کشت بافت گیاهی پیشرفته...Plant Propagation- Chapter 17 (Micropropagation) 1393-94 University of Guilan- Rasht ([email protected]) 7 ولاکوتا زا هدافتسا

Plant Propagation- Chapter 17

(Micropropagation)

1393-94

University of Guilan- Rasht

([email protected]) 1

Plant Propagation-

Chapter 17

1

ازدیاد نباتات (فصل هفدهم)

ریزازدیادی و کشت بافتهای گیاهی (آزمایشگاهیانواع کشت بافت و تجهیزات مقدمه، )

دانشگاه گیالن دانشکده علوم کشاورزی

زکی زاده 1393-94سال تحصیلی

Plant Propagation-

Chapter 17

2

تعریف کشت بافت به کشت مواد گیاهی عاری از میکروب اعم از بذر، جنین، بافت، سلول و پرتوپالست

کشت گیاهان عالی در محیط ضدعفونی شده درون ظروف استریل مانند لوله آزمایش، . گفته می شوددرون شیشه ای گیاهی

به نژادی گیاهی، تولید فراورده گیاه افزاییاز کشت درون شیشه ای گیاهی به منظور ،های بیوشیمیایی، بیماری شناسی گیاهی، نگهداری و انبار کردن بافت های گیاهی،

.پژوهش های علمی و غیره استفاده می شود

و مزایای ریزازدیادی یکی از جنبه های تجاری استفاده از کشت درون شیشه ای است . زیادی نسبت به روش های متداول ازدیاد رویشی دارد

هدف ریزازدیادی تولید انبوه گیاهچه های همسان از نظر ژنتیکی با رشد و نمو طبیعی، در . کمترین زمان و با کمترین هزینه است

هم اکنون کاربرد ریزازدیادی در باغبانی، کشاورزی و جنگلدارای در حال گسترش . است


(Micropropagation)

1393-94



Plant Propagation-

Chapter 17

3

ایانواع کشت درون شیشه

هر گیاه شامل اندامهای متفاوت و هر اندام شامل تعدادی بافت است و بافتها نیز از . سلولهای اختصاصی به وجود آمده اند

. حذف دیواره این سلولها توسط آنزیم، منتج به تولید پروتوپالست می شود ◄

با توجه به مطالب ذکر شده و وجود مواد ساختمانی متفاوت، انواع مختلفی از کشت : درون شیشه ای به صورت زیر وجود دارد

کشت بذر یا گیاه کامل(Seed culture )

کشت جنین(Embryo culture )

کشت اندام گیاهی(Organ culture )

کشت کالوس(Callus culture )

کشت سلول(Cell culture )

کشت پروتوپالست (Protoplast

culture )

Plant Propagation-

Chapter 17

4

(فصل چهارم کتاب)انواع کشت درون شیشه ای

شامل کشت بذر در شرایط درون شیشه ای است که یک گیاهچه و :کشت گیاه کامل . نهایتا یک گیاه کامل ایجاد می کند

این روش . پس از حذف پوسته بذر، جنین را جدا کرده و کشت می کنیم :کشت جنین . استفاده می شود( Embryo rescue)در مواردی مانند نجات جنین

در این روش اندامهای مختلف گیاهی جدا شده و کشت می شود :کشت اندام گیاهی .، کشت (Meristem culture)بنابراین انواع مختلفی از کشت داریم مانند کشت مریستم

Leaf)، کشت برگ (Root culture)، کشت ریشه (Shoot tip culture)نوک ساقه

culture) کشت پرچم ،(Anther culture )و غیره .

وقتی یک بافت تمایز یافته مانند برگ یک گیاه را در محیط درون :کشت کالوسمی کند که این کالوس را ( پینه)شیشه ای کشت کنیم، تولید توده تمایز نیافته یا کالوس

. می توان دوباره کشت نمود


(Micropropagation)

1393-94



Plant Propagation-

Chapter 17

5

گفته می شود( معموال مایع)به کشت سلولهای منفرد در محیط کشت :کشت سلول .سلولهای منفرد معموال به کمک آنزیمها از یک بافت گیاهی، کالوس یا سوسپانسیون

. سلولی به دست می آیند

مثل )پروتوپالست در اثر هضم دیواره سلول توسط آنزیمها :کشت پروتوپالست . به وجود می آید و می تواند در محیط درون شیشه ای کشت گردد( پکتیناز و سلوالز

تقسیم بندی دیگری نیز در مورد انواع کشت درون شیشه ای وجود دارد و آن را به : کشت سازمان یافته، کشت سازمان نیافته و حد واسط آن دو تقسیم می کند

شبیه تکثیر رویشی از طریق قلمه، . کشت جنین، بذر و یا اندامها :کشت سازمان یافته . است و معموال نتاج حاصل مشابه گیاه مادری خواهد بود... ساقه رونده و

استفاده از کالوس به صورت دستجاتی از سلولها یا سلولهای :کشت سازمان نیافته . در این روش ثبات ژنتیکی غالبا پایین است(. کشت سوسپانسیون سلولی)منفرد

Plant Propagation-

Chapter 17

6

آزمایشگاهیتجهیزات

تجهیزات و وسایل الزم برای تأسیس یک آزمایشگاه تخصصی کشت بافت به شرح زیر. البته برای کار در مقیاس کوچکتر می توان وسایل ساده تری مورد استفاده قرار داد. است

. مثال می توان به جای استفاده از ماشین ظرفشویی، ظروف مورد استفاده را با دست شست

بطور کلی یک آزمایشگاه کشت بافت قسمتهای زیر را دارد:

انبار برای نگهداری تمام وسایل و مواد

آزمایشگاه یا اتاق تهیه محیط کشت

اتاق توزیع محیط کشت و کشت نمونه گیاهی(Culture room )

اتاق رشد(Growth room ) یا اتاقک رشد(Growth chamber )

اتاق تکنسین ها -... اتاق ترازوها، یخچال، فریزر و -اتاق ظرفشویی و اتوکالو

(برای سازگاری و رشد بعدی گیاهان تکثیر شده)گلخانه


(Micropropagation)

1393-94



Plant Propagation-

Chapter 17

7

اتاق تهیه محیط کشت

برای تهیه محیط کشت به وسایل و مواد مختلفی نیاز است :

بشر، ارلن، مزور یا استوانه مدرج، بطری های )انواع ظروف شیشه ای در سایزهای مختلف ...( در پیچ دار یا در آبی،

(بشر، مزور، ارلن، )انواع ظروف پالستیکی در سایزهای مختلف...

همزن با گرمکن(Heater- Stirrer ) (با طولهای مختلف)همراه با انواع مگنت

( یک رقم تا چهار رقم اعشار( )گرم ۰/۰۰۰۱گرم تا ۰/۱از )انواع ترازوی حساس

دستگاه تولید آب مقطر(Distilled water ) یا تولید آب دیونیزه(Deionized water )

پی اچ متر(pH- meter) اتوکالو ،(Autoclave) اجاق مایکروویو و ، ...

محلولهای پایه نمکهای مختلف، ویتامینها، آهن و تنظیم کننده های )انواع مواد شیمیایی ...( رشد، ساکارز، مواد منعقد کننده محیط کشت مثل آگار و ژل رایت و

(Screw- cap bottles)بطری های در پیچ دار

به بطری های درپیچ دار، بطری های در آبی یا در قرمز نیز گفته می شود، گرچه ◄میلی لیتری 5۰این بطری ها در سایزهای مختلف، از . انواعی از آنها در سبز رنگ دارند . تا دو لیتری یا بیشتر، وجود دارند

Plant Propagation-

Chapter 17

8


(Micropropagation)

1393-94



(Autoclave) اتوکالو

آب، محیط کشت، ظروف شیشه ای، پنس، اسکالپل، : اتوکالو ظرفی است که در آن . ، استریل می گردندبه وسیله بخار آب تحت فشارکاغذ صافی و غیره

با قرار دادن اشیاء یا مواد در معرض بخار تحت فشار، کلیه میکروارگانیزمها از بین میدقیقه در دمای ۲۰میلی لیتر به مدت 5۰محیط کشت با حجم بیشتر از : برای مثال. روند . درجه سانتیگراد در محیط اشباع از بخار آب قرار می گیرد ۱۲۱

کارکردن با . اتوکالو در انواع افقی و عمودی و در اندازه های مختلف وجود دارد . انواع افقی آسانتر است، ولی معموال قیمت باالتری دارند

درجه سانتیگراد قابل تنظیم است ۱۳5تا ۱۱5درجه حرارت اتوکالو بین .

استریل کردن صحیح بستگی به زمان، فشار، درجه حرارت و حجم ماده ای دارد که . قرار است اتوکالو شود

Plant Propagation-

Chapter 17

9

الووک

اتار

کوه

نح

Plant Propagation-

Chapter 17

10


(Micropropagation)

1393-94



Plant Propagation-

Chapter 17

11

اتوکالو عمودی

اتوکالو افقی رومیزی

انواع اتوکالو

Plant Propagation-

Chapter 17

12

انواع اتوکالو در مدلها و سایزهای مختلف


(Micropropagation)

1393-94



دستورالعملهای الزم در هنگام استفاده از اتوکالو

محلول غذایی، به میلی لیتر 5۰تا ۲۰حاوی قرار دادن لوله های آزمایش و فالسکهای . درجه سانتیگراد ۱۲۱در دمای دقیقه ۲۰مدت

در دقیقه ۲5محلول غذایی، به مدت میلی لیتر 5۰۰تا 5۰حاوی قرار دادن فالسکهای . درجه سانتیگراد ۱۲۱دمای

در دقیقه ۳5محلول غذایی، به مدت میلی لیتر 5۰۰۰تا 5۰۰حاوی قرار دادن فالسکهای . درجه سانتیگراد ۱۲۱دمای

دقیقه در ۳۰قرار دادن لوله های آزمایش خالی، فالسکها و فیلترهای کاغذی، به مدتاین وسایل را می توان به صورت خشک نیز در آون و در )درجه سانتیگراد ۱۳۰دمای (. درجه سانتیگراد استریل کرد ۱6۰دمای

به طور کلی، نفوذ حرارت در اتوکالو بسیار مهم است و موادی که حجم بیشتری . دارند، باید مدت زمان بیشتری داخل اتوکالو بمانند

Plant Propagation-

Chapter 17

13

نکات الزم در هنگام استفاده از اتوکالو

،پس از اتوکالو کردنpH کاهش می یابد ۰/5تا ۰/۳محیط کشت بین .

قندها می شود که ( کاراملیزه شدن)اتوکالو کردن در دماهای باال باعث قهوه ای شدن . ممکن است اثر سمی داشته باشند

اتوکالو کردن برای مدت زمان طوالنی، باعث ته نشین شدن نمکها و تجزیه آگار می . شود

از بین می روند( مثل اترل و اتیلن)در اثر استفاده از اتوکالو، مواد فرار .

استفاده شود ( مانند آب مقطر یا آب دیونیزه)بهتر است برای اتوکالو از آب بدون نمکالبته گاهی توصیه می شود از مخلوط آب شیر و . تا نمک در کف اتوکالو رسوب نکند

. آب مقطر استفاده شود

Plant Propagation-

Chapter 17

14


(Micropropagation)

1393-94



مزایا و معایب استفاده از اتوکالو

مزایا : سرعت ☺

آسانی ☺

از بین بردن ویروسها ☺

عدم جذب مواد ☺

در استریل کردن با فیلتر، : نکته ◄ . برخی مواد جذب فیلتر می شوند

Plant Propagation-

Chapter 17

15

معایب : تغییرpH ( واحد ۰/5تا ۰/۳کاهش )

( اسالید بعدی)تجزیه مواد شیمیایی

انجام واکنشهای شیمیایی که می توانندفعالیت اجزای تشکیل دهنده محیط کشت را

. کاهش دهند

به این دلیل گاهی برخی محیط کشتها را ◄توسط فیلتر استریل می کنند، مانند محیط

. کشت پروتوپالست

موادی که در اثر اتوکالو کردن تجزیه می شوند: گاهی نیز تولید لوولوز می کند. به گلوکز و فروکتوز تجزیه می شود: ساکارز .

کلشی سین

برخی هورمونها و تنظیم کننده های رشد :

، جیبرلیک اسید (TDZ)زآتین، تیدیازورون : مانند ◄ ویتامین ث، پانتوتنیک اسید ۱۲، ویتامین ب ۱ویتامین ب ،

( مانند سفوتاکسیم، ونکومایسین، کانامایسین، جنتامایسین، ریفامپیسین و )آنتی بیوتیکها...

(مانند شیره نارگیل و پودر موز)شیره های گیاهی

آنزیمها

توسط ( مانند تنظیم کننده های رشد و آنتی بیوتیکها)برخی از مواد ذکر شده : توجه ◄ . نگهداری می شوند( -۱۸)فیلترهای سرسرنگی استریل شده و در فریزر

Plant Propagation-

Chapter 17

16


(Micropropagation)

1393-94



(Autoclave tape)چسب اتوکالو

روی . برای اطمینان از صحت عمل استریل کردن اتوکالو، از چسب اتوکالو استفاده می شود. این چسب نوارهای سفیدی وجود دارد که پس از اتوکالو شدن به رنگ سیاه در می آیند

معموال قطعه ای از این چسب را روی بطری حاوی محیط کشت و یا پالستیک حاوی ابزار در این صورت حتی در صورت . کار که قرار است داخل اتوکالو قرار بگیرد، می چسبانند

.عدم حضور در کنار اتوکالو نیز از اتوکالو شدن وسایل و محیط کشت مطمئن خواهیم بود شاخص های دیگری نیز برای اطمینان از صحت عمل اتوکالو وجود دارند که عملکرد

(. توضیحات بیشتر در کالس عملی)مشابهی دارند

Plant Propagation-

Chapter 17

17

دیگر روشهای استریل کردن مواد یا وسایل

استریل کردن با تابش : استفاده می شود و معموال برای ظروف، جعبه ها و لوله های اشعه گاما در این روش از ◄

وجود ندارد، بکار می ( به دلیل ذوب شدن)پالستیکی که امکان استریل کردنشان با اتوکالو . رود

. پتری دیش های پالستیکی و سرنگها با این روش استریل می شوند ◄ . و برای استریل کردن محیط کشت استفاده نمی شودهزینه بسیار باالیی دارد این روش ◄

استریل کردن با آون :

ساعت ۳تا ۲درجه سانتیگراد به مدت ۱6۰برای استریل کردن خشک از آون با دمای ◄ . استفاده می شود

این روش برای لوله های آزمایش، فالسکها و پتری دیش های خالی شیشه ای، کاغذ و ابزار ◄ . کار استفاده می گردد

Plant Propagation-

Chapter 17

18


(Micropropagation)

1393-94



دیگر روشهای استریل کردن مواد یا وسایل

استریل کردن با فیلتر : . استفاده می شود( میکرون ۰/۲۲با قطر منافذ حدود )در این روش از فیلترهای سرسرنگی ◄این روش برای استریل کردن تنظیم کننده های رشد حساس به گرما، آنتی بیوتیکها، کلشی ◄

.سین و گاهی اوقات ویتامینها بکار می رود . مهمترین مزیت این روش استریل کردن مواد حساس به گرما است ◄معایب این روش شامل جذب مواد توسط فیلتر، عبور احتمالی برخی ویروسها، وقت گیر بودن ◄

. و آسان نبودن این روش در مقایسه با اتوکالو است . روش کار در کالس عملی توضیح داده خواهد شد ◄

استریل کردن با اتانول :

درصد ۹6برای استریل کردن سطوح میز کار، سطوح المینار، دستها و برخی وسایل از اتانول ◄همچنین اتانول برای حل (. توضیحات بیشتر در کالس عملی)درصد استفاده می شود ۷5یا

. کردن برخی تنظیم کننده های رشد بکار میرود و پس از حل شدن نیازی به فیلتر کردن ندارند

Plant Propagation-

Chapter 17

19

Plant Propagation-

Chapter 17

20

اتاق توزیع محیط کشت و کشت نمونه گیاهی

مهمترین دستگاه موجود در اتاق کشت، هود استریل یا المینار می باشد .

از المینار برای توزیع محیط کشت، گندزدایی و کشت و واکشت نمونه های گیاهی و . نیز استریل کردن مواد با فیلتر استفاده می شود

برای کاهش آلودگی اطراف المینار معموال آن را داخل اتاق تمیز و جداگانه ای قرار . معروف است( Culture room)می دهند که این اتاق به اتاق کشت

بسته به اندازه اتاق و نیز بزرگی آزمایشگاه کشت بافت، می توان چندین المینار را . داخل آن قرار داد


(Micropropagation)

1393-94



Plant Propagation-

Chapter 17

21

(Laminar air flow cabinet) هود استریل یا المینار

هود استریل که بیشتر به آن المینار گفته می شود، محفظه ای است که هوای مکیده شده ازبه این فیلترها . محیط خارج قبل از ورود به آن، با عبور از فیلترهای بسیار ریز تصفیه می شود

. گفته می شود( HEPA)فیلتر هپا HEPA: High Efficiency Particulate Air

میکرون را نمی دهد ۰/۳این فیلتر اجازه عبور به ذرات بزرگتر از .

جریان هوا در داخل المینار به صورت الیه ای است و به همین دلیل المینار نامیده می شود . . و بنابراین ذرات آلودگی نمی توانند از جلو وارد المینار شوندفشار زیر المینار مثبت است

المینار باید ساالنه توسط کارخانه سازنده بازدید و سرویس شود و فیلتر آن در صورت . آلودگی تعویض گردد

هود استریل را نباید با هود شیمیایی اشتباه گرفت .

Plant Propagation-

Chapter 17

22

انواع المینار

منظور از افقی و عمودی بودن المینار حرکت . المینار در انواع افقی و عمودی وجود دارددر انواع افقی فیلتر روبروی فردی که جلوی . جریان هوای خارج شده از فیلتر هپا است

در انواع عمودی . المینار نشسته است قرار می گیرد و بنابراین جریان هوا به سمت فرد است . جریان هوا از باال به سمت پایین است و بنابراین به صورت فرد برخورد نمی کند

نوع افقی آن برای کشت بافت و نوع عمودی هم برای کشت بافت و هم کار با باکتریها و .المینار عمودی را هود میکروبیولوژی نیز می نامندبه همین دلیل . قارچها استفاده می شود

برای انتقال ژن با اگروباکتریوم نیز باید از المینار عمودی استفاده کنیم تا آلودگی های . احتمالی وارد ریه فرد نشود

داخل هر المینار یک المپ فلورسنت برای روشنایی، یک المپUV برای استریل کردن . وجود دارد... و یک پریز برای استریالیزر، ترازو و

در برخی انواع نیز شیشه جلو . در بعضی انواع المینار، سرعت فن کم و زیاد می شود . المینارهای افقی معموال شیشه جلو ندارند. المینار با موتور باال و پایین می رود


(Micropropagation)

1393-94



Plant Propagation-

Chapter 17

23

انواع المینار (افقی و عمودی)

Plant Propagation-

Chapter 17

24

اتاق کشت با چهار المینار افقی و عمودی


(Micropropagation)

1393-94



روش کار زیر المینار

دقیقه قبل از آغاز کار روشن کنیم تا هوای آلوده زیر آن با ۲۰تا ۱5المینار را باید حدود . هوای استریل خارج شده از فیلتر هپا جایگزین گردد

می توان حدود یک ساعت قبل از روشن نمودن المینار، المپUV المینار را روشن نمودروشن است، UVدر بسیاری از المینارها زمانیکه المپ . تا آلودگی ها را تا حدی از بین ببرد

قادر به روشن نمودن خود المینار نیستیم، ولی متاسفانه در برخی المینارها کلیدهای المپ UV بنابراین باید مراقب . و خود المینار جدا هستند و می توان هر دو را با هم روشن نمود

. آن روشن نباشد تا آسیبی به شما نرسد UVباشید تا در هنگام کار زیر المینار المپ

درصد استریل می ۷5بعد از روشن نمودن المینار و قبل از آغاز کار، زیر المینار را با اتانول ۹6درصد، ماندگاری بیشتر و تبخیر دیرتر آن نسبت به اتانول ۷5دلیل استفاده از اتانول . کنیم

. درصد استریل می کنیم ۷5دستها را نیز با اتانول . درصد است

را می توان با چراغ الکلی، چراغ گاز بنسن و یا استریالیزر با ( پنس و اسکالپل)ابزار کار (. توضیحات بیشتر در این زمینه در کالس عملی)گلوله های شیشه ای استریل نمود

Plant Propagation-

Chapter 17

25

Plant Propagation-

Chapter 17

26

( Glass bead sterilizer) استریالیزر با گلوله های شیشه ای

تیغ )این نوع استریالیزر برای استریل کردن پنس و اسکالپلدمای استریالیزر قابل تنظیم . بکار می رود( یا چاقوی جراحی

. درجه باال می رود ۳۰۰بوده و تا حدود دقیقه قبل از آغاز کار و معموال ۲۰استریالیزر را حدود

زمانیکه . همراه با روشن کردن المینار روشن می کنیماستریالیزر به دمای مورد نظر رسید، می توان با قرار دادن

ثانیه تا یک دقیقه درون گلوله های ۳۰ابزار کار به مدت . شیشه ای، آنها را استریل نمود

برای کاهش حرارت ابزار کار می توان آنها را پس از . درصد فرو برد ۹6خارج کردن از استریالیزر، درون اتانول

استفاده از استریالیزر مشکالت استفاده از چراغ الکلی و . چراغ گاز بنسن را ندارد، ولی قیمت آن بسیار باالست


(Micropropagation)

1393-94



Plant Propagation-

Chapter 17

27

(Fume hood) هود شیمیایی

هود استریل یا المینار را نباید با هود شیمیایی اشتباه گرفت .

محفظه هود شیمیایی استریل نیست و فن موجود در باالی هود شیمیایی هوا را از پایین بهبنابراین فشار داخل محفظه هود شمیایی (. مانند هود آشپزخانه)سمت باال هدایت می کند

. بر خالف المینار که فشار مثبت دارد، منفی است

از هود شیمیایی برای کار با اسیدها، مواد سمی و فرار و مواد بدبو استفاده می گردد . ... مانند فنول، متانول، مرکاپتواتانول و ◄

Plant Propagation-

Chapter 17

28

روش صحیح کار زیر هود شیمیایی

پانزده سانتیمتر از جلوی هود فاصله داشته باشد تا حداقلظرف حاوی ماده شیمیایی باید . بخارات سمی متصاعد شده از آن به سمت فرد نیاید

Documents

کشت بافت گیاهی پیشرفته...Plant Propagation- Chapter 17 (Micropropagation) 1393-94 University of Guilan- Rasht ([email protected]) 7 ولاکوتا زا هدافتسا