикации:
Полученные результаты исследований были доложены на международном симпозиуме «Интегративная Медицина в XXI веке» (Судак, Украина, 2004), международном Кейстоуновском симпозиуме «Интеграция хозяина и патология патогена» (Вистлер, Канада, 2005), VI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, Россия, 2005), интернациональном конгрессе «Новые подходы в вакцинных разработках» (Берлин, Германия, 2005), международной школеконференции «Системная биология и биоинженерия» (Москва, Россия, 2005), международном междисциплинарном семинаре «Новые технологии в интегративной медицине и биологии» (БангкокПатайя, Таиланд, 2006), П интернациональной конференции «ТБ вакцины в мире» (Вена, Австрия, 2006), международной школеконференции молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках Международного Симпозиума «ЕС—Россия перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7ой Рамочной программе» (СанктПетербург, Россия, 2006), VI Всероссийской конференции молодых ученых в рамках 13 Международного конгресса по приполярной медицине (Новосибирск, Россия, 2006), III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), XVI ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Общества (Мюнхен, Германия, 2006), I летней международной школе по инфекционным заболеваниям «КохМечниковский форум» (Берлин, Германия, 2006), 37ом союзе международных конференций по патологии легких (Париж, Франция, 2006), 3ей международной конференции по вакцинам «Перспективы вакцинных разработок медицинская необходимость и социальное значение» (Баден, Австрия, 2007), РоссийскоГерманской конференции Форума Коха Мечникова (Томск, Россия, 2007)
По материалам диссертации было опубликовано четыре статьи, 3 из них в журналах, рекомендованных ВАК для кандидатских диссертаций
Настоящая работа была выполнена в лаборатории разработки новых методов диагностики заболеваний человека ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» эксперименты по клонированию, получению и исследованию рекомбинантных белков, получению экспериментальных препаратов для иммунизации животных и исследованию их иммуногенных и токсических свойств, на базе ГНУ Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН эксперименты по заражению Mbovis иммунизированных морских свинок и оценке протективных свойств микобактериальных частиц
Выражаю глубокую благодарность за неоценимую помощь и поддержку в планировании и проведении экспериментов, обсуждении полученных результатов и подготовке диссертации Андрею Егоровичу Нестерову
5
Искренне признательна профессору Георгию Михайловичу Игнатьеву за ценные советы в подготовке экспериментов, терпение и помощь в осмыслении результатов.
Благодарна всем сотрудникам лаборатории разработки новых методов диагностики заболеваний человека ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»: А.Н. Болдыреву за возможность ежедневных обсуждений результатов экспериментов, кб.н. О.Ю. Смирновой за обучение методикам клонирования и человеческую поддержку, к.б.н. Агафонову А.П., кб.н. М.Ш. Азаеву, к.х.н. Ю.В. Туманову и к.вет.н. А.Н.. Донченко за удачное совместное проведение экспериментов.
Особую благодарность выражаю своему научному руководителю к.х.н. Сергею Ивановичу Татькову за поддержку, участие в обсуждении результатов и предоставленную свободу действий для совместного выполнения части экспериментов с нашими коллегами ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Благодарю моих родителей, брата и моих друзей, оказывавших мне всестороннюю поддержку, как при проведении экспериментов, так и при написании диссертации.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из
введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 235 работ: 27 отечественных авторов и 208 зарубежных. Работа иллюстрирована 18 рисунками и включает 6 таблиц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Получение и исследование гибридного белка GSTESAT6 В настоящее время большое внимание уделяется изучению специфичных
микобактериальных антигенов, так как одной из главных задач разработки новых препаратов вакцинопрофилактики ТБ является выделение компонентов микобактерий, преимущественно активирующих макрофаги, и устранение продуктов, усиливающих тканевую деструкцию. Анализ данных литературы по антигенному спектру
микобактериальных белков показал, что среди них наиболее интересными и перспективными кандидатами для создания на их основе диагностических реагентов и вакцин являются антигены ESAT6 и CFP10 (Berthet el al„ 1998; Brodin et al., 2005).
ESAT6 (early secreted antigen target) и CFP10 (culture filtrate protein) белки, гены которых находятся в RD1 области, отсутствующей во всех вакцинных штаммах BCG, производимых в разных странах, так как именно этот участок генома был делегирован из патогенного штамма М. bovis в ходе получения аттенуированного вакцинного штамма (Flint e ta l , 2004).
Рис. 1. Математическая модель комплекса CFP10ESAT6.
Гены esxA и esxB, кодирующие белки ESAT6 и CFP10, котранскрибируются, после чего с каждой мРНК происходит трансляция о образованием белков, секретирующихся в окружающую среду в виде совместного комплекса (рис. 1) в соотношении 1:1с помощью не изученного пока механизма (Renshaw et al., 2002).
Эти белки стабилизируют друг друга, а при взаимодействии с клеточным рецептором хозяина комплекс распадается (Meher et al., 2006). В настоящее время комплексу белков отводится некая сигнальная роль, которая проявляется при взаимодействии его с рецептором на АПК, что в дальнейшем определяет функционирование иммунных клеток хозяина (Hsu et al., 2003). По литературным данным эти белки являются сильными Т и Вклеточными иммуногенами, обнаруживаемыми на ранней фазе инфекции. Тклеточные эпитопы ESAT6 узнаются как CD4*, так и CD8 Тлф (Mustafa, Shaban, 2006). Однако функции белков ESAT6 и CFP10 in vivo до сих пор плохо изучены.
Таким образом, одной из задач нашей работы стало получение рекомбинантного белка ESAT6.
Ген esxA, кодирующий белок ESAT6, клонировали в составе экспрсссирующей прокариотйческой плэзмиды pGEX2T в клетках Е. coli. Для этого ГЩРфрагмент длиной 368 и.п. был встроен в вектор pGEX2T по сайтам рестрикции ВатШEcoRl. Полученную конструкцию назвали pGEX2TVESAT6. Правильность встраивания клонированного фрагмента была подтверждена рестрикционным анализом и секвеиированием.
Рекомбинантиой плазмидой трансформировали компетентные клетки реципиентного штамма Е. coli BL21, рекомендуемого руководством по использованию вектора pGEX2T для получения белков, поскольку он обладает пониженной внутриклеточной протеазной активностью. Индукцию синтеза целевого белка проводили добавлением в среду ИГПТ, который в данной системе обеспечивает высокий уровень синтеза белка GST. При электрофоретическом анализе лизатов клеток Е. coli, трансформированных плазмидой pGEX2T/ESAT6, было выявлено наличие дополнительного белка с молекулярной массой около 30 кДа, что соответствует расчетной массе белка GSTESAT6 (рис. 2А). Уровень продукции этого белка по данным денситометрии составлял более 20 %. Очистка белка GSTESAT6 была проведена с использованием аффинной хроматографии на глутагионоефарозе согласно рекомендациям фирмы Pharmacia Biotech, а степень его очистки составила примерно 95 %.
Рис. 2. Синтез гибридных белков по данным электрофореза и иммуиоблотинга А электрофорез в 12 % ПААГ в денатурирующих условиях (0,1 % додецилсульфата натрия) клеточных лизатов и В иммуноблоттинг соответствующих лизатов с моноклональкыми антителами к GST:
1 лизат Е. coli, 2 лизат Е. co/i/pGEX2T, 3 лизат Е. co/;/pGEX2T/CFP10, 4 лизат Ј«>tofcaEX2T/ESAT6; С иммуноблоттинг лизата EcoMpGEX
2T7ESAT6 с различными сыворотками: 1 сыворотка здорового донора (1:100), 2 • сыворотка больного с лёгочным заболеванием нетуберкулезной этиологии (1:100), 3 сыворотка больного с активным туберкулезом (1:100).
" 2 i n *
• &b
1 1 1 4 t 2 S < I ! 1
* • С
7
Аналогичным способом нами был клонирован и получен другой специфичный белок GSTCFP10, который использовался в наших исследованиях в качестве белкасравнения (Татьков СИ. и др., 2006).
Антигенные свойства рекомбинантных белков оценивали с помощью иммуноблота. Иммуноблоттинг с моноклональными антителами 2НЗ19 против GST (любезно предоставленными Порываевой В. А. ЗАО "ВекторБест") (рис. 2В) подтверждает наличие в лизате клеток рекомбинантного белка GSTESAT6.
Для оценки иммунореактивности полученных рекомбинантных белков мы провели иммублоттинг о сыворотками от здоровых и больных ТБ людей (рис. 2С). Исследования проводили с сыворотками в различных разведениях, но наиболее специфичные результаты получили при использовании сывороток в разведении 1:100. Полученные данные иммуноблота позволяют заключить, что обработка мембраны с фракционированными белками Е tro/(/pGEX2T/ESAT6 сывороткой от больного ТБ в разведении 1:100 позволяет идентифицировать антиген ESAT6 (рис. 2С).
Таким образом, был получен продуцент гибридного белка GSTESAT6, который сохраняет иммунохимические (по результатам иммуноблоттинга) свойства природного антигена М. tuberculosis и может быть использован в дальнейших исследованиях в качестве диагностического агента для подтверждения наличия иммунитета к ТБ, а так же как компонент вакцин для создания иммунитета к ТБ.
Получив аффинноочищенный препарат рекомбинантного белка GSTESAT6, мы провели исследование его диагностического потенциала методом ИФА с использованием сывороток пациентов больных ТБ. В данной работе полученный и очищенный рекомбинантиый белок GSTESAT6 использовали в качестве антигена для иммобилизации на твердой подложке в иммуноферменшой системе, предназначенной для выявления видоспецифических антител класса IgG к М. tuberculosis в сыворотке крови человека методом непрямого ИФА. Были обследованы панели отрицательных сывороток (470 образцов), полученных от здоровых доноров, и положительных, выделенных от больных туберкулезом с клинически подтвержденным диагнозом (34 образца). Чувствительность ИФА при определении антител класса IgG для GSTESAT6 составила 60 % (рис. 3) с довольно высокой специфичностью (95%).
Рис. 3. Частота (в %) выявления антител класса IgG к GST и рскомбинантному белку GSTESAT6 М. tuberculosis в различных исследуемых группах: 1 здоровые доноры, 2 лица с активным ТБ.
l o C5TESAT6 О GST |
Основываясь на литературных данных оценки разработанных коммерческих тестсистем серодиагностики ТБ с использованием различных антигенов М. tuberculosis,
можно отметить, что чувствительность таких тестов варьирует от 10 до 90 %, а специфичность от 47 до 100 % (Amicosante et al., 1999; Banerjee et al., 2003; Steingart et al., 2007). Тем не менее, такой разброс показателей не отрицает возможности широкого
применения метода ИФА в будущем о условием повышения чувствительности, специфичности и снижения стоимости исследований данным методом
При обследовании контрольной группы здоровых доноров уровень IgGантител к гибридному белку был определен на низком уровне для большинства исследованных сывороток, однако в небольшом числе олучаев (4,6 % для GSTESAT6), сыворотки были определены как положительные (рис 3) Уровень выявления антител к GST не превышал 1,3 % среди воех обследуемых сывороток (рис 3)
Отдельно нами были проанализированы титры антител к гибридным антигенам в сыворотках лиц с такими заболеваниями как гепатит А, В и С, хламидиозная, пневмонийная и стафилококковая инфекции Было установлено, что сыворотки от доноров с указанными патологиями не имели статистичеоки значимьк отличий по уровню антител от сывороток здоровых_доноров Следовательно, возбудители данных заболеваний не реагируют перекрестно с гибридным антигеном GSTESAT6
Таким образом, полученные нами данные об иммунореактивности гибридного белка GSTESATб в серологических исследованиях позволяют сделать вывод о том, что данный белок можно использовать для диагностики активного ТБ Высокая специфичность гибридного рекомбинантного белка ESAT6 (95 %) при выявлении активного процесса на начальных стадиях заболевания ТБ позволяет использовать его в скрининговых исследованиях
В иммунном ответе при ТБ доминируют клеточные медиаторы иммунного ответа, в частности Тлф являются чувствительными к антигенам М tuberculosis Для оценки юс функционального состояния мы использовали ELISA/HOH7, сущность которого заключается в т vitro детекции ИФНу клеточных медиаторов иммунного ответа при стимуляции видоспецифическими антигенами (в нашем случае GSTESAT6) цельной крови с последующим измерением уровня ИФНу в плазме крови методом ИФА Высокий уровень ИФНу в цельной крови пациентов и здоровых доноров в ответ на стимуляцию Тклеточными митогенами (ФГА и КонА), свидетельствует об отсутствии иммуносупрессивного состояния Тклеточного звена иммунной системы обследуемых лиц Таким образом, в данном тесте секреция ИФНу связана с реактивностью Тклеток в ответ на специфический антиген (Arend et a l , 2000), так как уровень ИФНу в цельной крови у здоровых доноров существенно ниже Позитивные результаты ИФНу теста указывают на наличие активной туберкулезной инфекции (Sodhi et a l , 1997) При анализе данных чувствительность данного метода с использованием в качестве стимулирующего антигена GSTESAT6 на имеющейся выборке лиц с активным ТБ составила 72±П % при специфичности более 94 % При использовании же в качестве антигена PPD на той же выборке пациентов чувствительность метода составила 94±6 % при специфичности 33±11 % Низкая специфичность при использовании PPD объясняется тем, что PPD представляет ообой смесь белков, которые так же продуцируются и вакцинным штаммом BCG, который используется в нашей стране повсеместно Поэтому целесообразно в качестве антигена в данном тесте использовать ESATб, который отсутствует в вакцинных штаммах BCG, и таким образом позволяет проводить дифференцирование между BCGвакцинированными и инфицированными пациентами
2. Исследование иммуногенных свойств антигена ESATб
2.1. Клонирование последовательности ДНК, содержащей ген esxA
В настоящее время ведутся активные работы, посвященные исследованию антигена ESATб в качестве основного компонента субъединичных вакцин (Derrick et al , 2004, Marei et a l , 2005, Minion et al , 2003) Представлялось весьма интересным исследовать антигенные и иммуногенные свойства белка ESATб, синтезируемого в эукариотической клетке Одним из самых простых способов решения поставленной задачи является
9
использование технологии ДНКвакцин, которая позволяет осуществить экспрессию
целевого гена непосредственно в организме млекопитающих (Fynan et a l , 1993) Для изучения иммуногенных свойств антигена ESAT6 ген esxA был клонирован с
использованием нереплицирующегооя эукариотического вектора pcDNA3 lmychislacZ(), который является одним из наиболее широко используемых векторов, обеспечивающих высокую эффективность экспрессии целевых генов Первичная нуклеотидная последовательность клонируемого гена в составе рекомбинантной плазмиды была подтверждена секвенированием района встройки с использованием праймеров (F4 и R4) по методу Сенгера она полностью соответствовала опубликованной ранее в литературе (http //genolist pasteur fr/TuberouList/1 Полученная рекомбинантная плазмида названа pONE6 и использовалась в дальнейшем для получения ДНКконструкций
2 2. Оценка полисахаридного конъюгата в качестве системы доставки на примере МБЧ
Одной из главных проблем ДНКиммунизации является быстрая деградация плазмидной ДНК нуклеазами макроорганизма (Gurunathan et a l , 2000) Известно, что эффективность прямой инъекции плазмидной ДНК непосредственно в ткань очень низка (менее 1%) (Gurunathan et al , 2000) Судьба генетического материала, используемого при ДНКвакцинации, разнообразна Основная его масса сорбируется на поверхности клеточных стенок и разрушается нуклеазами макроорганизма, и лишь незначительная часть проникает в клеткимишени Поэтому для индукции иммунного ответа, способного проявлять протективные свойства, не только на мышиных моделях ТБ, но и у крупных животных необходимо использовать достаточно большие дозы ДНКвакцины и многократные иммунизации, что, конечно, является недостатком данного подхода (Barry et a l , 1999) Использование больших иммунизирующих доз может привести к индукции иммунного ответа по гуморальному типу (O'Hagan et al , 2001), а для обеспечения прогективного противотуберкулезного иммунитета ключевым является именно клеточное звено (Schaible, Kaufmann, 2000) Кроме увеличения иммунизирующей дозы существует еще один подход, который заключается в использовании адъювантов В качестве адьювантов часто применяются цитокины (Palendira et a l , 2002) Однако применение любых цитокинов должно быть крайне осторожным, так как они являются тонкими регуляторами иммунной системы и любой дисбалано, вызванный неправильно подобранными дозами иммунорегуляторов, может привести к нежелательным последствиям Наиболее оптимальным подходом является использование эффективных систем доставки, которые не только могут снизить иммунизирующую дозу, но и способствовать направленной (адресной) доставки нуклеотидного материала в клетки (Dupuis et a l , 2000) Таким образом, необходимо создание и исследование не только альтернативных BCG ДНКвакцин, но и усовершенствование способов их защиты от деградации с целью эффективной доставки в иммунизируемый организм Для выполнения поставленных задач данной работы нами была выбрана полисахаридная система доставки, на основе которой ранее нашими коллегами были получены многообещающие конструкции вирусоподобные частицы (ВПЧ) и искусственные микобактериальные частицы (МБЧ) ВПЧ показали свою эффективность при стимуляции как Тклеточного, так и гуморального иммунитета у мышей на рекомбинантные ДНКвакцины и субъединичные белковые вакцины (Karpenko et al , 2003) В экспериментах на мышах МБЧ показали свою иммуногенность для Т и Вклеточных звеньев иммунитета (Азаев, М Ш и др , 2004) Однако протективные свойства МБЧ до сих пор не были исоледованы Для оценки перспективности использования полисахаридного конъюгата в качестве системы доставки ДНКконструкций на следующем этапе работы было проведено исследование протективных свойств МБЧ
10
Искусственные микобактериальные частицы были получены Лебедевым Л Р по предложенной им с соавт методике (Lebedev et a l , 2002) МБЧ представляют собой молекулярные конструкции, в качестве "центрального ядра" которых использовали двуопиральную РНК дрожжей штамма Saccharomyces cerevistae М437 Y116 (доРНК), а на поверхности белкиантигены из вакцинного штамма BCG Известно, что синтетические и природные двуспиральные полирибонуклеотидные комплексы усиливают иммунный ответ при иммунизации, а используемая для получения МБЧ доРНК является основным компонентом лекарственного препарата "Ридостин", который разрешен к применению в медицинской практике в качестве стимулятора неспецифической резистентности (ВФС 42245794 Ридостин для инъекций) Белкиантигены из вакцинного штамма М bovis BCG были связаны с доРНК за счет ионного взаимодействия
При электронной микроскопии МБЧ имеют шарообразный вид с диаметром около 1025 нм Микрочастицы в полученном препарате сохраняют свою компактную структуру и способны противостоять дейотвию РНКаз При иммунизации мышей МБЧ способны вызывать повышенный синтез специфических антител и активировать клеточные факторы иммунного ответа (фагоцитарную активность и бласттрансформацию лф) (Азаев, М Ш и др , 2004) Однако эффективная иммуногеннооть не всегда коррелирует с протективными свойствами полученных конструкций Поэтому одной из задач данной работы стала оценка протективности МБЧ на животной модели ТБ
В работе для определения иммунопротективного эффекта МБЧ при туберкулезной инфекции использовали аутобредных морских свинок весом 250300 г (по 20 животных в каждой группе), что позволило в сравнительно короткие сроки получить достоверные результаты об иммунопротективных свойствах созданных конструкций Извеотно, что эти животные настолько чувствительны к микобактериям, что даже очень небольшое число жизнеспособных бацилл вызывает развитие прогрессирующего ТБ, выявляющегося при микроскопии через несколько недель после заражения (Dannenberg, Jr, 1989) Работа проводилась на базе ГНУ Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока с участием кветн А Н Донченко
Для однократной внутрикожной иммунизации использовали следующие препараты BCG, МБЧ и физиологический раотвор
Внутрибрюшинное заражение 3х групп животных проводили на 30 сут после иммунизации возбудителем бычьего туберкулеза М bovis, штамм 14х ВНИИБТЖ (103
микробных клеток в 0,5 мл физиологического раствора) В иммунопрофилактике ТБ основным компонентом иммунологической перестройки
является активация клеточных факторов специфической защиты, прежде всего Тлф и мф, а также их регуляторов, цитокинов (Визель А А и др , 1999) Фагоцитоз М bovis
лейкоцитами иммунизированных животных изучали на 35е сут после иммунизации Фагоцитарная активность определялась процентом фагоцитирующих клеток и количеством захваченных частиц на один фагоцит Из данных, представленных на рис 4, видно, что фагоцитарная активность лейкоцитарных клеток в группе животных, иммунизированных микобактериальными частицами достоверно выше, чем в группе животных, иммунизированных вакциной BCG и в контрольной группе Известно, что чем выше фагоцитарная активность, тем более подготовленной является иммунная система к встрече с патогенами, так как процессы разрушения микобактерий протекают более активно (Dannenberg, Jr , 1989, Flynn, 2004) Есть определенные основания полагать, что синтетичеокие частицы могут индуцировать усиление пролиферации CD8* клеток Вопервых, возможна преимущественная презентация их по типу апоптозных везикул Кауфмана, обусловленная размером частиц (1025 нм) Такие везикулы могут захватываться дендритными клетками и содержащиеся в них антигены угаеп презентироваться ГКГС I и CD1 системами, приводя к стимуляции CD8+ Тклеток и, рестриктированных по CD1, Тклеток (Kaufinann, 2001) Вовторых, в состав МБЧ входит дсРНК, которая также стимулирует пролиферацию CD8+ Тклеток (Karpenko et al , 2003)
11
Рис. 4. Фагоцитарная активность мононуклеарных клеток на 3Se сутки после вакцинации препаратами
(р<0,05): 1. BCG; 2. МЕЧ; 3. Физиологический раствор.
1 2 3
Группы животных
Анализируя результаты сравнительного изучения протсктивных свойств испытуемых препаратов (табл. 1) было показано, что протективная способность вакцины М. bovis BCG, выраженная процентом снижения риска инфекции в результате вакцинации, составляет 30 %, а для МБЧ она составила 50 %. При макроскопическом исследовании павших после заражения М. bovis животных отмечались поражения бронхиальных, брыжеечных, предлопаточных лимфатических узлов. Наиболее высокая частота патологических изменений отмечалась в легких и в печени. При оценке резистентности при внутрибрюшинном заражении М. bovis установлено, что иммунизация животных МБЧ приводит к достоверному увеличению (р<0,05) СГОК особей, погибших до окончания экперимента. Гибель животных (из контрольной (+) группы) наступала на 71±7 сутки (табл 1). Причинами смерти животных во время проведения эксперимента были, по данным вскрытия, прогрессирование лёгочной патологии и дыхательная недостаточность. В контрольной () группе интактных морских свинок в течение всего срока наблюдения (200 сут) погибших или заболевших животных не было.
Таблица 1
Чувствительность .морских свинок, иммунизированных различными препаратами, к
внутрибрюшинному заражению М. bovis
Вид препарата
1.BCG
2. МБЧ
З.Физиологический раствор
Количество животных в
группе
20
20
10
СПЖ животных,
сут
94±13
135+5
71±7
Количество животных с
туберкулезными изменениями
14
10
10
Протективная способность,
%
30
50
0
Из представленных данных видно, что иммунизация МБЧ экспериментальных животных способствует формированию противотуберкулезного иммунитета. Немалый вклад в его формирование вносит усиление фагоцитарной активности полиморфноядерных клеток крови у иммунизированных животных, а также влияние дсРНК на макрофаги и NKклетки (неспецифические клеткикиллеры), приводящее к индукции синтеза ИФНу. Таким образом, было показано, что МБЧ не только обладают иммуногенностыо, но и протективностью на животной модели ТБ, а, следовательно,
12
являются перспективной моделью для исследования иммуногенных свойств различных высокоспецифичных антигенов, и в частности антигена ESAT6
2.3. Получение препарата «KpONE6» на основе рекомбинантной плазмиды,
кодирующей антиген ESAT6, и полисахаридной системы доставки
Для получения экспериментального препарата «KpONE6» мы использовали плазмиду рСЯМЕб и модифицированный полисахаридный конъюгат, аналог которого (в ВПЧ и МБЧ) продемонстрировал свою способность защищать нуклеотидный материал от нуклеазной деградации, а также способность индуцировать эффективный иммунный ответ против инфекционного агента (Lebedev et al , 2002, Азаев М Ш и др , 2004)
Конъюгат из модифицированного полиальдегиддекстрана (МП) со спермидином получали из веществ, которые применяются в медицинской практике Так, например, хорошо зарекомендовали себя различные фракции, полученные при гидролитическом расщеплении декстрана в качестве плазмозамещающих препаратов, такие как полиглюкин (60±10 кДа) Способность к биодеградации позволяет применять его в качестве носителя белков и лекарственных веществ (Tsuchiya et al , 1952) Модификация полиглюкина периодатом натрия позволяет вводить в его полимерные молекулы альдегидные группы, весьма активные в функциональном отношении Реакция протекает случайным образом с расщеплением глюкозного звена, содержащего свободные вицинальные гидроксильные группы
Для экспрессконтроля процесса активации декстрана (образования альдегидных групп) мы использовали в качестве хромофора бромистый этидий (EtBr) Известно, что полисахариды не поглощают свет в ультрафиолетовой и видимой областях спектра (Cortesi et a l , 1999), но в окисленном состоянии при наличии альдегидных групп в полимерной молекуле опособны связываться о EtBr, образуя ковалентную овязь между альдегидной и аминогруппой Несвязавшийся хромофор удаляли экстракцией изоамиловым спиртом и измеряли интенсивность флуоресценции водного раствора полиглюкина при длине волны 540 нм Контроль за наличием альдегидных групп в очищенном растворе полиглюкина и в ходе сборки конъюгата (промежуточного и конечного) осуществляли в смеси по относительному изменению интенсивности флуоресценции (по уменьшению) Использование метода флуоресценции позволяет оценить только относительное увеличение концентрации альдегидных групп по возрастающей интенсивности флуоресценции в ходе протекания реакции и уменьшение концентрации альдегидных групп по уменьшению интенсивности флуоресценции, наблюдаемой в ходе сборки конъюгата При проведении экспериментов нами было установлено, что, несмотря на высокую реакционную способность альдегидных групп, полученные активированные препараты можно длительно сохранять в неизменном виде в водном растворе (в течение нескольких месяцев) без потери активности или в течение 3х лет в лиофилизированном состоянии В нашем работе концентрация получаемых активированных препаратов МП в пересчете на альдегидную группу составляла 0,2 М
Предлагаемая методика активации полиглюкина позволяет получать активированный полиглюкин в препаративных количествах, достаточных для сборки конъюгатов в разных условиях (соотношение компонентов конъюгата, рН, использование различных буферов для сборки и т п)
Весьма важным моментом, на наш взгляд, является порядок сборки такого рода конъюгатов, которая должна осуществляться последовательно Первый этап сборки заключается в образовании ковалентной связи между конъюгатом МП и спермидином Второй этап получение конечного конъюгата МПспермидинДНК pONE6, основанный на электростатическом взаимодействии положительно заряженных
13
аминогрупп спермидина (вторая свободная аминогруппа) в слабокислой среде с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК (Braunlm et a l , 1982)
Спермидин относится к природным полиаминам, а его комплекс с ДНК обладает повышенной устойчивостью к действию нуклеаз (Dunlap et al , 1997) Прочность конъюгата, если принимать во внимание результаты, полученные ранее в работе (Raspaud et al, 1998), в значительной степени зависит от концентрации добавленного к ДНК спермидина, а также наличия моновалентных катионов Не менее важной составляющей процесса конденсации (осаждения из раствора) является первоначальная концентрация ДНК (Pelta et al , 1996) Таким образом, прежде чем образовать конечный конъюгат, необходимо обратить внимание на степень модификации полиглюкина чем она выше, тем выше вероятность образования устойчивого конечного конъюгата благодаря созданию в составе первичного конъюгата — МПспермидин — высокой концентрации спермидина
Степень связывания (т|) альдегидных групп со спермидином в первичном конъюгате (после осуществления 1го этапа сборки) оценивали по отношению разности интенсивностей флуоресценции (ИФ) конъюгата полиглюкина с бромистым этидием (МПEtBr) до присоединения спермидина и после его присоединения (МПспермидинEtBr) к исходной интенсивности флуоресценции по формуле
т] (%) = [ИФСМПEtBr) ИФ(МПспермидинЕШг)] х 100 % / ИФСМПEtBr) В нашем эксперименте она составила 90 % Концентрацию ДНК по окончании сборки в конечном конъюгате оценивали
спектрофогомегрически измеряли оптическую плотность раствора при 260 им Отношение плазмидной ДНК к МП в конечном препарате составило 0,6 мг плазмиды на 1 мгМП
Таким образом, нами были получены экспериментальный препарат «KpONE6», представляющий собой рекомбинантную ДНК pONE6 с полиглюкинспермидиновым конъюгатом, и контрольный препарат «KpcDNA», представляющий собой нативную плазмидную ДНК pcDNA с полиглюкинспермидиновым конъюгатом
Для проверки полноты упаковки нуклеотидного материала в собранной конструкции проводили ее обработку ДНКазой Было показано, что исходная плазмидная ДНК pcDNA3/lmychislacZ(), взятая в качестве контроля в той же концентрации, что и при использовании препаратаконъюгата, полностью деградировала уже через 30 мин инкубации при 37 С, а в собранной конструкции нуклеотидный материал сохранялся в течение 9 ч при тех же условиях нуклеазной обработки На основании полученных результатов в этом эксперименте от vitro мы предположили, что полисахаридная оболочка позволит защитить генетический материал от деградации и в живом организме
2 4 Изучение иммуногенных свойств экспериментального препарата «KpONEfi» и
безопасности его применения на животной модели
На данном этапе исследования животные модели необходимы для изучения иммунного ответа т vivo, а также для оценки эффективности и безопасности разрабатываемых экспериментальных препаратов Нами была выбрана мышиная модель, которая является относительно экономичной и удобной, т к отвечает требованию схожести ключевых иммунных реакций на инфекцию с таковыми у человека Известно, что и у человека, и у мышей защита от ТБ опосредована действием CD4+ и CD8+ Тклеток, раньше всего развиваются реакции типа ТЫ, опосредующие протективный иммунитет путём высвобождения ИФНу и других цитокинов Лишь в последующем разворачиваются протективные реакции ТЪ2типа, сопровождающиеся привлечением Th и продукцией AT, вызванных накоплением антигенов уже погибших микобактерий (HemandezPando et al , 1997)
14
Исследование иммуногенных свойств препарата «KpONE6» проводили после трехкратной внутримышечной иммунизации мышей линии BALB/c В качестве контроля использовали 2 группы животных одну группу иммунизировали контрольным препаратом «KpoDNA», вторую физиологическим раствором Оценку показателей иммунитета проводили на 7,14, 21, 28,35 и 45 сутки после иммунизации
При исследовании экспериментальных препаратов на животных моделях важно не только оценить их иммуногенность, но и проверить безопасность их применения для живого организма, так как безопасность придает смысл дальнейшим исследованиям препаратов, предназначенных для применения в живых системах Важным показателем безопасности препаратов является отсутствие «острой» токсичности при иммунизации ими лабораторных животных Поэтому на следующем этапе нашей работы мы уделили внимание оценке этого показателя Для этого после иммунизации мышей различными препаратами в течение 10 оуток проводили ежедневную регистрацию гибели животных, веса, наличия или отсутствия возможных клинических симптомов интоксикации (снижение веса, подвижность животных, внешний вид), повреждений в месте инъекции
Результаты исследования показали, что испытуемая генетическая конструкция в выбранной форме, дозе и способе применения не вызывает снижения веса и какихлибо симптомов раостройства здоровья у используемых животных и не обладает «острой» токсичностью Также не было найдено достоверных отличий между опытной и контрольными группами
При изучении безопасности препаратов проводилась также оценка гематологических показателей лабораторных животных (лейкоцитарная формула, количество эритроцитов, ретикулоцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) до иммунизации, через 24 ч и на 7 сутки после каждого введения исследуемого препарата по общепринятой методике клинического анализа крови (Козловская Л В , Николаев АЮ, 1984) Исследование крови является важным этапом в оценке безопасности изучаемого препарата, так как кроветворные органы чрезвычайно чувствительны к различным физиологическим и особенно патологическим воздействиям на организм Полученные данные свидетельствуют об отсутствии достоверно значимых различий показателей периферической крови иммунизированных групп лабораторных животных Экспериментальный препарат «КрОЫЕб» не оказывал оущеотвенного влияния на гематологические показатели (табл 2)
Анализируя данные, представленные в табл 2, можно отметить, что иммунизация животных препаратами «KpONE6», «KpoDNA», а также физиологическим раствором не приводила к существенным изменениям лейкоцитарной формулы крови, а варьирование данных показателей находилось в пределах физиологической нормы
15
Гематологические показатели крови мышей в разные сроки после иммунизац
Срок,
суг
Гемоглобин,
г/л
Эритроциты,
10,2/л
Ретикуло
циты,%
Тромбоциты,
Ю'/л
Лейкоциты,
Ю'/л
Нейтрофилы
п/я,107л
Нейтрофилы
с/я,Ю'/л
«KpONE6»
1
7
15
21
29
35
156,6±6,35
154,4*3,78
159,2*6,83
162,2*6,94
157,6*7,8
160,8±4,44
8,964±0,27
8,98*0,16
8,774±0,18
8,934*0,28
9,054±0,23
8,696*0,24
5,18*2,34
5,18*2,28
5,18*1,33
6,14*2,49
4,16*1,36
6,86*1,82
569,96*23,44
584,46*20,47
607,34±35,71
593,18±32,05
587,9*11,20
603,72*34,39
14,08*0,55
13,86±0,55
13,82±0,41
14,24*0,51
13,6±0,29
13,86*0,33
0,16*0,05
0,16*0,05
0,12*0,04
0,2*0,04
0,18*0,04
0,18*0,04
4,12*0,28
3,94*0,38
3,86*0,24
4,02*0,26
3,78*0,15
3,92*0,16
«KpcDNA»
1
7
15
21
29
35
159,4±7,09
156,2±6,38
162±6,24
157,4*7,57
159,8*6,06
162,4*5,9
9,104*0,34
9,098*0,32
8,86*0,36
9,132±0,39
9,06±0,29
8,934±0,28
6,26±2,63
7,54*1,52
6,48*3,04
6,58*2,55
6,36±1,9
4,42±2,48
593,22*34,63
617,08*28,13
618,14±7,63
590,2±32,41
579,06*27,57
620,98±25,85
14,14*0,21
13,76±,32
14,24*0,44
13,72*0,16
13,94*0,48
13,92±,56
0,18*0,04
0,16*0,05
0,14*0,05
0,14*0,05
0,16*0,05
0,2*0,03
4,1*0,22
3,86*0,21
4,14*0,15
3,92*0,34
4,04*0,33
3,88*0,31
Физиологический раствор
1
7
15
153,8±5,76
160,4*4,93
159*4,74
9,13±0,32
8,854±0,05
8,904±0,45
4,92*2,27
5,52±2,71
6,6*2,67
596,98*27,7
601,26±23,92
615,72±31,8
14,08*0,54
13,8*0,58
13,68*0,37
0,16*0,05
0,18*0,04
0,18*0,04
4,2*0,29
3,86*0,36
3,9*0,34
Примечание п/я палочкоядерные, с/я сегментоядерные
Одним из важных моментов изучения иммуногенности экспериментальных препаратов является оценка содержания ключевых медиаторов иммуногенеза
Анализ продукции ИФНу у животных, иммунизированных экспериментальным препаратом «КрОЫЕб», свидетельствует о том, что его концентрация возрастала на 14 и 35 сут (рис 5) При этом на 21 сут его концентрация снижалась и начинала нарастать концентрация ИЛ10 и достигала своего максимума на 28 сут (рис 5)
60
50 S"
40 Я S 1
30 is 20 I
а
10 | о
—О—«KpONE6» A «KpoDNA» — О — Контроль
—•— Контроль » «KpONE6» Ar <«.poDNA»
Рис. 5 Динамика продукции ИФНу (сплошная линия) и ИЛ10 (прерывистая линия) при иммунизации мышей препаратом «KpONE6» квадратный маркер, препаратом «KpcDNA» треугольный маркер, физиологическим раствором (контроль) круглый маркер
Известно, что выбор типа хелперов происходит на ранней стадии формирования иммунного ответа и часто является селективным То есть, при формировании ТЫ происходит подавление предшественников Th2, и наоборот В регуляции важную роль играют определенные цитокины В процессе развития иммунных реакций на специфические антигены ТЫ и ТЬ2клетки проявляют признаки перекрестной регуляции, способствующей доминированию одной из этих субпопуляций Продукция ИФНу ТЫклетками ингибирует пролиферацию ТЬ2клеток В свою очередь вырабатываемый Th2клетками ИЛ10 угнетает функцию Thlклеток, а ИЛ4 подавляет размножение ТЫклеток (Maggi et a l , 1992)
На экспериментальных моделях также показано, что протективный ответ при туберкулезе ассоциирован с активацией ТЫ (Sugawara et a l , 2004), (Cliff et al , 2004) ИЛ10 регулирует переключение от ТЫиммунного ответа к Тп2 и тем самым благоприятствует Вклеточной активации С подъемом концентрации ИЛ10 на 28 сутки можно связать состояние иммунодепрессии у иммунизированных животных, которое выражалось в снижении концентрации ИФНу и снижении пролиферативной активности спленоцитов в РБТЛ на 28 сутки (рис б) Активация ТЫ фенотипа лф и возможное влияние на баланс Thl/Th2 клеток в сторону уменьшения активности последних позволяет объяснить полученные результаты повышения уровня цитокина ИФНу Повторное увеличение концентрации ИФНу на 35 сутки восстанавливает баланс между ТЫ и Th2, подавляет продукцию ИЛ10 и тем оамым способствует выходу из состояния иммунодепрессии
При оценке специфической активности экспериментального препарата в отношении показателей иммунной системы необходимо исследовать ее действие не только на уровень секретируемых иммунокомпетентными клетками растворимых медиаторов
17
800
J, 700 И :§ . боо
Э | 500
| « 400
Ј I зоо | Ј 200
М 100
0
О
•
А А
а *>.' мЙ ""№——^о i * * — i • 1 • — i * 1 *
14 21 28 35
Сутки после 1й иммунизации
секретируемых иммунокомпетентными клетками растворимых медиаторов иммуногенеза, но и исследовать следствия изменения продукции цитокинов, то есть изучать клеточный и гуморальный ответ.
Гуморальный иммунный ответ оценивали по обнаружению специфических AT в сыворотке иммунизированных животных в реакции непрямого иммуноферментного анализа путём сравнения значений оптической плотности, полученной при анализе сывороток животных экспериментальной и контрольной групп. Иммунизация животных экспериментальным препаратом «KpONE6» не приводила к выработке специфических AT у иммунизированных животных в концентрациях, детектируемых методом ИФА. Сыворотка животных контрольных групп так же не реагировала с антигеном GSTESAT6 на протяжении всего эксперимента. Известно, что ДНКиммунизация стимулирует в основном клеточное звено иммунного ответа, а гуморальный иммунный ответ активируется опосредованно за счет действия медиаторов со стороны активированных Th и цитотоксических лф (Donnelly el al., 2005). По этой причине при ДНКвакцинации обычно не удается достичь высокого уровня гуморального иммунного ответа. Очевидно, что вызванная иммунизацией активация Thlлф приводит к подавлению активности Тп2клеток и, соответственно, угнетению продукции AT (Nicholson, Kuchroo, 1997).
Качественную оценку клеточного иммунитета проводили с использованием реакции бластгрансформации лимфоцитов по индексу стимуляции (ИС), который характеризует отношение пролиферации спленоцитов, индуцированных специфическими антигенами к спонтанной пролиферации спленоцитов. В качестве специфического антигена выступал рекомбинантный белок GSTESAT6, а в качестве неспецифического контроля GSTCFP10. Было показано, что иммунизация препаратом «KpONE6», вызывает достоверное увеличение ИС на 14 и 35 сут после иммунизации (рис. 6). При этом не наблюдалась пролиферация спленоцитов иммунизированных животных при использовании для стимуляции in vitro гетерологичного антигена GSTCFP10: ИС на протяжении всего эксперимента варьировал в пределах от 0,98±0,04 до 1,09±О,О8 (данные не представлены). В контрольных группах мышей, иммунизированных контрольным препаратом «KpcDNA» или физиологическим раствором, не отмечается выраженной пролиферативной активности в ответ на стимуляцию специфическими антигенами. Таким образом, результаты исследования, представленные на рис. 6, свидетельствуют о том, что иммунизация мышей препаратом «KpONE6» вызывала формирование клона клеток памяти, реагирующих выраженной пролиферацией при стимуляции in vitro
специфическим антигеном GSTESAT6.
2,5
Рис. 6. Динамика пролиферативной активности (ИС) спленоцитов животных, иммунизированных «KpONE6» (тёмные столбики), «KpcDNA» (столбики со штриховкой), физ. раствором (светлые столбики) при стимуляции рекомбинантным белком GSTESAT6.
1,5
ИС
0,5 •
14 21 28 35
Сутки после 1й иммунизации
"KpONE6" • "KpcDNA" О ««.раствор
18
(ФГА, КонА, ЛПС липополисахарид) Следует отметить, что спленоциты иммунизированных животных отвечали повышенной пролиферацией при использовании Тклеточных митогенов (КонА и ФГА) на всем сроке наблюдения Это достоверная характеристика того, что иммунизация не вызывала супрессивного действия на организм животных При использовании Вклеточного митогена (ЛПС) ИС не показал высоких значений ни в одной из исоледуемых групп животных, что можно объяснить его некоторым общим супрессивным действием на клетки Иммунизация достоверно не изменяла пролиферативный ответ Т и Влимфоцитов селезенки на митогенные стимулы ФГА, КонА и ЛПС
Важным показателем индукции Тклеточного иммунного ответа является формирование клона специфических лимфоцитов, образующихся в ответ на введение иммуногена и отвечающих продукцией цитокинов Поэтому следующим этапом нашей работы было исследование способности препарата «KpONE6» индуцировать клеточный цитотоксический ответ, который оценивали по выявлению ИФНупродуцирующих лимфоцитов в реакции ELISPOT Мы остановили свой выбор на обнаружении ИФНупродуцирующих клеток, поскольку данный цитокин образуется в ооновном в цитотокоических лимфоцитах и является важным медиатором противотуберкулезного иммунитета (Shata et a l , 2002) Полученные данные анализа ELISPOT (табл 3) показывают увеличение числа клеток, продуцирующих ИФНу в ответ иа стимуляцию GSTESAT6 на 14 и 28 сут, что свидетельствует о формировании специфического клеточного иммунитета Ранее уже было показано, что антиген ESAT6 является сильным Тклеточным иммуногеном, индуцирующим синтез ИФНу (Skjot et al , 2000)
При использовании в качестве неспецифического стимулятора ФГА количество ИФНупродуцирующих клеток составляло порядка 400600 клеток/105опленоцитов Специфичность данных анализа РБТЛ и ELISPOT подтверждена отсутствием выраженной пролиферации при стимуляции гетерогенным иммуногеном (GSTCFP10)
Таблица 3 Количество ИФНупродуцирующих спленоцитов у животных, иммунизированных различными препаратами, после стимуляции т vitro рекомбинантным антигеном
GSTESAT6 в ELISPOT
Вид препарата
«KpONE6»
«KpcDNA»
Количество ИФНу секретирующих антигенспецифичных клеток в пробе в разные
точки ы
14е сутки
86,3 ±7,4
15,6 ±3,5
28е сутки
313,3 ±26,7
225 ±20,1
Среднее значение пятен (слотов) на 10 спленоцитов из Зх лунок
В таблице предотавлены средние значения количества ИФНупродуцирующих клеток ± стандартное
отклонение(М+ш)
Таким образом, на основании изложенных результатов можно сделать вывод, что полученный экспериментальный препарат «KpONE6», содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую микобактериальный антиген ESAT6 и окруженную полисахаридной оболочкой, в результате трехкратной внутримышечной иммунизации индуцирует специфический клеточный иммунный ответ у мышей, а значит, способен обеспечить защиту ДНК от воздействия дезоксирибонуклеаз не только т vitro, но и т
VIVO
19
Заключение Нарастание угрозы ТБ на фоне недостаточной эффективности вакцины BCG и
несовершенной диагностики этого заболевания приводит к очевидной необходимости более глубокого и внимательного изучения микобактерий Треть населения нашей планеты инфицирована микобактериями ТБ и подвержена опасности развития этого заболевания
Применение специфических микобактериальных антигенов позволяет создать и разработать более эффективные противотуберкулезные вакцины и эффективные высокоспецифичные методы диагностики ТБ Одним из наиболее перспективных агентов является антиген ESAT6, кодируемый делетированной из вакцинных штаммов BCG, но присутствующей в патогенных микобактериальных штаммах генной областью RD1
В результате проделанной работы было проведено конструирование рекомбинантной плазмиды, несущей микобактериальный антиген ESAT6, и клонирование ее в штамм Е coll С помощью ИФА, используя панели сывороток здоровых и больных ТБ лиц, были изучены антигенные свойства полученного рекомбинантного белка Показано, что данный рекомбинантный антиген способен выявлять ТБспецифичные IgG в сыворотках пациентов, о уровнем чувствительности 60 % и уровнем специфичности 95 % Было так же показано, что рекомбинантный антиген GSTESATб пригоден для дифференциальной диагностики инфицирования ТБ от поствакцинального иммунитета с использованием проб цельной крови в ELISA/ИФНу анализе
Кроме того, антиген ESAT6 был встроен в эукариотическую экспрессионную плазмиду и клонирован в клетках Е coh Полученная рекомбинангная плазмида легла в основу экспериментального препарата «KpONE6» кандидатной ДНКвакцины с использованием полисахаридной системы доставки В данной работе была проведена предварительная оценка перспективности применения полисахаридной системы доставки экспериментальных препаратов на примере микобактериальных частиц при иммунизации ими морских свинок Оказалось, что система МБЧ способствует формированию эффективного протективного иммунного ответа у животных против ТБ В дальнейшем была проведена оценка иммуногенных свойств экспериментального препарата «KpONE6» при иммунизации мышей, и было показано, что антиген ESAT6 индуцирует специфичный Тклеточный иммунный ответ, а используемая полисахаридная система доставки не обладет токсичностью и защищает нуклеотидный материал от нуклеазной деградации
Таким образом, антиген ESAT6 является перспективным кандидатом в вакцинопрофилактике ТБ, а рекомбинантный белок GSTESAT6 может применяться для дифференциальной диагностики ТБ
20
Выводы
1 Сконструирована плазмида pGEX2T/ESAT6, обеспечивающая синтез
рекомбинантного белка GSTESATб в клетках Е coli, способного выявлять
туберкулезоспецифичные IgG в сыворотках пациентов с уровнем чувствительности 60 % и
уровнем специфичности 95 % в ИФА
2 Показана возможность использования рекомбинантного белка GSTESATб для
дифференциальной диагностики активного туберкулеза и поотвакцинального иммунитета с
помощью ELISA/ИФНу анализа Чувствительность данного метода с использованием в
качестве стимулирующего антигена GSTESATб составила 72±11 % при специфичности
более 94 % При использовании же в качестве антигена PPD чувствительность метода
составила 94±6 % при специфичности 33±11 %
3 Показано, что искусственные микобактериальные частицы на основе
полисахаридного конъюгата и экспонирующие на своей поверхности суммарные белки М
bovis BCG, обладают иммуногенностью и протективными свойствами на
экспериментальной модели животных Протективная способность МБЧ составляет 50 %, а
для вакцины Ы bovis BCG 30 % Иммунизация животных МБЧ приводит к достоверному
увеличению (р<0,05) СПЖ особей до 135+5 суток по сравнению с контрольной группой
(71+7 суток)
4 Создан экспериментальный препарат «KpONE6», содержащий в центральной части
плазмидную ДНК pONE6, кодирующую антиген ESAT6, и окруженный полисахаридной
оболочкой из молекул модифицированного полиглюкина и спермидина, способной
защищать нуклеотидный материал от деградации под действием нуклеаз
5 Показано, что трехкратная внутримышечная иммунизация с интервалом 14 суток
препаратом «KpONE6» в дозе 12 мкг на животное приводит к формированию
специфического клеточного иммунитета у мышей линии BALB/o При этом
экспериментальный препарат «КрОЫЕб» не оказывает значимого влияния на
гематологические показатели иммунизированных животных и не обладает «острой»
токсичностью
21
Основные результаты опубликованы в следующих работах 1 Татьков С И , Туманов Ю В , Носарева О В , Болдырев А Н , Смирнова О Ю ,
Лебедев Д Р , Порываева В А , ИвлевДунтау А П , Ткаченко С Б , Стрелис А К , Новицкий В В , Уразова О И , Воронкова О В Применение рекомбинантных видоопецифических белков микобактерий туберкулеза для серологической диагностики инфекции // Эпидемиология и вакцинопрофилактика 2006 №4 (29) С 4247
2 Татьков С И , Носарева О В , Болдырев А, Н , Смирнова О Ю , Туманов Ю В , Лебедев Л.Р, Порываева В А , ИвлевДунтау А П , Аутеншлюс А И , Ткаченко С Б, Стрелис А К , Новицкий В В , Уразова О И , Воронкова О В Применение рекомбинантных видоспецифических белков М tuberculosis для серологичеокой диагностики туберкулёза // Клиническая и лабораторная диагностика 2006 №12 С 2334
3 Туманов Ю В , Смирнова О Ю , Болдырев А Н , Носарева О В , Варакоин Н А , Татьков С И Рекомбинантные белки М tuberculosis в диагностике туберкулеза легких // Мед иммунология 2006 № 23 С 294295
4 Азаев М Ш , Лебедев Л Р , Кузьмичева Г А , Туманов Ю В , Донченко Н А , Татьков С И , Носарева О.В , Ильичев А А Исследование роли искусственных микобактериальных частиц в реализации иммунологических процессов при экспериментальном туберкулезе животных // Проблемы туберкулеза и болезней легких 2007 №2 С 3848
Тезисы конференций: 1 Носарева О В , Смирнова О Ю , Болдырев А Н , Туманов Ю В , Татьков С И
Использование рекомбинантных белков в диагностике ТБ // Сборник трудов Международного симпозиума «Интегративная Медицина в XXI веке», Судак, Украина 2004 С 23
2 Nosareva О., Smimova О , Boldyrev A , Tumanov Yu Azaev M , Lebedev L , Tatkov S Construction of artificial viruslike particles exposing Mycobacterial ESAT6, and the study of their immunogenic properties // Abstract book Keystone Symposia "Tuberculosis Integrating Host and Pathogen Biology" Whistler, British Columbia, Canada 2005 P 94
3 Носарева О В Конструирование микрочастиц, содержащих рекомбинантный антиген ESATб для получения экспериментальной вакцины против туберкулеза Науки о человеке материалы VI конгресса молодых ученых и специалистов // Под ред Л М Огородовой, Л В Капилевича Томск СибГМУ 2005 С 25
4 Nosareva О , Nesterov А , Ignatyev G , Smirnova О , Boldyrev A , Tumanov Yu , Tatkov S Investigation of the Virus Like Particles as the delivery system for presenting DNAvaccme against ТВ to immune system" // International Congress "New Approaches to Vaccine Development From the bench to the field", Berlin, Germany 2005
5 Носарева О В , Нестеров А Е , Смирнова О Ю , Болдырев А Н , Туманов Ю В , Татьков С И Конструирование частиц на основе ПАД н исследование их свойств в качестве системы доотавки ДНКвакцин против туберкулёза // Международная школаконференция «Системная биология и биоинженерия» Москва 2005 С 198
6 Туманов Ю В , Смирнова О Ю , Болдырев А Н , Носарева О В , Татьков С И , ИвлевДунтау А П Рекомбинантные белки М tuberculosis в диагностике ТБ легких // «Новые технологии в интегративной медицине и биологии», «Стресс и экстремальные соотояния» Международный Междисциплинарный семинар, БангкокПатайя, Таиланд Труды Семинара и Научного Дискуссионного Клуба/Под ред И В Тимофеева, Н Г ПерминовойНовосибирск, Типография НИИ Катализа СО РАН 2006 С 7475
7 Азаев М Ш , Королев С А , Лебедев Л Р , Кузьмичева Г А , Туманов Ю В , Носарева О В , Татьков С И Микобактериальные частицы как новое средство иммунопрофилактики туберкулезной инфекции // «Новые технологии в интегративной медицине и биологии», БангкокПатайя, Таиланд Труды Семинара и Научного Дискуссионного Клуба/Под ред И В Тимофеева, Н Г Перминовой Новосибирск, Типография НИИ Катализа СО РАН 2006 С 67
8 О Nosareva, A Nesterov, A Boldyrev, О Smirnova, Yu Tumanov, S Tatkov Immunological studies DNAvaccme enooded ESAT6 antigen The Second International Conference on ТВ Vaccines for the World, The Austrian Industrial Association, Vienna, Austna,1921 April 2006
22
9 Носарева О В , Нестеров А Е , Болдырев А Н , Смирнова О Ю , Туманов Ю В , Татьков С И. Исследование экспериментального препарата на основе микобактериального антигена ESAT6 Международная школаконференция молодых ученых «Биотехнология будущего» в рамках Международного Симпозиума «ЕС—Россия перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7ой Рамочной программе» СанктПетербург 2006 С 72
10 Носарева О В, Нестеров А Е , Татьков С И Конструирование экспериментального препарата на основе полиальдегиддекстрана и исследование его свойств в качестве системы доставки ДНКвакцины против туберкулеза Проблемы фундаментальной и прикладной медицины Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых в рамках 13 Международного конгресса по приполярной медицине, Новосибирск ООО «РИЦ» 2006 С 39
11 Болдырев А Н , Носарева О В , Смирнова О Ю , Туманов Ю В , Татьков С И Применение рекомбинангных видоспецифических белков М tuberculosis для серологической диагностики ТБ Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера Ш Российская научная конференция с международным участием, Новосибирск ЦЭРИС 2006 С 134
12 Туманов Ю В , Болдырев А Н , Смирнова О Ю , Лебедев Л Р , Азаев МIII , Носарева О В , ИвлевДунтау А П , Татьков С И Выявление маркеров Тклеточного иммунитета в видоспецифической диагностике туберкулеза Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера Ш Российская научная конференция с международным участием Новосибирск ЦЭРИС 2006 С 166
13 Nosareva О., Nesterov A , Boldyrev A , Smimova О , Tumanov Yu, Tatkov S Immunological responses after immunization of mice with DNA plasmid encoded ESAT6 antigen with polysaccharide matrix // Abstract book 16th ERS Annual Congress, Munich, Germany 2006 P 342
14 Nosareva О , Nesterov A , Ignatyev G , Smimova О , Boldyrev A , Tumanov Yu, Tatkov S The Mycobacterium antigen ESAT6 as the DNAvaccme and diagnostic targets // First Summer School on Infectious diseases — affecting civil societies", Berlm, Germany 2006
15 Nosareva О , Nesterov A , Ignatyev G , Smimova О , Boldyrev A , Tumanov Yu, Tatkov S Immunological studies DNAvaccine encoded antigen ESAT6 // Strengthening Human Resources for better lung health 37th Union World Conference on Lung Health Pans, France, 31 October 4 November 2006
16 Nosareva О , Nesterov A , Boldyrev A , Smimova О , Tumanov Yu, Tatkov S The Mycobacterium antigen ESAT6 as the DNAvaccme and diagnostic targets // 3rd Vienna Vaccmes Conference, «Challenges for Vaccme Development Medical Need and Social Implications», Baden near Vienna2007P 72
17 Туманов Ю В , Болдырев А Н , Носарева О В , Смирнова О Ю , Татьков С И Использование рекомбинантных микобактериальных антигенов в диагностике ТБ легких//ТБ, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении Тезисы ПРоссийскоГерманской конференции Форума КохаМечниковаДомск.2007С 34
18 Туманов Ю В , Болдырев А Н , Смирнова О Ю , Лебедев Л Р , Азаев М Ш , Носарева О В , ИвлевДунтау А П , Татьков С И Видоспецифическая диагностика ТБ по маркерам Тклегочного иммунитета//ТБ, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении Тезисы П РоссийскоГерманской конференции Форума КохаМечникова, Томск.2007 С 36
19 Носарева О В , Нестеров А Е , Смирнова О Ю , Болдырев А Н , Татьков СИ, Изучение иммунного ответа на противотуберкулезную ДНКвакцину, модифицированную полисахаридом.//ТБ, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении Тезисы ПРоссийскоГерманской конференции Форума КохаМечникова, Томск. 2007 С 76
ФГУНГНЦВБ "ВЕКТОР" 3 ^ 3 т 1 0 ° 2 0 0 7 г